超聲波輔助提取中華苦荬菜多酚工藝優(yōu)化及不同干燥方式對(duì)其得率的影響*

石同同，陳瑩瑩，王頡，孫劍鋒，鄭乾魏

1(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北 保定，071000)2(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，河北保定，071000)

中華苦荬菜(Ixeris chinensis(Thunb.ex Thunb.)Nakai)含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分和生理活性物質(zhì)，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健作用，也是一種藥食共用的植物［1］。中華苦荬菜在我國(guó)分布廣泛，野生資源豐富，食用、藥用歷史悠久，其化學(xué)成分及藥理作用復(fù)雜［2－3］。多酚類物質(zhì)是一族在結(jié)構(gòu)中含有酚的化合物，屬于植物的次生代謝產(chǎn)物［4］，有研究報(bào)道，植物多酚具有清除體內(nèi)自由基、抗凝血、抗炎、防癌以及預(yù)防心血管疾病等多種作用。中華苦荬菜中所含成分十分復(fù)雜，常用提取多酚的方法有煎煮法、回流法、浸漬法，它們具有提取時(shí)間長(zhǎng)、提取率低且多酚等活性成分損失量大等缺點(diǎn)。超聲波破碎細(xì)胞提取法是近幾年新興的提取方法，具有選擇性高、提取時(shí)間短、提取率高、消耗溶劑少等優(yōu)點(diǎn)［5］，本試驗(yàn)采用響應(yīng)面優(yōu)化法確定中華苦荬菜多酚超聲提取最佳條件，并對(duì)真空冷凍干燥、紅外干燥、自然陰干、烘干及自然曬干的中華苦荬菜多酚得率進(jìn)行了測(cè)定。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

中華苦荬菜，采自河北農(nóng)業(yè)大學(xué)校園內(nèi)，經(jīng)河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科技學(xué)院馮大嶺教授鑒定，沒(méi)食子酸，福林酚，無(wú)水乙醇，碳酸鈉均為市售分析純。

kq-500de型細(xì)胞超聲破碎儀，昆山市超聲儀器有限公司;WFZ-UV-2800紫外-可見分光光度計(jì)，尤尼科儀器有限公司;真空冷凍干燥機(jī);HW-3型紅外干燥箱;DL-101-2型電熱鼓風(fēng)干燥箱，天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司;TB-215D分析天平，賽多利斯股份有限公司(德國(guó)，感量為十萬(wàn)分之一)。

1.2 中華苦荬菜處理方法

新鮮中華苦荬菜洗凈，50℃條件下烘干至恒重，粉碎后過(guò)40目，準(zhǔn)確稱取中華苦荬菜干粉2.000 g，放入一定體積的乙醇溶液，放入超聲波破碎儀，提取后抽濾，抽濾液用60%乙醇定容到50 mL容量瓶得到中華苦荬菜提取液，再將此提取液稀釋10倍，精密稱取試驗(yàn)中稀釋后的提取液1 mL，分別加入0.5 mL福林試劑、2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%Na2CO3溶液，定容至10 mL，室溫下反應(yīng)2 h。在760 nm出測(cè)定反應(yīng)液的吸光度。

1.3 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線確定

采用 Folin-ciocalteu 法測(cè)定總多酚含量［6－7］。稱取25 mg沒(méi)食子酸，加入到25 mL去離子水中，得到1 mg/mL的沒(méi)食子酸溶液。吸取5 mL 1 mg/mL的沒(méi)食子酸溶液，定容至50 mL容量瓶中，即得0.1 mg/mL 的沒(méi)食子酸溶液，然后配成 0，20，40，60，80，100 μg/mL的沒(méi)食子酸標(biāo)液分別標(biāo)號(hào)0～6。取不同標(biāo)樣沒(méi)食子酸溶液1 mL，分別加入0.5 mL福林試劑、2 mL 10%Na2CO3溶液，定容至10 mL，室溫下反應(yīng)2 h，以0號(hào)管為空白用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定各溶液在760 nm處吸光度，以吸光度(y)為縱坐標(biāo)，沒(méi)食子酸濃度(x)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4.1 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

準(zhǔn)確稱取處理后的中華苦荬菜干粉2.000 g，放入一定體積的乙醇溶液，放入超聲波破碎儀，分別加入不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇，按照不同的提取時(shí)間、不同的料液比進(jìn)行超聲提取，提取結(jié)束后抽濾，抽濾液用60%乙醇定容到50 mL容量瓶中。提取液按照1.2測(cè)定提取液吸光度。以標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算中華苦荬菜多酚得率，分別確定最適的乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲時(shí)間和料液比。

