裂片石莼多糖的超聲波輔助提取優(yōu)化及其理化性質(zhì)*

邵平，裴亞萍，陳曉曉，陳蒙，孫培龍

(浙江工業(yè)大學生物與環(huán)境工程學院，浙江杭州，310014)

石莼(Ulva fasciata)又名海白萊、海萵苣，屬綠藻門石莼科的藥食兩用海藻，常見種類主要有孔石莼、石莼、礪菜、裂片石莼等。在長江以南沿海地區(qū)廣泛分布，浙江沿海資源豐富。文獻記載有軟堅散結(jié)、清熱解毒、利水降脂等作用［1］?，F(xiàn)代研究表明，石莼有抗凝血、凈化血液、抗病毒和降膽固醇等作用，其主要活性成分為多糖［2］。

國內(nèi)外對石莼的研究起步較早但不夠深入［1－4］。目前為止對石莼的研究主要集中在孔石莼方面，對裂片石莼的研究甚少，石莼多糖的提取仍停留在熱水浸提法上，未見采用超聲波輔助提取法報道，對其理化性質(zhì)的研究不夠深入。

海藻多糖中含有大量的羥基，能與水分子形成化學鍵，具有一定的吸濕作用，是保潤作用的主要成分，且藻類中的多糖含量豐富，開發(fā)應用浙江沿海藻類具有巨大潛力。朱尊權(quán)等人將羊棲菜提取液作為煙用料液加入到卷煙煙絲上，在燃吸卷煙時可產(chǎn)生特有的化學成分，明顯改善或提高卷煙的質(zhì)量品質(zhì)［5］。不同的海藻中含有的多糖不同，不同的多糖燃吸的口感也不同，但到目前為止還未見將裂片石莼多糖應用于煙草保潤的報道。

本文選取南麂列島地產(chǎn)裂片石莼為研究對象，優(yōu)化超聲波輔助提取裂片石莼多糖的工藝條件，并對多糖樣品的理化性質(zhì)進行了分析，并將其添加到煙絲中對制備樣品卷煙進行綜合感官評吸，為海洋綠藻資源的綜合開發(fā)利用提供的參考。

1 材料與方法

1.1 設備與儀器

DJ-04型中藥粉碎機(上海淀久儀器);AL104電子天平(感量:0.0001 g，梅特勒-托利多儀器有限公司);FS-1200型直插式超聲波細胞破碎器(上海生析超聲儀器有限公司);CR21GII型高速冷凍離心機(日本日立公司);RE-2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠);752型紫外可見分光光度計(上海光學儀器有限公司);ALPHA 2-4LD PLUS型真空冷凍干燥機(德國Marin Christ公司);HWS-150型恒溫恒濕箱(上海森信實驗儀器有限公司);Nicolet 6700型傅里葉紅外光譜儀(Thermo Electron公司);UV-2450PC紫外分光光度計(日本島津公司)。

1.2 材料與試劑

裂片石莼，采自浙江溫州平陽縣南麓列島，經(jīng)過淡水反復沖洗，陰干，放于60℃烘干保存?zhèn)溆谩?/p>

試劑:葡萄糖(廣東光華化學廠有限公司);濃HCl、濃H2SO4(衢州巨化試劑有限公司);苯酚(浙江杭州雙林化工試劑廠);體積分數(shù)95%乙醇(安徽安特生物化學有限公司);考馬斯亮藍G-250(國藥集團化學試劑有限公司)、牛血清血蛋白(上海伯奧生物科技有限公司)、CaCl2(上海試四赫維化工有限公司)、H3PO4(上海凌峰化學試劑有限公司);明膠(中國上海試劑總廠);BaCl2(上海泗聯(lián)化工廠有限公司);三氯乙酸(如皋市金陵試劑廠);K2SO3(上海振欣試劑廠)，以上樣品試劑均為分析純。

1.3 實驗方法

1.3.1 裂片石莼粗多糖的提取工藝流程

裂片石莼→粉碎→過篩→超聲波輔助提取→離心取上清液→濃縮→80%乙醇沉淀→離心取沉淀→冷凍干燥

1.3.2 多糖提取率的測定

采用苯酚-硫酸法測定多糖含量［6］。所得標準曲線回歸方程為Y=6.954 8X－0.047 9(R2=0.999 1，說明線性關(guān)系良好)。多糖提取率計算公式如下:

