滋腎通絡(luò)方含藥血清對高糖誘導(dǎo)的大鼠系膜細(xì)胞增殖的影響

孟凡榮 馬建偉 趙宗江，3

(1大連醫(yī)科大學(xué)，大連，116110;2空軍總醫(yī)院中醫(yī)科，北京，100142;3北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京，100029)

DN是糖尿病最常見、最嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一。糖尿病腎病腎小球硬化(Glomerulosclerosis，GS)是所有慢性腎臟疾病進(jìn)行性發(fā)展至終末期的共同通道，最終可導(dǎo)致慢性腎功能衰竭。因此，早期治療對于延緩或逆轉(zhuǎn)GS以減少終末腎的發(fā)生有著重要的意義。從細(xì)胞水平上來看，系膜細(xì)胞(Mesangial Cell，MC)過度增殖及細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix，ECM)的過度生成和聚積是腎小球硬化早期的病理改變［1］。目前GS的西醫(yī)防治措施較有限，因此，從中醫(yī)藥中尋找有效的防治藥物將為延緩及治療DN提供有效的途徑。滋腎通絡(luò)方是治療DN臨床療效較好的經(jīng)驗方。我們以往的實驗研究表明，該方對DN大鼠腎臟具有明顯的保護(hù)作用［2－10］。本研究以高糖環(huán)境下系膜細(xì)胞增殖為模型，觀察滋腎通絡(luò)方對其增殖的影響，其目的在于進(jìn)一步探討該復(fù)方防治DN的機(jī)制。

1 實驗材料

1.1 動物和GMC細(xì)胞株 SD雄性大鼠15只，SPF級，購自于北京華阜康生物股份有限責(zé)任公司。大鼠腎小球系膜細(xì)胞(GMCs)株，購于上海坤肯生物化工有限公司(QK10144)。

1.2 儀器與試劑 超凈工作臺、恒溫CO2培養(yǎng)箱、倒置相差顯微鏡、450型自動酶標(biāo)儀(MuLtiskan Ascent)。胎牛血清(四季青Lot:No.061024)，RPMI－1640培養(yǎng)基 (GIBICOLot:No.663264)，MTT(SigmaLot:No.BS0881)，二甲基亞砜(DMSO)(AMRESCO公司:Lot:No.0231)，胰蛋白酶1∶250(Gibco Lot:No.41500－067);LPS(Sigma Lot:No.DH183－10);EDTA(Sigma Lot:No.40－3)。

1.3 藥物 滋腎通絡(luò)復(fù)方藥材由北京市同仁堂提供;苯那普利膠囊:規(guī)格10 mg/片，為北京諾華制藥公司產(chǎn)品，產(chǎn)品批號SD26003。

2 方法

2.1 含藥血清的制備 將SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為5組，即正常組(給予同體積0.9%生理鹽水)、苯那普利組(每日以1.16 mg/kg苯那普利灌胃)、滋腎通絡(luò)方小劑量組(每日以38.5g/kg灌胃)、中劑量組(每日以19.25 g/kg灌胃)、大劑量組(每日以9.625g/kg灌胃)。1次/d，各組自由飲食，連續(xù)7 d，在末次灌胃2 h麻醉后，在無菌條件下經(jīng)髂總動脈采血，靜置2h，離心(3000 r/min，20 min)，分離血清，并將含藥血清置于56℃水浴箱中，水浴30 min滅活補體處理。經(jīng)0.22 μm濾器過濾除菌后分裝并置于－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 細(xì)胞復(fù)蘇 1)從－70℃冰箱中取凍存有細(xì)胞的凍存管，手中快速搓動成冰水混合物;2)移入離心管后，加入不含有胎牛血清的1640量為10 mL，吹打后1000 r/min離心2 min，棄上清，如上清洗2次;3)加入10%胎牛血清的1640量為3 mL;4)吹打均勻后移入一新培養(yǎng)瓶，再加2 mL培養(yǎng)基;5)置于恒溫CO2培養(yǎng)箱中。

2.3 細(xì)胞傳代 待鏡下觀察細(xì)胞生長融合至80%時:1)用0.25%胰蛋白酶消化約2 min，鏡下觀察待細(xì)胞變圓脫壁后;2)用移液管吹打并轉(zhuǎn)入離心管，1000 r/min離心2 min，棄上清;3)用含有10%胎牛血清1640吹打均勻后分裝于新的培養(yǎng)瓶后置于溫箱培養(yǎng)。

