木聚糖酶及其在食品工業(yè)中的應用*

閔兆升，郭會明，顧承真，洪厚勝，3

1(南京工業(yè)大學理學院，江蘇南京，210009)2(南京工業(yè)大學生物與制藥工程學院，江蘇 南京，210009)3(南京匯科生物工程設備有限公司，江蘇南京，210009)

半纖維素是植物組織中含量僅次于纖維素的一種極其豐富的可再生資源，約占植物干重的三分之一左右。與纖維素相比，半纖維素更容易被微生物降解利用。其中木聚糖為半纖維素的重要組成成分，是一種復雜的多聚五碳糖。木聚糖的分子結(jié)構(gòu)變化范圍比較大，這是由于木聚糖是由β-1，4-糖苷鍵與β-D-吡喃型木糖單元相連接構(gòu)成主鏈，當其分支程度不同以及糖不同(戊糖和己糖)時，主鏈或側(cè)鏈上就會帶有多種不同的取代基，如圖1所示［1］。因此，木聚糖的徹底降解需要多種酶的參與，其中最主要的就是我們通常所說的木聚糖酶(Xylanase，EC.3.2.1.8)，其特指的是內(nèi)切β-1，4-D-木聚糖酶。

圖1 連接不同側(cè)鏈的木聚糖結(jié)構(gòu)Fig.1 Xylan structure with different side chains attached

木聚糖酶(Xylanase，EC.3.2.1.8)廣泛存在于自然界中，其主要來源為微生物，包括細菌、放線菌及真菌等。木聚糖酶通過隨機的方式作用于木聚糖的主鏈，使其降解為低聚木糖和少量的木糖、阿拉伯糖。其在飼料以及造紙領(lǐng)域有著廣泛的應用。在飼料業(yè)，木聚糖酶可作為飼用酶制劑，有效解除木聚糖的抗營養(yǎng)作用，促進畜禽對粗飼料的消化吸收;在造紙業(yè)，木聚糖酶可作為新型紙漿漂白助劑，解決傳統(tǒng)的漂白工藝所帶來的環(huán)境污染問題。另外，木聚糖酶還可以通過水解植物中的半纖維素，形成戊糖，進一步用于生產(chǎn)木糖醇、酒精、有機酸等產(chǎn)品，在可再生資源生物轉(zhuǎn)化利用中也具有重要作用［2－3］。正是由于木聚糖酶所展現(xiàn)出的顯著的研究價值和工業(yè)應用前景，使得越來越多的科研機構(gòu)和人員投身于木聚糖酶的開發(fā)和研究工作。并且隨著基因工程、蛋白質(zhì)工程等高新生物技術(shù)的發(fā)展，關(guān)于木聚糖酶的基因克隆、表達和重組的報道也越來越多［4］。下面主要介紹一下木聚糖酶的特性、發(fā)酵生產(chǎn)及在食品工業(yè)中的應用。

1 木聚糖酶

廣義的木聚糖酶是指能夠降解半纖維素木聚糖的一組酶的總稱，包括多種內(nèi)切酶和外切酶。但通常所說的木聚糖酶僅限于β-1，4-D-木聚糖酶，其主要負責木聚糖主鏈骨架的降解，是木聚糖降解酶系中最關(guān)鍵的酶，也是當前木聚糖酶研究的熱點。

1.1 木聚糖酶的結(jié)構(gòu)與分類

木聚糖酶的結(jié)構(gòu)比較復雜，有只含有單一區(qū)域即催化區(qū)的木聚糖酶，也有含有催化區(qū)和多種非催化區(qū)的木聚糖酶。其中，多區(qū)域木聚糖酶的分子結(jié)構(gòu)中含有催化結(jié)構(gòu)域(catalytic domain，CD)、纖維素結(jié)構(gòu)域(cellulose binding domain，CBD)、木聚糖結(jié)構(gòu)域(xylan-binding domain，XBD)、熱穩(wěn)定結(jié)構(gòu)域、連接序列、重復序列和其他未知功能的非催化結(jié)構(gòu)域。木聚糖酶催化區(qū)(CD)是酶催化水解的主要區(qū)域，并且可作為該酶的分類基礎(chǔ)。不同來源的木聚糖酶，其氨基酸組成的數(shù)目和種類相差很大，但它們在催化區(qū)的大小都趨于一致。木聚糖酶的催化活性位點氨基酸與纖維素酶相似，主要為色氨酸和羧基氨基酸，有的還有半胱氨酸［5］。