1.4.2 響應(yīng)面試驗(yàn)及優(yōu)選

根據(jù)乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲時(shí)間和料液比3個(gè)單因素試驗(yàn)所確定的水平范圍，使用Design-Expert 7.1.3為輔助手段設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，選取Box-behnken模型，以多酚得率為響應(yīng)值，做三因素三水平共17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)(5個(gè)中心點(diǎn))的響應(yīng)面分析試驗(yàn)。確定中華苦荬菜最佳的提取條件。

1.5 中華苦荬菜干燥方法的選擇

1.5.1 真空冷凍干燥

將采集的中華苦荬菜全草洗凈，放入真空冷凍干燥機(jī)的冷凍室，迅速降溫至－40℃，保持1 h。再將凍結(jié)的中華苦荬菜放入真空干燥室，干燥8h，至樣品質(zhì)量不再發(fā)生改變，取出凍干的中華苦荬菜粉碎后過(guò)40目，抽真空包裝后備用。

1.5.2 紅外干燥

將采集的中華苦荬菜全草洗凈放入HW-3型紅外干燥箱，干燥2 h，干燥結(jié)束取出粉碎后過(guò)40目，抽真空包裝后備用。

1.5.3 陰干

將采集的中華苦荬菜全草洗凈，放置到背陰處，48 h后干燥結(jié)束，將陰干的中華苦荬菜粉碎后過(guò)40目，抽真空包裝后備用。

1.5.4 烘干

將采集的中華苦荬菜全草洗凈，50℃條件下烘干至恒重，粉碎后過(guò)40目，抽真空包裝后備用。

1.5.5 曬干

將采集的中華苦荬菜全草洗凈，放到太陽(yáng)直射下，10 h后質(zhì)量不再發(fā)生變化，干燥結(jié)束粉碎后過(guò)40目，抽真空包裝后備用。

1.6 多酚得率的計(jì)算

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線法將所測(cè)定的中華苦荬菜提取液的吸光度帶入回歸方程計(jì)算多酚的提取率。首先將所測(cè)得的吸光度帶入回歸曲線，計(jì)算此時(shí)所測(cè)定反應(yīng)液的多酚濃度x(μg/mL)。

總得率z=x×500/(2×1 000×1 000)。

其中，500為稀釋倍數(shù)，2×1 000×1 000為稱取中華苦荬菜質(zhì)量(μg)。(此公式僅適用于此試驗(yàn))。

2 結(jié)果與分析

2.1 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

根據(jù)沒(méi)食子酸不同濃度標(biāo)準(zhǔn)液得到的吸光度，以吸光度(y)為縱坐標(biāo)，沒(méi)食子酸濃度(x)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明沒(méi)食子酸濃度在0～100 μg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好。如圖1所示，回歸方程為y=0.011 2x+0.026 5，R2=0.995 7。

圖1 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of gallic acid

2.2 超聲提取多酚單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)多酚得率的影響

精確稱取中華苦荬菜粉末2.000 g，在料液比1∶20(g∶mL)，提取1 h條件下，分別加入體積分?jǐn)?shù)為30%、45%、60%、75%、95%的乙醇溶液，進(jìn)行超聲破碎提取1 h后，按1.2方法測(cè)定，并計(jì)算多酚得率。試驗(yàn)結(jié)果見圖2。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)得率的影響Fig.2 Effects of alcohol concentration on extraction rate

從圖2可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，多酚得率逐漸升高，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)，多酚的得率達(dá)到最大，總得率為1.91%，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)增大時(shí)，多酚得率開始下降，主要原因可能是隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的不斷增大，溶液的極性逐漸增大，而中華苦荬菜中多酚物質(zhì)的極性是基本恒定的，根據(jù)相似相溶原理，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)增大到60%時(shí)，如果再繼續(xù)增大，則提取液中因?yàn)樗畼O性增大導(dǎo)致提取率開始下降，從而使多酚得率降低。因此選擇適宜的乙醇體積分?jǐn)?shù)為45%、60%、75%。

2.2.2 超聲提取時(shí)間對(duì)多酚得率的影響

精確稱取中華苦荬菜粉末2.000 g，在料液比1∶20(g∶mL)，乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)，分別提取15、30、45、60、75、90 min，按照 1.2 方法進(jìn)行測(cè)定，并計(jì)算多酚得率。試驗(yàn)結(jié)果見圖3。