式中:c為從標準曲線查得糖濃度(mg/mL);n為稀釋倍數(shù);V為原液體積(mL);m為原料質(zhì)量(g)。

1.3.3 響應面試驗設計

根據(jù)Box-Behnken組合試驗設計原理，通過對料液比、提取時間、功率和脈沖循環(huán)時間的單因素試驗考察，選取對提取工藝影響顯著的3個因素，分別為提取時間(20、30、40 min)，功率(480、600、720 W)，脈沖循環(huán)時間(0、4、8 s)，分別以 A、B、C 代表，每個自變量的低、中、高實驗水平分別以－1、0、1進行編碼，試驗設計如表1所示。

表1 響應面分析因子及水平Table 1 Factors and levels of RSM analysis

1.3.4 裂片石莼粗多糖理化性質(zhì)分析

物理性質(zhì)分析:觀察多糖的色、溴、味，觀察多糖在水及幾種有機溶劑中的溶解性。

化學性質(zhì)分析:Molish反應、苯酚-硫酸反應、Fehling反應。

(1)粗多糖中總糖含量的測定:苯酚-硫酸法，同1.3.2。

(2)粗多糖中蛋白含量的測定:考馬斯亮藍法［7］。所得標準曲線回歸方程為 Y=5.879 8X+0.010 8，R2=0.992 2。

(3)粗多糖中硫酸根含量的測定:硫酸鋇比濁度法［8］。所得標準曲線回歸方程為 Y=0.003 1X+0.001 3，R2=0.992 2。

(4)粗多糖中糖醛酸含量的測定:硫酸-咔唑比色法［9］。所得標準曲線回歸方程為 Y=0.010 9X+0.018 4，R2=0.998 1。

(4)裂片石莼多糖的紫外全掃描:稱取粗多糖2 mg，溶于蒸餾水中稀釋至1 mg/mL，于190～600 nm下進行紫外全掃描。

(5)裂片石莼多糖的紅外光譜:將干燥的粗多糖樣品于KBr壓制成片，用紅外光譜儀，掃描400～4 000 cm－1波長范圍的光譜吸收值。

1.3.5 樣品煙的制備和評吸

稱取適量的煙絲在恒溫(22℃ ±1℃)恒濕(相對濕度為60% ±2%)箱內(nèi)平衡48 h，將裂片石莼多糖配成1 mg/mL的溶液，取5 mL均勻噴灑在25 g煙絲上，于恒溫恒濕箱中平衡48 h(條件同上)，用手動打煙機打煙，每支卷煙保持在0.7 g煙絲，煙絲分布均勻，軟硬適中，送往浙江中煙公司讓專業(yè)評吸人員進行綜合感官評吸。

2 結(jié)果與討論

2.1 超聲波提取過程中單因素的影響

2.1.1 料液比對多糖提取率的影響

由于裂片石莼葉肉中水分含量較少，推測料液比是影響多糖提取率的重要因素。從圖1可知，料液比的增大對提高裂片石莼多糖提取率的效果不顯著，曲線較平緩，當料液比為1∶20時，多糖提取率就達到9.96%，增大料液比，提取率未見增加。當料液比為1∶20、1∶60、1∶100時，多糖提取率較為接近，由于后續(xù)工序中需經(jīng)濃縮，若初期加水量過大會使后續(xù)工序能耗增加，效率降低，因此選擇料液比為1∶20左右較為合適。

圖1 料液比對裂片石莼多糖提取率的影響Fig.1 Effect of solid/liquid ratio on polysaccharide extraction rate

2.1.2 提取時間對多糖提取率的影響

從圖2可知，隨提取時間的延長，多糖提取率不斷增加，由4.19%增加到9.68%，提取率在30 min之前增加較顯著，30 min時達到最大為9.68%，以后趨于平緩，為縮短工時減少能耗，選擇最佳提取時間為30 min。