以糖苷水解酶的催化結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列相似性和疏水簇分析法為基礎(chǔ)，Hemnissat和Bairoch將糖基糖苷鍵水解酶中的內(nèi)切木聚糖酶分為10(F)族和11(G)族，它們在催化特性、分子量、凈電荷、酸堿性等方面均有比較大的差異。一般來說，F(xiàn)家族主要包括酸性的高分子量(＞30 kDa)的內(nèi)切木聚糖酶，而G家族則包含有略呈堿性的低分子量(＜30 kDa)的內(nèi)切木聚糖酶，且G家族的木聚糖酶對木聚糖具有很高的特異性。另外，屬于同一家族的木聚糖酶催化區(qū)域具有同源性，因此可以根據(jù)同族的酶來推斷未知酶的催化特性［6］。

1.2 木聚糖酶的理化性質(zhì)

由于木聚糖酶結(jié)構(gòu)的復雜性和來源的廣泛性，使得微生物木聚糖酶具有多樣性。同時，不同基因的產(chǎn)物，微生物所分泌蛋白酶的水解作用，以及糖基化和酰胺化等不同程度的化學修飾作用，都是造成微生物木聚糖酶多樣性的原因。正是木聚糖酶的這種多樣性，使得不同來源的木聚糖酶的組成和性質(zhì)也不盡相同，因此關(guān)于木聚糖酶的理化性質(zhì)研究更多的是集中于細菌和真菌產(chǎn)的木聚糖酶，主要性質(zhì)有以下幾點:①分子質(zhì)量:多數(shù)木聚糖酶是單亞基蛋白，分子質(zhì)量在8～45 kDa;②耐酸堿性:細菌所產(chǎn)木聚糖酶可大體分為2類:高分子量的耐酸木聚糖酶及低分子量的耐堿木聚糖酶。但在真菌中卻沒有這種差別，不過，低分子量木聚糖酶的耐堿性卻是共同的。多數(shù)木聚糖酶的最適pH值為4～7，但是通常在pH值為8～10的范圍內(nèi)也能顯示出很好的穩(wěn)定性［6－7］。Taneja等［8］篩選到1株嗜堿真菌Aspergillus niduans.KK-99，該菌產(chǎn)的木聚糖酶的最適pH即為8.0。陳士成等［9］分離到1株短小芽孢桿菌Bacillus pumilus，其木聚糖酶的最適作用pH值為9.0。而楊革等［10］分離到1株細菌，其產(chǎn)生的木聚糖酶在pH 10.0左右才有最大酶活。木聚糖酶的這種寬范圍的耐酸堿性，給木聚糖酶在更寬領(lǐng)域的工業(yè)應用提供了可能;③耐熱性:多數(shù)細菌產(chǎn)的木聚糖酶的最適反應溫度一般在40～60℃之間，真菌產(chǎn)的木聚糖酶的最適反應溫度為50℃左右，反應溫度都較為溫和。一般來說，酶的熱穩(wěn)定性直接影響其應用領(lǐng)域，其耐熱性直接影響其能否工業(yè)化生產(chǎn)。例如飼用木聚糖酶，既要求酶的最適溫度與動物體內(nèi)生理條件相近，又要有一定的熱穩(wěn)定性，以便于制粒干燥和包裝儲運;④等電點(pI):各種來源的木聚糖酶的等電點一般在3～10之間;⑤活性位點氨基酸組成:研究表明構(gòu)成木聚糖酶活性區(qū)域的氨基酸主要包括天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸等。⑥糖類成分:來源于真核生物所產(chǎn)的木聚糖酶通常為糖基化酶，而來源于原核生物如鏈霉菌種、耐堿嗜溫桿菌種等所產(chǎn)的木聚糖酶則為糖蛋白。這些糖類基因可與蛋白質(zhì)共價連接或與木聚糖酶形成能夠解離的復合體。研究表明，正是由于糖基化的作用才使得多糖酶能夠在非常環(huán)境下也能保持較好的穩(wěn)定性［11］。