2.4 細(xì)胞分組與給藥 取第3代GMC用含10%FBS的1640將細(xì)胞密度調(diào)整到1.2×105/mL，轉(zhuǎn)種于96孔培養(yǎng)板中，25μL/孔，則每孔細(xì)胞數(shù)為3×103/個，再于每孔加入含10%FBS的1640量為175μL。37℃，5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h后，各孔換液加入不含F(xiàn)BS的1640培養(yǎng)液200μL以同步各組細(xì)胞于G0期。然后分組:1)空白組:5%正常組含藥血清+3%胎牛血清+1640;2)高糖 +LPS組:8%胎牛血清 +高糖(2.5mg/mL)+LPS(1μg/mL);3)苯那普利組:5%苯那普利組含藥血清+3%胎牛血清+高糖(2.5mg/mL)+LPS(1μg/mL);4)滋腎通絡(luò)方小劑量組:5%滋腎通絡(luò)方小劑量組含藥血清+3%胎牛血清+高糖(2.5mg/mL)+LPS(1μg/mL);5)滋腎通絡(luò)方中劑量組:5%滋腎通絡(luò)方中劑量組含藥血清+3%胎牛血清+高糖(2.5mg/mL)+LPS(1μg/mL);6)滋腎通絡(luò)方大劑量組:5%滋腎通絡(luò)方大劑量組含藥血清+3%胎牛血清+高糖(2.5mg/mL)+LPS(1μg/mL)，每組設(shè)10個復(fù)孔。

2.5 GMC增殖的實驗 細(xì)胞培養(yǎng)12 h、24 h、48 h后分別取出相應(yīng)的細(xì)胞板，吸出培養(yǎng)液，各孔加入10 μL濃度為5 mg/mL的MTT及190 μL無血清1640，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸棄各孔培養(yǎng)液，每孔加入200 μL的LDMSO，室溫避光，輕輕震蕩10 min，使結(jié)晶充分溶解，在酶標(biāo)儀上檢測波長為490 nm的光密度值。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法 用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。實驗數(shù)據(jù)采用(±s)表示。統(tǒng)計學(xué)分析采用方差分析。

3 結(jié)果

3.1 GMCs細(xì)胞形態(tài) 在倒置顯微鏡下觀察，可見正常組大鼠腎小球系膜細(xì)胞體積較大，且純度極高，形態(tài)多為梭形或星形。見圖1與圖2為不同時期的細(xì)胞形態(tài)。

表1 各組含藥血清對于高糖+LPS刺激的腎小球系膜細(xì)胞增殖的影響

圖3 各組含藥血清對于高糖+LPS刺激的腎小球系膜細(xì)胞不同時間點增殖的影響

3.2 MTT法結(jié)果 表1顯示，高糖+LPS刺激后12h、24h及48h各時相點GMCs明顯增殖，與空白組比較差異顯著(P＜0.05)。苯那普利和滋腎通絡(luò)復(fù)方含藥血清對高糖+LPS誘導(dǎo)的GMCs增殖具有不同程度的抑制作用，在各個時間點與高糖+LPS組相比，P＜0.05。

4 討論

DN是糖尿病最主要的并發(fā)癥之一，是終末期腎衰的主要原因［11］。系膜細(xì)胞是腎小球固有細(xì)胞中最活躍的細(xì)胞，是產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)、分泌細(xì)胞因子、吞噬和清除異物的主要細(xì)胞之一，系膜細(xì)胞對DN病理改變起著關(guān)鍵作用。系膜細(xì)胞異常增殖以及細(xì)胞外基質(zhì)的增多是DN的基本病理變化，因此抑制GMCs增生，減少細(xì)胞外基質(zhì)的堆積，已成為防治DN的重要環(huán)節(jié)之一。高血糖是DN的始動因素和中心環(huán)節(jié)［12］，以往的研究認(rèn)為，高糖環(huán)境對MCs的生長具有雙向性，在培養(yǎng)早期(24～48 h)高糖能促進(jìn)MCs增殖，此后高糖對MCs增殖起抑制作用［13］。滋腎通絡(luò)方含藥血清和高糖共同培養(yǎng)MCs 12 h、24 h、48 h后，發(fā)現(xiàn)滋腎通絡(luò)方含藥血清對高糖誘導(dǎo)的MCs增殖具有明顯的抑制作用。

