5-羥色胺在覺醒肽（Orexin-A）促醒酒精性昏迷大鼠中的作用

解放軍第309醫(yī)院急救部（北京100091） 王天昊 樊雙義 閆 潔 陳 遠 馬朋林

由于對覺醒系統(tǒng)認識的不充分，昏迷的促醒研究也無重大進展。1998年覺醒肽（Orexins）的發(fā)現(xiàn)使人們對睡眠、覺醒的認識進入新的階段，也為昏迷的治療提供廣闊的前景。研究發(fā)現(xiàn)［1-2］分泌Orexins的神經(jīng)元僅位于下丘腦外側區(qū)（LHA），但其神經(jīng)纖維卻可投射到網(wǎng)狀上行激動系統(tǒng)的廣泛區(qū)域，如5-羥色胺能的中背縫核（DR）、組胺能的乳頭體核（TMN）、去甲腎上腺素能的藍斑（LC）等，因此，Sakurai等［3］推測 Orexins可能作用于5-羥色胺能等神經(jīng)系統(tǒng)，促進5-羥色胺、組胺、去甲腎上腺素的釋放從而促進睡眠的覺醒并實驗證實。Orexins可促進睡眠覺醒，但是否可促醒昏迷。酒精性昏迷是臨床上常見的昏迷類型，賈曉軍［4］的前期研究證實，腦室注射Orexin-A可對酒精性昏迷起到促醒作用。然而，其促醒機制是否與5-羥色胺素能等神經(jīng)系統(tǒng)的激活相關尚無定論。本實驗擬通過向酒精性昏迷大鼠模型腦室內注入特異性5-羥色胺（5-HT2）受體阻斷劑，以翻正反射持續(xù)時間（LORR）和大鼠皮層腦電δ波為評價指標，探討Orexin-A對酒精性昏迷促醒作用是否與5-羥色胺系統(tǒng)相關。

材料和方法

1 實驗動物及分組 本研究選取健康成年雌性SD大鼠24只（由第三軍醫(yī)大學實驗動物中心提供），平均體重200±30g。按隨機數(shù)排序分組法，將大鼠分為對照組（人工腦脊液，ACSF）、覺醒肽組（Orexin-A）、阻斷劑組（5-羥色胺受體阻斷劑利坦色林，Ritanserin）及阻斷劑+覺醒肽組（Ritanserin+Orexin-A）4組。

2 主要溶液的配置 人工腦脊液（ACSF）的配制：ACSF中各種離子成份及其濃度（mM）：NaCl 126，KCl 2.5，CaCl22，MgCl22，NaH2PO41.25，NaHCO326，葡萄糖10。Orexin-A溶液的配制：用ACSF溶解配制成 Orexin-A溶液：4nmol／5μl、4nmol／10μl。配制劑量參考以往文獻［5-6］。32%酒精溶液的配制：取無水乙醇以生理鹽水稀釋配制成32%的酒精溶液。Ritanserin溶液的配制：用新鮮ACSF配制，所配濃度分別為：Ritanserin40μg／5μl、40μg／10μl。

3 酒精昏迷模型建立及意識狀態(tài)分級 參照Yacoubi、賈曉軍等建立酒精性昏迷模型［4，7］。腹腔注射32%酒精溶液（14ml／kg），將大鼠的意識狀態(tài)分為6級：Ⅰ級：在籠內活動如常；Ⅱ級：在籠內活動減少；Ⅲ級：在籠內活動減少并運動失調；Ⅳ級：當背部放在籠的底部時能滾動（翻正反射存在）但不能站立；Ⅴ級：翻正反射消失（Loss of righting reflex，LORR）但對疼痛刺激有肢體回縮反應；Ⅵ級：對任何刺激無反應。其中Ⅴ、Ⅵ級被認為是昏迷狀態(tài)［8］。本實驗中，我們以LORR作為昏迷的判別標準。

