大孔樹脂柱層析法提取蛹蟲草廢棄培養(yǎng)基中的蟲草素

曾 昱,陳作紅

(湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，中國 長沙 410081)

蛹蟲草[Cordycepsmilitaris(L.) Link] 又名北冬蟲夏草、北蟲草，含有多種活性化合物，如蟲草素、麥角固醇、甘露醇等，因其容易栽培已成為冬蟲夏草的替代品[1-2]．蟲草素(cordycepin)是蛹蟲草的主要活性成分，具有抗腫瘤、抗病毒、抗真菌、免疫調(diào)節(jié)等藥理作用[3-4]．目前，蟲草素主要從蛹蟲草子實(shí)體中提取，從而導(dǎo)致蟲草素的生產(chǎn)成本極高[5]．栽培過蛹蟲草的固體培養(yǎng)基中含有豐富的菌絲體，其中含有大量的活性物質(zhì)，但這些固體培養(yǎng)基常作為廢料處理，造成很大的浪費(fèi)[6-7]．

目前，大多數(shù)研究采用熱水浸提法[8]、索氏提取法[9]、超臨界萃取法[10]以及超聲波水提法[11]等提取蟲草素，但從這些方法得到的蟲草素純度不高，或者投入成本大，難以取得理想結(jié)果．劉紅錦[12]等對大孔樹脂分離純化蛹蟲草中蟲草素的工藝進(jìn)行了研究，考查了7種大孔吸附樹脂對蛹蟲草中蟲草素吸附純化的效果，再以高效液相色譜 (HPLC)法測定樣液中蟲草素含量，篩選出適宜的樹脂．Ni He[13]等采用一種新的柱層析提取方法——循環(huán)柱層析提取法(CCE提取法)，對蛹蟲草固體培養(yǎng)基中的蟲草素進(jìn)行提取，進(jìn)一步分離純化這些提取物，得到了純度為98%以上的蟲草素晶體．

本文以蛹蟲草廢棄固體培養(yǎng)基為原料，利用熱水浸提法和大孔樹脂柱層析法分離蟲草素，再用聚酰胺樹脂進(jìn)行精制，并優(yōu)化提取步驟，為后續(xù)的擴(kuò)大試驗(yàn)和規(guī)模生產(chǎn)提供參考依據(jù)．

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

蟲草素標(biāo)樣購自Sigma公司，蛹蟲草廢棄固體培養(yǎng)基由湖南益康生物高科技有限公司提供．

乙醇(分析級)；甲醇(色譜級)；超純水；大孔樹脂XAD16，XAD4，XAD7HP，XAD1180(北京慧德易科技有限公司)， DM130(青島利航樹脂材料有限公司)；聚酰胺樹脂(浙江臺州路橋四甲生化塑料廠)．

Waters 600高效液相色譜儀(Waters公司)；YWG C18(4.0 mm×300 mm，10 μm)色譜柱(大連依利特有限公司)．

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱：YWGC18；流速：1 mL/min；檢測波長：254 nm；進(jìn)樣量：20 μL；柱溫：25 ℃；流動相：15%甲醇；洗脫時(shí)間：20 min．所有的樣品在進(jìn)樣之前須過0.45 μm濾膜．

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 取蟲草素母液(1 g/L)適量，將其分別配制成0.005，0.025，0.05，0.1，0.25，0.5 g/L共6個(gè)梯度，在上述的色譜條件下進(jìn)樣20 μL，以進(jìn)樣量X(μg)與峰面積Y建立線性回歸方程．

1.2.3 熱水浸提粗提蟲草素 采用熱水浸提法對蛹蟲草廢棄固體培養(yǎng)基中的蟲草素進(jìn)行粗提．料液比(W/V)，浸提時(shí)間和浸提溫度是影響蟲草素提取的重要因素，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了一個(gè)3因素3水平的正交試驗(yàn)，如表1所示．

1.2.4 大孔樹脂柱層析分離純化蟲草素 選用XAD4，XAD16，XAD7HP，XAD1180和DM130 共5種樹脂進(jìn)行靜態(tài)吸附和解吸附實(shí)驗(yàn)，再對篩選出來的樹脂進(jìn)行動態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)，確定最佳洗脫pH值和洗脫劑．

(1)大孔樹脂的靜態(tài)吸附和解吸附 取5 g已預(yù)處理的大孔樹脂，置于錐形瓶中，分別加入pH3.0，6.0，9.0，12.0的培養(yǎng)基浸提液50 mL，靜態(tài)吸附24 h，期間定時(shí)振蕩．HPLC檢測濾液中蟲草素質(zhì)量濃度．將上述處理的大孔樹脂置于錐形瓶中，分別加入對應(yīng)pH的40%乙醇30 mL，靜態(tài)解吸附24 h，期間定時(shí)振蕩．HPLC檢測濾液中蟲草素質(zhì)量濃度．綜合靜態(tài)吸附和解吸附能力，篩選出最合適的大孔樹脂．