1.3 木聚糖酶的誘導和調(diào)節(jié)機理

近年來，有研究表明，少數(shù)微生物木聚糖酶能夠在沒有外源誘導物的情況下組成性表達木聚糖酶，但是絕大多數(shù)的木聚糖酶還是誘導性表達酶。因此，除了菌種本身的特性以外，基質(zhì)中的誘導物與酶的連接合成也有著密切的關(guān)聯(lián)。通常來說，木聚糖酶的誘導過程是復雜的，同一誘導物，但是其作用的菌株不同，其產(chǎn)生的效果就可能非常大。對于某一種微生物來說，木糖可以誘導其高效表達木聚糖酶，產(chǎn)生最大的木聚糖酶活性，但對于另外一種微生物就有可能產(chǎn)木聚糖酶的抑制劑［12］。韓曉芳等［13］研究了 1株產(chǎn)木聚糖酶嗜堿芽抱桿菌，研究發(fā)現(xiàn)葡萄糖對產(chǎn)酶無抑制作用，并且木糖對該菌株產(chǎn)酶的誘導效果明顯優(yōu)于木聚糖。目前，關(guān)于木聚糖酶的誘導機制還不是很明確，較為普遍的一種觀點是:低濃度的、小分子的低聚木糖等才能夠?qū)δ揪厶敲傅漠a(chǎn)生具有誘導作用。而木聚糖是一種大分子聚合物，不能直接穿過細胞膜進入細胞中，只有降解為小分子碎片后才能進入細胞內(nèi)，從而進行木聚糖酶的誘導。圖2顯示了微生物細胞誘導產(chǎn)酶的機制。隨著微生物細胞的生長，首先分泌出少量的組成型木聚糖酶，這些組成型木聚糖酶能夠?qū)⒛揪厶墙到獬赡径恰⒛咎呛偷途勰咎?，而這些少量的降解產(chǎn)物能夠先結(jié)合到細胞表面上，進而進入細胞內(nèi)，啟動轉(zhuǎn)錄加強酶的合成。因此，木聚糖酶誘導物的作用實際上就是它能夠與對應的阻遏蛋白相結(jié)合，并且降低阻抑蛋白與操縱基因的結(jié)合力，從而使結(jié)構(gòu)基因能轉(zhuǎn)錄生成對應的mRNA，進而產(chǎn)生對應的酶［12，14－15］。

圖2 木聚糖酶誘導機制Fig.2 The mechanism of induction of xylanase

1.4 木聚糖酶的發(fā)酵生產(chǎn)

由于從自然界中分離得到的野生型產(chǎn)酶菌株，往往產(chǎn)酶能力低下，酶的純度不高，穩(wěn)定性也不夠，在環(huán)境改變的情況下往往會大幅度喪失活性。所以工業(yè)上，木聚糖酶制劑的生產(chǎn)所用菌種幾乎都是來自于通過基因構(gòu)建開發(fā)出來的特殊工程菌。自20世紀80年代以來已有一百多種不同菌株的木聚糖酶基因被克隆并表達在合適的宿主中。其中研究和應用最多的當屬畢赤酵母表達系統(tǒng)。這是因為酵母作為一種最簡單的單細胞真核生物，兼有原核生物和真核生物的某些優(yōu)點:酵母在簡單培養(yǎng)基中便可快速生長，且能夠進行細胞的高密度培養(yǎng)，易操作。另外，與大腸桿菌不同的是，畢赤酵母表達的外源蛋白常伴有糖基化現(xiàn)象，糖基化作用一方面能夠通過影響蛋白質(zhì)的構(gòu)象起到增強木聚糖酶的穩(wěn)定性作用，另一方面，能高效分泌表達外源蛋白，易于提純，無內(nèi)毒素污染，能夠達到飼料、食品與醫(yī)藥行業(yè)應用的安全性要求。此外，酵母菌的規(guī)?；l(fā)酵工藝和下游處理工藝己相當成熟，利于木聚糖酶的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)［16－17］。目前，國內(nèi)生產(chǎn)木聚糖酶的工藝便是基于重組畢赤酵母的高密度發(fā)酵技術(shù)。表1則列出了部分在畢赤酵母中表達的木聚糖酶基因。