2.1.3 超聲功率對多糖提取率的影響

圖2 提取時間對裂片石莼多糖提取率的影響Fig.2 Effect of extraction time on polysaccharide extraction rate

從圖3可知，當提取功率為240、360 W時，多糖提取率較低，分別為3.28%、4.00%。但隨著功率增加多糖的提取率顯著提高，480 W時達到9.61%，繼續(xù)增大功率提取率上升不明顯。綜合考慮提取率和能耗，選擇最佳提取功率為600 W。

圖3 超聲功率對裂片石莼多糖提取率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic power on polysaccharide extraction rate

2.1.3 超聲脈沖循環(huán)時間對多糖提取率的影響

脈沖循環(huán)時間是一個周期內(nèi)超聲波脈沖作用的時間，如脈沖循環(huán)時間為4 s，就是超聲波處理樣品時，4 s作用于樣品4 s停留，如此循環(huán);脈沖循環(huán)時間為0 s代表一直超聲;脈沖循環(huán)時間是影響超聲波提取效率的一個重要條件。從圖4可知，當脈沖循環(huán)時間為1 s時，多糖提取率最低，為3.80%;當脈沖循環(huán)時間為8 s時，多糖提取率達到最高為11.70%;在脈沖循環(huán)時間為0 s和4 s時，多糖的提取率分別為8.96%和11.22%。綜合考慮，選取脈沖循環(huán)時間為4s為最佳。

2.2 響應面法優(yōu)化裂片石莼多糖提取的工藝參數(shù)

2.2.1 響應面分析方案及結(jié)果

響應面分析實驗結(jié)果見表2、表3。利用Design Expert 8.5軟件對表2實驗數(shù)據(jù)進行分析，獲得裂片石莼多糖提取率對提取時間、超聲功率和脈沖循環(huán)時間的多元二次回歸方程因素代碼形式為:

圖4 脈沖循環(huán)時間對裂片石莼多糖提取率的影響Fig.4 Effect of pulse recurrent time on polysaccharide extraction rate

表2 響應面試驗設計方案及試驗結(jié)果Table 2 Experiment design and results of RSM

表3 回歸模型方差分析Table 3 ANOVA regression model

由表3顯著性檢驗表明，模型回歸達到極顯著的水平，模型的決定系數(shù)R2=0.951 5，說明模型與實際實驗擬合有97.91%的符合度;校正決定系數(shù)=0.903 0，說明該模型能解釋90.30%響應值的變化;失擬值P值0.309 8，說明檢驗結(jié)果與模型計算結(jié)果沒有顯著差異;若模型很好地預測了實際結(jié)果，則F檢驗值應遠遠大于理論計算值，此模型的F檢驗值為19.62，理論值在0.05水平上查表可得 F(8，4)=6.04，說明方差顯著性很高，因此可以用該回歸方程代替實驗真實點對試驗結(jié)果進行分析和預測［11］。

2.2.1 響應面分析方案及結(jié)果

二次回歸方程的響應面及其等高線如圖5～圖7所示，各個因素及其相互間的交互作用對響應值的影響結(jié)果通過該組圖可以直觀地反映出來。

由圖5可知，與超聲功率相比，提取時間對多糖提取率的影響呈現(xiàn)較為平緩的趨勢，超聲功率的影響較大，曲線陡峭且呈先逐漸上升后稍微下降的趨勢，超聲功率與提取時間的交互作用不顯著，兩者各自與多糖提取率相關(guān)。由圖6可知，脈沖循環(huán)時間對多糖提取率的影響大于提取時間，兩者無交互作用。由圖7可知，與脈沖循環(huán)時間相比，超聲功率對多糖提取率的影響更為顯著，且兩者無交互作用。從這3組圖可以看出，影響裂片石莼多糖提取率最顯著的因素為超聲功率，表現(xiàn)為響應面變化弧度較大，其次是脈沖循環(huán)時間，提取時間響應面弧度變化平緩，說明對響應值的影響較小。

圖5 Y=f(A，B)的響應面和等高線圖Fig.5 Responsive surfaces and contours of Y=f(A，B)