DN屬中醫(yī)學(xué)“消渴病”繼發(fā)的“水腫”“關(guān)格”等病證的范疇。尊師馬建偉教授根據(jù)多年的臨床經(jīng)驗及其實驗研究［2－10］，結(jié)合呂仁和教授提出的“癥瘕學(xué)說”［14］，認(rèn)為早期的DN的基本病機(jī)為先天元氣不足，腎氣虧虛，腎虛氣化無力，一方面氣虛不能助血運行，血行不暢，另一方面是糖尿病出現(xiàn)腎臟病變一般病程較長，久病入絡(luò)，久病必瘀，從而導(dǎo)致腎絡(luò)瘀阻，久之腎絡(luò)出現(xiàn)微型癥瘕，腎臟功能進(jìn)一步虛損。滋腎通絡(luò)方應(yīng)用益氣滋腎、活血通絡(luò)法治療早期DN。其基本組成方藥由黃芪、生地黃、菟絲子、山茱萸、淫羊藿、當(dāng)歸、紅花、莪術(shù)、地龍、五味子、茯苓、萆薢組成。其中黃芪為君藥，補益腎氣?，F(xiàn)代藥理研究表明:黃芪可以通過降糖、調(diào)脂、調(diào)節(jié)內(nèi)皮素與一氧化氮平衡、抗過氧化作用、抗蛋白非酶糖化作用等多種途徑治療糖尿病腎?。?5］。生地黃、山茱萸、五味子益氣滋陰，淫羊藿、菟絲子補腎益精，上藥共為臣藥。地黃為玄參科植物地黃的新鮮或干燥塊根［16］，生地黃清熱涼血、養(yǎng)陰、生津，有研究發(fā)現(xiàn)其調(diào)節(jié)血糖的主要成分是地黃寡糖［17］。佐以當(dāng)歸、紅花、莪術(shù)、地龍活血化瘀通絡(luò);萆薢清泄腎濁、分清水濕;茯苓淡滲健脾，既有補腎固精之效，又可防脾土之壅滯。簡言之，黃芪、生地黃、山茱萸等藥物調(diào)動腎臟和全身的氣血，恢復(fù)機(jī)體的功能狀態(tài)，用當(dāng)歸、紅花、莪術(shù)、地龍活血化瘀，疏通腎絡(luò)的微循環(huán)通路，在益氣滋腎的作用下，使腎絡(luò)的微型癥瘕得以消散。整體從腎氣著手，局部從癥瘕考慮，整體和局部相結(jié)合，調(diào)動全身啟動局部，從而改善全身癥狀，恢復(fù)腎功能。本研究通過從細(xì)胞水平證實滋腎通絡(luò)方的含藥血清具有較好的抑制大鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖的作用，這有可能是滋腎通絡(luò)方防治糖尿病腎病，延緩其進(jìn)展的機(jī)制之一。

［1］Floege J，Johnson RJ，Gordon K，et al.Increased synthesis of extracellular matrix in mesangial proliferative nephritis［J］.Kidney Int，1991，40(3):477－488.

［2］馬建偉，徐麗梅，馬新英，等.滋腎通絡(luò)祛濁法治療糖尿病腎病腎功能不全失代償期臨床研究［J］.安徽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2009，28(6):28－31.

［3］馬建偉，徐麗梅，陳寶，等.滋腎活血解毒法治療慢性腎功能衰竭的臨床研究［J］.中國中醫(yī)藥信息雜志，2006，13(2):11 －13.

［4］馬建偉，徐麗梅，陳寶，等.健腎顆粒劑對糖尿病腎病大鼠腎功能及腎臟組織TGF－β1mRNA的實驗研究［J］.中國中醫(yī)藥信息雜志，2004(11):125－126.

［5］徐麗梅，馬建偉，馬新英，等.糖腎通絡(luò)方對早期糖尿病腎病患者血清四型膠原及尿微量清蛋白排泄率的影響［J］.安徽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2008，27(5):19 －22.

［6］徐麗梅，馬建偉，馬新英，等.益氣滋腎通絡(luò)法治療早期糖尿病腎病療效觀察［J］.山東中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2009，33(6):489 －492.

［7］徐麗梅，劉連起，于秀晨.止消通脈寧對糖尿病大鼠腎臟膠原非酶糖基化的影響［J］.北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2000，23(3):24 －26.

［8］徐麗梅，馬建偉，呂仁和.糖尿病大鼠腎臟組織非酶糖基化與尿微量蛋白的相關(guān)性研究［J］.中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2000，6(5):32－35.

［9］徐麗梅.益氣養(yǎng)陰活血祛濁湯對慢性腎功能衰竭氣陰兩虛證細(xì)胞免疫功能的影響作用［J］.中醫(yī)雜志，2000，41(8):474 －475.

［10］徐麗梅，馬建偉，魏漢林，等.健腎顆粒劑對糖尿病腎病大鼠腎臟組織中ET－1mRNA表達(dá)及腎功能的影響［J］.北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2010，33(4):266 －269.

［11］Locatelli F，Canaud B，Eckardt KU，et al.The importance of di－ abetic nephropathy in current nephrological practice［J］.Nephrol Dial Transplant，2003，18(9):1716 －1725.

［12］Kanwar YS，Wada J，Sun L，et al.Diabetic nephropathy:mecha － nisms of renal disease progression［J］.Exp Bio Med，2008，233(1):4 － 11.

［13］Wolf G.Molecular mechanisms of diabetic mesangial cell hyper－ trophy:a proliferation of novel factors［J］.J Am Soc Nephrol，2002，13(10):2611－2613.

［14］丁英鈞，肖永華，傅強等糖尿病腎病“微型癥瘕”病理假說解析［J］.中華中醫(yī)藥信息雜志，2009，24(1):27－30.

［15］王收寶，田林紅，黃芪治療糖尿病腎病分子機(jī)制研究進(jìn)展［J］.中醫(yī)藥學(xué)報，2011，39(1):118 －121.

［16］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典［S］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2000:249.

［17］張汝學(xué)，賈正平，李茂星，等.地黃寡糖改善HepG2細(xì)胞胰島素抵抗的分子機(jī)制研究［J］中草藥，2008，39(8):1184－1187.