表1 在畢赤酵母中表達的木聚糖酶基因Table 1 Expression of xylanase gene in Pichia pastoris

2 木聚糖酶在食品中的應用

2.1 木聚糖酶在面制品中的應用

目前，在食品行業(yè)中，應用木聚糖酶最多的當屬在面包的烘焙過程中將其作為食品改良劑使用。制作面包的小麥面粉中含有少量以阿拉伯木聚糖(arabinoxylan，簡稱AX)為主的戊聚糖，其含量約為2%～3%［24］。根據(jù)阿拉伯木聚糖在水中的溶解性可將其分為:水溶性阿拉伯木聚糖(water-extractablearabinoxylan，簡稱WEAX)和水不溶性阿拉伯木聚糖(water-unextractable anrabinoxylan，簡稱 WUAX)，其中WEAX約占25% ～30%［25］。雖然小麥面粉中AX的含量并不高，但其吸水性強，對面團的形成及面包品質(zhì)有重要影響。張勤良等［26］的研究證明，在面包的制作過程中，適當添加一定量的木聚糖酶，能夠改善面團的彈性、穩(wěn)定性和對過度發(fā)酵的耐受性，使得面粉的粉質(zhì)，面團的揉制都得到了改善。李秀婷等［27］的研究也證明了，添加適當劑量的木聚糖酶后的面包，在烘焙過后不僅質(zhì)地潔白、組織細膩、氣孔均勻、入口松軟有嚼勁且過早老化的問題也得到了改善。

2.1.1 木聚糖酶對面包制作過程中面團品質(zhì)的影響

在面團揉制過程中，木聚糖酶能夠促使部分的WUAX溶解，其使得面團的持水能力下降，從而促使面團中其他組分中的水分重新得到分布，進而可增加面團的延伸性。而面團延伸性的增強也會反過來增加面團水相的黏度，面團的黏度上升又會使得面團的內(nèi)聚力增強，彈性增大。但是，過量的木聚糖酶會使面團中的水分過多釋放而影響面團的質(zhì)量。這是因為在面包的揉制過程中，WUAX的增溶速率最快，WEAX過度降解，進而使得面團的內(nèi)聚力下降，黏度過高，稠度下降，同時面團的抗延伸性也下降，進而影響了面包的揉制和制作。因此，在面包的制作過程中，要控制好木聚糖酶的添加量。另外，面團醒發(fā)對于面包制作具有重要的影響，但是目前關(guān)于這方面的研究和報道都很少，主要是因為面團醒發(fā)過程中面團的產(chǎn)氣能力、持氣能力以及面團的穩(wěn)定性很難測定［26，28］。

2.1.2 木聚糖酶對面包在烘焙過程中的影響

面包烘焙的開始階段可以被認為是面團醒發(fā)的外延，此時，由于氣體的膨脹和酵母活性的高效發(fā)揮，使得面團膨脹很快。因此，這一階段，面筋的黏度、彈性以及面團的持氣能力都要比醒發(fā)過程顯得更為重要。面粉中的WEAX在烘焙初期可以增加氣泡的強度和穩(wěn)定性，改善面包心的均勻性，對面包的烘焙有著非常積極的作用;但是，WUAX對面包的烘焙初期卻具有負面影響，它會降低面包的體積，破壞面包心的均勻性和面包的質(zhì)構(gòu)。然而，在烘焙過程中，添加適當劑量的木聚糖酶就能夠使得面包體積增加、質(zhì)構(gòu)改善、面包心的均勻性提高［26，29］。其原因包括以下幾點:第一，木聚糖酶能夠促使WUAX增溶;第二，WEAX的適當降解，使附著在面筋蛋白質(zhì)膜表面的AX黏度下降，從而促使面筋蛋白質(zhì)膜延伸性增加，但是面團的穩(wěn)定性和面筋的網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)并未因此受到破壞;第三，不斷增加的WEAX與面包中的氧化劑發(fā)生了氧化凝膠作用，使烘焙的面包持水性加強，彈性增加。

2.1.3 木聚糖酶對面包抗老化的影響

面包老化是指面包皮的破壞、風味的降低、面包變硬等現(xiàn)象，其主要原因是面包在貯藏過程中淀粉發(fā)生了凝沉。但是當添加適當劑量的木聚糖酶后，能夠使面包中的WUAX和WEAX的比例更加合理，而且WEAX的分子鏈長度也有所下降。因為WEAX能夠與面包其他組分中的氧化劑發(fā)生氧化膠凝作用，增加了面包的持水性;而WEAX的鏈長下降可以降低WEAX與鄰近生物大分子之間鏈的連接，使起水橋作用的水分子的量減少，這樣就能有效延緩面包的失水速率和水分遷移速率，進而使得面包抗老化能力增強［27，30］。