圖6 Y=f(A，C)的響應面和等高線圖Fig.6 Responsive surfaces and contours of Y=f(A，C)

圖7 Y=f(B，C)的響應面和等高線圖Fig.7 Responsive surfaces and contours of Y=f(B，C)

2.2.3 最佳工藝的求解

通過Design-Expert軟件對上述方程進行求解，得到最佳的提取條件為:提取時間32.99 min，超聲功率618.97 W，脈沖循環(huán)時間為0 s即一直超聲，在此條件下，裂片石莼多糖提取率的理論值可達14.20%。為檢驗該法的可靠性，考慮到實際操作的便利，將最佳工藝修正為超聲時間33 min，超聲功率620 W，脈沖循環(huán)時間為0 s，在此條件下進行驗證試驗，經(jīng)3次平衡試驗，實際多糖提取率為14.11%、14.09%、14.21%，與回歸模型預測的多糖提取率無顯著差異，實驗結(jié)果與模型符合良好，該模型可較好地模擬和預測裂片石莼多糖的提取率。

2.3 裂片石莼粗多糖理化性質(zhì)分析

2.3.1 裂片石莼粗多糖的物理性質(zhì)

裂片石莼多糖干品呈灰白色粉末，無味、無溴、易溶于水，不溶于乙醇、丙酮、乙醚、三氯甲烷等有機溶劑。

2.3.2 裂片石莼粗多糖的化學性質(zhì)

Molish反應呈陽性，說明樣品中含有游離或結(jié)合的糖;苯酚-硫酸反應呈陽性，說明有多糖的存在;Fehling反應呈陽性，說明有還原性糖存在。

2.3.3 裂片石莼粗多糖的主要成分分析

查閱文獻發(fā)現(xiàn)多糖的活性與其主要成分有很大關(guān)系，其中多糖含量和硫酸根含量對其活性影響最大，潘路路等的研究發(fā)現(xiàn)隨著硫酸根含量的增加，鼠尾藻多糖的抗氧化活性隨之增加［12］。周軍明等的研究也發(fā)現(xiàn)硫酸根含量高的褐藻糖膠其抗氧化活性也較強［13］。因此，本實驗對超聲波輔助提取所得裂片石莼粗多糖進行主要成分分析。結(jié)果顯示裂片石莼粗多糖中總糖的含量為38.63%、糖醛酸含量為35.06%，硫酸根含量為 19.41%，蛋白質(zhì)含量為0.28%。這與諶素華在“綠藻石莼粗多糖提取條件的研究”一文中的結(jié)論基本相符。

2.3.4 裂片石莼粗多糖的紫外全掃描和紅外光譜

裂片石莼粗多糖的紫外全掃描圖譜如圖8所示，可知裂片石莼粗多糖在206 nm左右有較大的吸收峰，為裂片石莼多糖的特征吸收峰，其中粗多糖在260 nm處有吸收峰，說明多糖組分含有核酸類物質(zhì)，在280 nm處無吸收峰，說明蛋白質(zhì)含量很少或不含有蛋白質(zhì)，這與結(jié)果2.3.3中所得蛋白質(zhì)含量為0.28%保持了一致。

圖8 裂片石莼多糖紫外全掃描光譜圖Fig.8 UV scanning curve of UFP

裂片石莼粗多糖的紅外光譜如圖9所示。從圖9可知位于3 450～3 410 cm－1有一寬且強的吸收峰，系多糖的—OH產(chǎn)生;2 940 cm－1附近的尖峰是飽和C—H伸縮振動的信號;在1 634 cm－1附近振動峰的出現(xiàn)，表明有C O羧基的存在，即多糖中含有糖醛酸，為酸性多糖;1 424 cm－1附近出現(xiàn)的峰是由于C—H的彎曲振動引起的;1063 cm－1左右有一較強寬吸收帶，為多糖各糖殘基之間糖苷鍵C—O—C的振動峰;1 240 cm－1的強峰和840 cm－1、791 cm－1附近的2尖峰是硫酸基的吸收信號［14］。這些都與結(jié)果2.3.3的結(jié)論是相一致的。