圖3 超聲時(shí)間對(duì)得率的影響Fig.3 Effects of processing time on extraction rate

從圖3可知，隨著超聲提取時(shí)間的增加，多酚得率逐漸升高，當(dāng)超聲提取60 min時(shí)，中華苦荬菜多酚得率達(dá)到最大，此時(shí)得率為1.93%。當(dāng)提取時(shí)間超過(guò)60 min時(shí)，多酚得率差異性不顯著，這可能是超聲提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，導(dǎo)致中華苦荬菜細(xì)胞組織破壞，一些不溶性的雜質(zhì)溢出，從而阻止了多酚成分的溶出。因此選擇適宜的超聲時(shí)間為45、60、75 min。

2.2.3 料液比對(duì)多酚得率的影響

精確稱取中華苦荬菜粉末2.000 g，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為 60%時(shí)提取 1 h，分別考察料液比 1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25(g∶mL)對(duì)中華苦荬菜多酚得率的影響。試驗(yàn)結(jié)果見圖4。

圖4 料液比對(duì)得率影響Fig.4 Effects of material-liquid ratio on extraction rate

從圖4可知，隨著料液比的逐漸增大，中華苦荬菜多酚得率逐漸增大，當(dāng)料液比為1∶20(g∶mL)時(shí)，總得率達(dá)到最大，為1.89%。繼續(xù)增大料液比，多酚的得率差異性不顯著。分析原因可能是由于在超聲波的作用下，中華苦荬菜中所含多酚類物質(zhì)已經(jīng)最大限度溶出，當(dāng)料液比進(jìn)一步增大時(shí)，其他雜質(zhì)進(jìn)入浸提液，從而阻止了多酚成分的溶出。因此選擇最適的料液比為 1∶15、1∶20、1∶25(g∶mL)。

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化中華苦荬菜多酚提取工藝

根據(jù)Box-behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，綜合單因素所得試驗(yàn)結(jié)果，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲時(shí)間和料液比3個(gè)因素，采用三因素三水平的響應(yīng)面分析方法，因素水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factorlal levels of RSD

表2 響應(yīng)面分析方案及結(jié)果Table 2 Design scheme and results of central composite test

應(yīng)用Design-Expert軟件進(jìn)行多元回歸擬合分析，得到中華苦荬菜多酚得率與各因素變量的模型Y=1.87+0.18A+0.056B+0.071C+0.067AB－0.013AC+0.030BC－0.36A2－0.057B2－0.18C2。

運(yùn)用軟件對(duì)17個(gè)響應(yīng)值進(jìn)行回歸分析得到方差分析表，如表3所示，整體模型P＜0.01，該二次方程模型達(dá)到了極顯著水平，并且失擬項(xiàng)不顯著說(shuō)明該方程對(duì)試驗(yàn)擬合較好。分析表3可知A乙醇濃度對(duì)多酚得率達(dá)到極顯著水平(P＜0.01)，C料液比對(duì)多酚得率達(dá)到顯著水平(P＜0.05)，二次項(xiàng)A2、C2對(duì)中華苦荬菜多酚得率曲面效應(yīng)極顯著，交叉項(xiàng)對(duì)多酚得率 的影響也較顯著。

表3 方差分析表Table 3 Analysis of extraction rate of flavonoids

2.4 響應(yīng)面曲面分析

根據(jù)回歸方程，做出響應(yīng)面圖(見圖5～圖7)，考察所擬合的響應(yīng)面的形狀，分析乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲時(shí)間以及料液比對(duì)多酚得率的影響。

圖5 F(A，B)響應(yīng)面立體圖Fig.5 F(A，B)Response surface perspective view

圖6 F(A，C)響應(yīng)面立體圖Fig.6 F(A，C)Response surface perspective view

從圖5～圖7可見，乙醇體積分?jǐn)?shù)是影響多酚得率的主要因素，料液比對(duì)其得率的影響次之，超聲時(shí)間對(duì)其得率的影響較小。在模型濃度的范圍內(nèi)選擇出發(fā)點(diǎn)，按照模型使用快速上升法進(jìn)行優(yōu)化，可得中華苦荬菜多酚提取的最佳方案為乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，超聲時(shí)間60 min，料液比1∶20(g∶mL)，在此工藝條件下，中華苦荬菜多酚得率的預(yù)測(cè)值為1.86%。

圖7 f(B，C)響應(yīng)面立體圖Fig.7 F(B，C)Response surface perspective view

2.5 最佳提取條件驗(yàn)證試驗(yàn)