(2)大孔樹脂的動態(tài)吸附 取適量預(yù)處理后的大孔樹脂裝入層析柱中，調(diào)節(jié)pH為3.0，6.0，9.0，12.0，浸提液上樣前調(diào)至相同的pH，用對應(yīng)pH的蒸餾水洗脫，再用50 mL對應(yīng)pH的30%，40%，50%，60%的乙醇溶液(均為體積分?jǐn)?shù)，下同)洗脫，收集乙醇洗脫液，定容至50 mL，HPLC檢測洗脫液中蟲草素質(zhì)量濃度，由此得到最佳的洗脫液濃度和洗脫pH值．

1.2.5 蟲草素的分離 將預(yù)處理后的大孔樹脂裝入層析柱，調(diào)至最佳pH，浸提液上樣前調(diào)至最佳pH．待吸附至層析柱2/3處時(shí)停止上樣；用4～5倍柱床體積的蒸餾水洗脫，再用乙醇溶液洗脫，分級收集洗脫液．

活化GF254硅膠板，用蟲草素標(biāo)樣與洗脫液點(diǎn)板，在展開劑為V氯仿∶V甲醇=2∶1(每10 mL加2滴氨水)的體系中展開，置于254 nm紫外燈下顯色，合并含蟲草素的洗脫液．

濃縮洗脫液，加入4倍體積的無水乙醇，充分反應(yīng)后除去沉淀，濃縮置于4 ℃冰箱中數(shù)日，直至析出晶體．用蒸餾水重結(jié)晶多次，直至晶體變?yōu)榧儼祝?/p>

1.2.6 蟲草素的精制 將預(yù)處理后的聚酰胺樹脂裝入層析柱，用蒸餾水溶解蟲草素晶體，上樣，用2～3倍柱床體積的蒸餾水洗脫，收集洗脫液，濃縮后置于冷凍干燥機(jī)內(nèi)干燥，-20 ℃冰箱內(nèi)保存．

2 結(jié)果與討論

2.1 回歸線性方程

蟲草素的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=3 312 350.30x+243 414.61(R2=1.00)，線性范圍為0.1～10 μg，在此范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好．在選定的色譜條件下，蟲草素的出峰時(shí)間為18 min左右．

2.2 優(yōu)化的熱水浸提條件

作者設(shè)計(jì)了一個(gè)3因素3水平正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化熱水浸提條件，結(jié)果如表1所示．

表1 正交試驗(yàn)結(jié)果

各因素不同試驗(yàn)水平對蟲草素質(zhì)量濃度的影響如表2所示.

表2 各因素不同試驗(yàn)水平對蟲草素提取的影響

根據(jù)蟲草素的質(zhì)量濃度，作者選出了浸提實(shí)驗(yàn)的最佳條件組合，即浸提溫度70 ℃，浸提時(shí)間8 h，料液比1 g∶20 mL．

2.3 蟲草素的分離

根據(jù)5種大孔樹脂對蟲草素的吸附和解吸附能力對其進(jìn)行了篩選，結(jié)果如圖1及圖2所示，可以看出, XAD16吸附后濾液中蟲草素質(zhì)量濃度最低, 解吸附后濾液中蟲草素質(zhì)量濃度最高,因此XAD16對蟲草素靜態(tài)吸附能力和解吸附能力最好．不同pH條件下各樹脂的吸附和解吸附效果不同, 對于XAD16, pH為9和12時(shí)效果最好．

圖1 大孔樹脂對蟲草素的吸附能力Fig.1 Adsorption of cordycepin on different macroporous resins

圖2 大孔樹脂對蟲草素的解吸附能力Fig.2 Desorption of cordycepin on different macroporous resins

應(yīng)用XAD16進(jìn)行動態(tài)洗脫時(shí)，不同濃度的乙醇在不同pH下的洗脫效果如圖3．可以看出，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%和60%，pH為9.0和12.0時(shí)，洗脫效果最明顯．

綜合以上的結(jié)果，作者最終選擇XAD16樹脂作為填料，50%乙醇作為洗脫劑，pH為9.0的柱層析體系對蟲草素進(jìn)行分離．

2.4 蟲草素晶體的HPLC檢測

按照優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件對蟲草素進(jìn)行提取和純化，得到了純白色晶體產(chǎn)物．HPLC檢測蟲草素水溶液，純度達(dá)到了98%以上，見圖4．

圖3 XAD16動態(tài)實(shí)驗(yàn)Fig.3 Elution of cordycepin by XAD16 macroporous resin

圖4 晶體的HPLC分析Fig.4 HPLC analysis of cordycepin crystal

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以廢棄的蛹蟲草固體培養(yǎng)基為提取材料，利用優(yōu)化的熱水浸提法，即料液比為1 g∶20 mL，溫度70 ℃，浸提時(shí)間8 h，對蟲草素進(jìn)行粗提；然后在填料為XAD16樹脂，pH9.0，洗脫劑為50%乙醇的層析柱體系中對其分離；再通過濃縮、結(jié)晶等步驟，得到了白色晶體；最后通過聚酰胺樹脂精制，除去晶體中的殘余色素后，得到的蟲草素純度達(dá)到了98%以上．本實(shí)驗(yàn)操作簡單，不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備．下一步將進(jìn)行擴(kuò)大實(shí)驗(yàn)，較大規(guī)模地從廢棄的蛹蟲草固體培養(yǎng)基中提取蟲草素，并進(jìn)一步確定提取和純化工藝參數(shù)．

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