4 安放腦電皮層電極及側腦室套管 腹腔注射4%戊巴比妥鈉（30mg／kg）麻醉大鼠后，安裝頭部電極和側腦室金屬套管，額葉電極：前囟前2mm，中線左旁開2mm；雙頂葉電極：中線左、右旁開4mm，前囟后6mm，深度（約0.7～1.0mm）觸及硬腦膜。埋置側腦室金屬套管參照Paxinos-Watson圖譜，中線旁1.5mm，前囟后1.5mm，深度3.0mm，自制套管直徑0.8mm。電極安放后，大鼠飼養(yǎng)2周。進行皮層腦電圖記錄時，將腦皮層電極導線連接到RM6240生理信號采集處理系統(tǒng)。記錄腦電圖，以δ波所占腦電波比例多少作為昏迷深度的判別指標。隨著昏迷深度增加，δ波所占腦電波的百分比增加。將給藥前δ波所占的百分比標準化為1，根據(jù)δ波百分比變化判斷給藥是否加深或減輕昏迷。

5 給藥方式 大鼠翻正反射消失后，各組均通過側腦室埋置的金屬套管微注射實驗藥物。對照組腦室注入 ACSF10μl；Orexin-A 組腦室注入 Orexin-A10μl（4nmol／10μl）；阻斷劑組腦室注入 Ritanserin 40μg／10μl；阻斷劑+Orexin-A組腦室注入Ritanserin 40μg／5μl后注入 Orexin-A5μl（4nmol／5μl）。

6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，所有計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，組間不同時間點比較采用重復測量方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 側腦室不同給藥對酒精性昏迷大鼠LORR持續(xù)時間的影響 同對照組相比，給Orexin-A后LORR持續(xù)時間明顯縮短（2.90±0.30、1.85±0.35，P＜0.01）；而給5-羥色胺（5-HT2）受體阻斷劑利坦色林后，LORR持續(xù)時間明顯延長（2.90±0.30、4.47±0.49，P＜0.01）；在預先給予利坦色林處理然后再給Orexin-A，與對照組相比，LORR持續(xù)時間無明顯縮短（2.90±0.30、3.11±0.48，P＞0.05），與 Orexin-A組比較LORR持續(xù)時間則明顯延長（P＜0.01）。見圖1。

側腦室不同給藥對酒精昏迷大鼠LORR持續(xù)時間影響

2 側腦室給藥后不同時間對酒精性昏迷大鼠ECoG中δ波比例的影響 對照組（人工腦脊液）隨著給藥時間延長，δ波相對百分比逐漸下降；同對照組相比，給Orexin-A后大鼠δ波相對百分比下降速率顯著加快（P＜0.01）；給予利坦色林組大鼠，5min后δ波相對百分比卻明顯升高（96.46±6.55、118.89±7.60，P＜0.01）；此外，先給利坦色林預處理然后再給Orexin-A，δ波相對百分比與對照組相比無明顯差異（P＞0.05），但與Orexin-A組比較差異顯著（P＜0.01）。見圖2。

圖2 側腦室給藥后不同時間對酒精昏迷大鼠ECoG中δ波比例的影響

討 論

昏迷的促醒治療具有重要的臨床意義。昏迷是覺醒系統(tǒng)結構受損或功能受抑所致［9］。傳統(tǒng)觀點認為，覺醒系統(tǒng)即是指腦干上行網(wǎng)狀激活系統(tǒng)。Orexins的發(fā)現(xiàn)是一個里程碑。目前觀點認為，下丘腦外側區(qū)的覺醒肽Orexins直接調節(jié)和影響著上行網(wǎng)狀激活系統(tǒng)的功能，被稱為機體的“覺醒啟動區(qū)”［9-10］。是調節(jié)睡眠和覺醒的關鍵神經(jīng)元。賈曉軍研究發(fā)現(xiàn)其不僅可調節(jié)睡眠覺醒，還可對昏迷起促醒作用。本研究進一步探討其促醒機制。