為檢測(cè)響應(yīng)曲面法所得結(jié)果的可靠性，采用上述優(yōu)化條件乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，超聲時(shí)間60 min，料液比1∶20(g∶mL)，實(shí)際平均得率為1.85%，與理論值基本相符。

2.6 不同方法干燥的中華苦荬菜多酚得率測(cè)定

按照中華苦荬菜多酚的最佳超聲提取條件，分別測(cè)定真空冷凍干燥、紅外干燥、陰干、烘干以及曬干的中華苦荬菜中多酚得率，如圖8所示。

圖8 干燥方式對(duì)得率的影響Fig.8 Effects of drying methods on extraction rate

試驗(yàn)結(jié)果表明，真空冷凍干燥的中華苦荬菜多酚得率最高，為3.22%，曬干的中華苦荬菜多酚得率最低，為1.23%，干燥效果依次為凍干＞紅外干燥＞烘干＞陰干＞曬干。由此可知，直射光線及空氣中長(zhǎng)時(shí)間放置對(duì)多酚得率的影響非常大，容易使多酚含量因氧化而降低。真空冷凍干燥中華苦荬菜在干燥前始終處于低溫(凍結(jié)狀態(tài))，同時(shí)冰晶均勻分布于中華苦荬菜中，升華過(guò)程不會(huì)因脫水而發(fā)生濃縮現(xiàn)象，避免了由水蒸氣產(chǎn)生泡沫、多酚的氧化等副作用，因此真空冷凍干燥方式所得的多酚得率最高。紅外干燥時(shí)中華苦荬菜內(nèi)部水分的濕擴(kuò)散與熱擴(kuò)散方向是一致的，從而加速了水分內(nèi)擴(kuò)散的過(guò)程，也即加速了中華苦荬菜的干燥進(jìn)程，因此短時(shí)間內(nèi)就可干燥結(jié)束，從而避免多酚含量的降低。但是考慮到真空冷凍干燥能耗高，干燥時(shí)間長(zhǎng)等缺點(diǎn)，而紅外干燥具有干燥效率高，活性成分損失少等優(yōu)點(diǎn)，因此建議生產(chǎn)上采用紅外干燥的方式，同樣能得到較高的多酚含量。

3 結(jié)論

采用超聲波輔助提取技術(shù)對(duì)中華苦荬菜多酚進(jìn)行提取，通過(guò)單因素試驗(yàn)和Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析對(duì)超聲波提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，得出較優(yōu)工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，超聲時(shí)間60 min，料液比1∶20(g∶mL)，此時(shí)多酚得率可達(dá)1.85%。用最佳提取條件分別對(duì)真空冷凍干燥、紅外干燥、自然陰干、烘干及自然曬干的中華苦荬菜中的多酚得率進(jìn)行測(cè)定，試驗(yàn)結(jié)果表明真空冷凍干燥的中華苦荬菜多酚得率高，為3.22%，曬干的中華苦荬菜多酚得率低，為1.23%，不同干燥方式得率的大小依次為凍干(3.22%)＞紅外干燥(3.05%)＞烘干(1.98%)＞陰干(1.75%)＞曬干(1.23%)。

［1］Zhang S，Zhao M，Bai L，et al.Bioactive guaianolides from siyekucai［J］.Journal of Natural Products，2006，69(10):1 425－1 428.

［2］Zhang S，Wang J，Gang Q，et al.New Triterpenes from Siyekucai(Ixeris chinensis)［J］.Chinese Chemical Letters，20 06，17(2):195－197.

［3］Ashraf Taha Khalil，Ya-Ching Shen，Jih-Hwa Guh，et al.Two new sesquiterpene lactones from Ixeris chinensis［J］.Chemical and Pharmaceutical Bulletin，2005，53(1):15－17.

［4］黎妍妍，李錫宏，林國(guó)平，等.湖北烤煙多酚類物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)及其與海拔高度的關(guān)系分析［J］.湖北民族學(xué)院學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2009，27(3):267－270.

［5］馮育林，謝平，孫葉兵，等.中藥提取工藝應(yīng)用進(jìn)展［J］.中藥材，2002，25(12):908－911.

［6］婁在祥，王洪新，呂文平，等.微波輔助提取牛蒡葉多酚及其抗氧化抗菌活性研究［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2010，36(1):161－165.

［7］薛自萍，曹建康，姜微波，等.栆果皮中酚類物質(zhì)提取工藝優(yōu)化及抗氧化活性分析［J］.農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2009，25(S):153－158.