2.2 木聚糖酶在低聚木糖制備中的應用

低聚木糖是一種功能性低聚糖。低聚木糖對pH值及熱的穩(wěn)定性較好，因此其在人體內(nèi)難以消化，但是卻可以極好地促進腸道內(nèi)雙歧桿菌的增殖，從而起到抑制腸道內(nèi)腐敗菌的生長，改善腸道微生態(tài)環(huán)境，調(diào)節(jié)人體的生理機能，增強免疫力，預防疾病發(fā)生的作用;另外，由于低聚木糖的甜度僅為蔗糖的40%，因此，食用該糖后不會導致人體血液中葡萄糖水平大幅度上升，從而可以作為功能性甜味劑，部分取代蔗糖，給糖尿病患者食用;再者，低聚木糖具有良好的持水性，在食品中可作為保濕劑或保鮮劑使用［31－32］。

目前，工業(yè)制備低聚木糖最常用的方法就是酶解法，即使用微生物產(chǎn)生的內(nèi)切型木聚糖酶分解木聚糖，然后經(jīng)分離提純制得低聚木糖，由于是利用內(nèi)切型木聚糖酶定向酶解半纖維素，故副產(chǎn)物較少，有利于后續(xù)工藝中低聚木糖的分離、提純和精制。在我國，楊瑞金等［32］最早研究并報道了酶法生產(chǎn)低聚木糖，他們是利用P－3－31菌株的木聚糖酶酶系將玉米芯中的木聚糖水解制取低聚木糖。制備低聚木糖的木聚糖酶是有特殊要求的:首先，對底物水解的特異性要求:即要求產(chǎn)生木二糖、木三糖的比例要高;其次需要不含有木糖苷酶活性。目前，關(guān)于木聚糖酶水解底物的特異性及其作用模式在國外仍是研究熱點，這也是制備低聚木糖的關(guān)鍵技術(shù)。

2.3 木聚糖酶在釀酒過程中的應用

目前，用于釀酒行業(yè)的木聚糖酶為酸性木聚糖酶，原因在于木聚糖酶對谷物細胞壁中木聚糖的作用有助于加快水解淀粉酶，其主要應用對象也是指啤酒和清酒的釀制。但基于成本的考慮，至今為止，在釀酒行業(yè)大量使用木聚糖酶還不常見，關(guān)于這方面的研究也鮮有報道。但是早在1991年，日本就已經(jīng)有了將木聚糖酶用于日本燒酒生產(chǎn)中的應用研究，并且取得了比較好的結(jié)果［33］。我國江南大學陸健等［34］也對耐酸性木聚糖酶應用于清酒的釀造作了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，添加木聚糖酶，既提高了發(fā)酵速度，又提高了酒精產(chǎn)率。但是要想在釀酒工業(yè)實現(xiàn)實際的工業(yè)化生產(chǎn)，就必須滿足以下條件:首先要求使用的木聚糖酶能夠耐酸性，以適應實際的生產(chǎn)條件;其次該酶應該有比較好的底物水解針對性，能夠快而有效地分解谷物細胞壁中的木聚糖，從而加快淀粉酶的作用;再者，木聚糖酶的產(chǎn)率要高，這樣才能夠有經(jīng)濟上的可行性來將其應用于釀酒工業(yè)中。

3 結(jié)束語

由此可見，木聚糖酶在食品行業(yè)中有著廣泛的應用前景，但是與其良好的水解能力和巨大的應用價值相比較而言，木聚糖酶的工業(yè)化生產(chǎn)及應用現(xiàn)狀卻依舊問題重重。首先是酶的穩(wěn)定性問題。木聚糖酶是一種微生物制劑，對外界物化條件的影響極為敏感。然而應用在食品領(lǐng)域中的酶，往往需要經(jīng)過高溫的加工處理，這常會使酶遭到破壞，影響木聚糖酶活性的發(fā)揮，在一定程度上限制了木聚糖酶在食品領(lǐng)域的應用。其次是酶的添加量問題。不同性質(zhì)和酶活的產(chǎn)品，都有其適合的應用領(lǐng)域，且在不同的應用條件下，即使在同一應用領(lǐng)域中，木聚糖酶的添加量和添加水平也存在一定的差異。因此，在實際應用中，如果使用不當，不但會影響酶的應用效果，還會適得其反。再者便是與其他酶制劑的復配問題。在實際應用中，往往需要添加其他酶系如果膠酶、纖維素酶等組成復合酶制劑用于生產(chǎn)，然而，不同組合及配比的復合酶制劑的應用效果是有差異的。因此，要解決好上述問題，就需要更加系統(tǒng)、深入地開展木聚糖酶應用研究，根據(jù)特定的應用對象有針對性地創(chuàng)造最佳的反應條件，最大限度地發(fā)揮木聚糖酶的作用，提高產(chǎn)品質(zhì)量，降低生產(chǎn)成本，實現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展。

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