圖9 裂片石莼多糖紅外光譜圖Fig.9 IR spectrum of UFP

2.3.5 裂片石莼多糖在煙草上的應用

添加裂片石莼多糖后的卷煙樣品，總體有提升，外加物質(zhì)香氣較顯著，透發(fā)性變好，煙氣變細膩，干燥感有改善，對于卷煙感官清爽度、舒適度的提高具有一定作用，是很好的煙草保潤增香劑。

3 結(jié)論

(1)本實驗通過單因素和響應曲面分析法對裂片石莼多糖超聲波輔助提取工藝進行了優(yōu)化，得到的最佳提取工藝條件為:提取時間為33 min，超聲功率為620 W，脈沖循環(huán)時間為0 s時，多糖提取率最高，為14.20%。響應面分析表明，超聲功率對多糖提取率的影響最為顯著，為關(guān)鍵因素，脈沖循環(huán)時間次之，提取時間對多糖提取率的影響較小。

(2)提取所得裂片石莼多糖為灰白色粉末，無味、無溴、易溶于水，不溶于乙醇、丙酮、乙醚、三氯甲烷等有機溶劑。Molish反應呈陽性，苯酚-硫酸反應呈陽性，F(xiàn)ehling反應呈陽性。

(3)測得粗多糖中所得粗多糖中總糖含量為38.63%;采用硫酸-咔唑比色法測得糖醛酸含量為35.06%;且對其有效活性成分-硫酸根含量進行測定，硫酸根含量為19.41%;采用考馬斯亮藍法測得粗多糖中蛋白質(zhì)含量為0.28%，含量較低，說明粗多糖中雜質(zhì)較少。

(4)將裂片石莼多糖應用于卷煙，整體評吸效果較好，香氣提升較顯著，透發(fā)性變好，煙氣變細膩，清爽度，舒適感提高，干燥感有所改善。

［1］徐娟華，丁紅霞.綠藻石莼多糖的提取工藝［J］.中藥與天然藥物，2002，33(10):476－477.

［2］西澤一俊.海藻生理活性物質(zhì)［J］.中國海洋藥物雜，1993(1):47－51.

［3］Yu P Z，Zhang Q B，Li N.Polysaccharides from Ulva pertusa(Chlomphyta)and preliminary studies on their antihyperlipidemia activity［J］.Journal of Applied Phycology，2003，15(1):21－27.

［4］諶素華，王維民，吳麗萍.綠藻石莼粗多糖提取條件的研究［J］.科學研究，2008，29(9):68－71.

［5］朱尊權(quán)，胡有持，周細才，等.羊棲菜水提取液及其在煙草中的應用［P］.中國，200610128283.3，2006－11－25.

［6］張惟杰.糖復合物生化研究技術(shù)［M］.杭州:浙江大學出版社，1999.

［7］Bradford M M.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein using the principle of protein-dye binding［J］.Analytical Biochemistry.1976，72:248－254.

［8］強亦忠，王崇道，邵源，等.海藻硫酸多糖的制備及其性質(zhì)研究［J］.蘇州大學學報:醫(yī)學版，2003，23(4):391－393.

［9］林穎，黃琳娟，田庚元.一種改良的糖醛酸含量測定方法［J］.中草藥，1999，30(11):817－819.

［10］Guo X，Zou X，Sun M.Optimization of extraction process by response surface methodology and preliminary characterization of polysaccharides from Phellinus igniarius［J］.Carbohydrate Polymers，2010，80(2):344－349.

［11］魏海龍，賀亮，甘慶軍.茯苓菌絲體多糖徑向流色譜分離參數(shù)優(yōu)化［J］.浙江林業(yè)科技，2011，31(2):1－5.

［12］潘路路.鼠尾藻多糖的提取、硫酸化修飾及抗氧化活性初步研究［D］.南寧:廣西大學，2010.

［13］周軍明.褐藻糖膠提取純化、結(jié)構(gòu)分析及抗氧化研究［D］.杭州:浙江大學理學院，2006.

［14］王艷梅，牛錫珍，張虹等.孔石莼多糖的分離分析［J］.中國海洋藥物，2002(6):4－7.