5-羥色胺是傳統(tǒng)的興奮性神經(jīng)遞質。5-羥色胺能神經(jīng)元主要存在于低位腦干，其中中背縫核內（DR）是5-HT相對集中區(qū)。中背縫核同時也是重要的覺醒區(qū)域。Sakai等［11］運用在體單細胞神經(jīng)元放電記錄方法研究發(fā)現(xiàn)覺醒期間5-HT能神經(jīng)元放電活躍，而在慢波睡眠（SWS）期開始減少；Portas等［12］運用微量滲透方法研究發(fā)現(xiàn)腦中5-HT及其代謝產(chǎn)物含量在清醒期明顯升高。并發(fā)現(xiàn)5-HT與睡眠有著密切的關系，覺醒時5-HT系統(tǒng)激活，功能增高，睡眠時5-HT能系統(tǒng)功能降低，快眼動（REM）睡眠時最低。上述結果均提示5-HT與覺醒有關。Orexins神經(jīng)元僅分布于下丘腦外側區(qū)（LHA），但Orexins神經(jīng)元纖維投射到上行激動系統(tǒng)的廣泛區(qū)域，既往人們已認識到睡眠和覺醒之間的轉換是由單胺能（組胺，5-羥色胺，去甲腎上腺素）等興奮性神經(jīng)遞質和腺苷、P物質、GABA能抑制性神經(jīng)遞質等相互作用調節(jié)，但他們受何精確調節(jié)而實現(xiàn)睡眠和覺醒的轉換無法認知。Orexins的發(fā)現(xiàn)使人們認識到它的覺醒調節(jié)啟動作用，以及這些遞質與Orexins的關系。

近期研究發(fā)現(xiàn)Orexins的覺醒機制與傳統(tǒng)的興奮性單胺能神經(jīng)遞質（5-羥色胺、組胺、5-HT）相關［3］。Wang等［13］通過免疫組化研究發(fā)現(xiàn)，背縫核的5-羥色胺能神經(jīng)元活性受到Orexins系統(tǒng)的支配，Orexin-A通過Orexin-1受體對5-羥色胺能神經(jīng)元起到調節(jié)作用。最近有實驗發(fā)現(xiàn)［14］，Orexin-A對麻醉大鼠具有促醒效應，這主要是通過5-羥色胺能神經(jīng)元在快眼動睡眠及慢波睡眠期作用放電頻率增加實現(xiàn)的。上述研究結果證明Orexins對覺醒的促醒作用機制與5-羥色胺能系統(tǒng)有關。然而，Orexins對酒精性昏迷——這一臨床常見昏迷的促醒機制是否也與興奮單胺能神經(jīng)系統(tǒng)（如5-羥色胺）相關？本研究針對這一問題進行了實驗論證。實驗運用兩種經(jīng)典的監(jiān)測手段——翻正反射消失（LORR）持續(xù)時間和皮層腦電圖來評判實驗大鼠的意識狀態(tài)［14］。其中，皮層腦電圖可連續(xù)監(jiān)測皮層腦電活動狀況，且振幅比頭皮腦電圖大10倍，靈敏度高?；杳詴r皮層腦區(qū)電活動頻率減慢、δ波所占比例明顯增加。采用向側腦室內給予5-羥色胺（5-HT2）受體阻斷劑利坦色林阻斷5-羥色胺能系統(tǒng)的激活，觀察對Orexin-A逆轉酒精性昏迷作用的影響。研究發(fā)現(xiàn)，與給予Orexin-A的促醒作用相反，給予5-羥色胺（5-HT2）受體阻斷劑利坦色林組大鼠，與對照組（人工腦脊液）比較，5min后δ波相對百分比明顯升高，并持續(xù)30min以上（圖2），LORR持續(xù)時間亦顯著延長（圖1），提示阻斷5-羥色胺遞質的作用可顯著加深昏迷的程度。進一步研究發(fā)現(xiàn)，先給予利坦色林預處理然后再給Orexin-A，與對照組相比，δ波比例并沒有因Orexin-A而降低，LORR持續(xù)時間亦并沒有因Orexin-A的興奮性作用而縮短，Orexin-A的興奮作用被利坦色林阻斷。此結果提示5-羥色胺能系統(tǒng)的激活是Orexin-A對酒精性昏迷大鼠促醒的重要作用機制之一。

綜上，Orexin-A對酒精性昏迷大鼠有良好的促醒作用。其促醒作用機制，與5-羥色胺能系統(tǒng)的激活相關，為臨床昏迷的促醒研究及促醒藥物研制等提供了新線索。

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