重度子癇前期患者胎盤組織中Wnt1的表達(dá)*

張 展，李 鶴，張琳琳，賈莉婷，王 鵬

1)鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院檢驗科 鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科 鄭州 450052

子癇前期是一種常見的人類妊娠期特有疾病，它屬于妊娠期高血壓疾病的一種，其發(fā)病率國內(nèi)報道為9.4%,國外報道為7%～12%[1]，可引起嚴(yán)重的母兒并發(fā)癥，是導(dǎo)致孕產(chǎn)婦和圍生兒死亡的主要原因之一[2-3]。胎盤是母胎接觸面，臨床觀察發(fā)現(xiàn)在妊娠結(jié)束胎盤娩出后，子癇前期的病情可得到迅速控制，所以不少學(xué)者[4]認(rèn)為，子癇前期的發(fā)病與胎盤功能失調(diào)密切相關(guān)。滋養(yǎng)細(xì)胞是胎盤的主要細(xì)胞類型，其正常分化、增殖、凋亡、遷移和浸潤能力是胚胎著床及胎盤形成的關(guān)鍵。而滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲不足，胎盤組織凋亡導(dǎo)致胎盤淺著床及胎盤著床部位子宮螺旋動脈重鑄障礙，是子癇前期發(fā)病的關(guān)鍵[5-6]。Wnt信號傳導(dǎo)通路是調(diào)控細(xì)胞生長發(fā)育和分化的關(guān)鍵途徑之一[7]。Wnt1是Wnt經(jīng)典通路的始動因子之一，在多種惡性腫瘤組織中高表達(dá)，參與腫瘤的形成[8]。最近研究[9-12]發(fā)現(xiàn)Wnt信號通路在滋養(yǎng)細(xì)胞分化及侵襲過程中也起到了重要作用。而該通路是否參與了子癇前期的發(fā)病過程，以及在子癇前期發(fā)病過程中作用的相關(guān)研究還鮮有報道。該研究通過檢測重度子癇前期及正常孕婦妊娠晚期胎盤組織中Wnt1的表達(dá)情況，初步探討Wnt1在重度子癇前期發(fā)病過程中的作用。

1 對象與方法

1.1研究對象選擇2010年1月至2011年12月在鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院產(chǎn)科住院，臨床確診為重度子癇前期的患者30例作為病例組(sPE組)，患者年齡20～38(29.2±5.5)歲，孕(36.6±1.1)周，重度子癇前期診斷標(biāo)準(zhǔn)參照人民衛(wèi)生出版社出版的第7版《婦產(chǎn)科學(xué)》[13]。同期選取行擇期剖宮產(chǎn)的正常晚孕孕產(chǎn)婦30例為正常對照組(N組)，孕產(chǎn)婦年齡23～37(30.7±3.4)歲，孕(37.2±1.0)周。2組孕產(chǎn)婦均為單活胎、剖宮產(chǎn)，既往均無高血壓病、糖尿病、腎病、抗磷脂綜合征、多囊卵巢綜合征以及其他妊娠合并癥病史。

1.2主要試劑Trizol為Invitrogen公司產(chǎn)品，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自大連寶生物工程有限公司，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，UltraSYBR Mixture(With ROX)試劑購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，兔抗人Wnt1多克隆抗體購自Abcam公司，兔抗人β-actin多克隆抗體購自博奧森生物技術(shù)有限公司，辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司，Pro-light HRP化學(xué)發(fā)光檢測試劑購自天根生化科技有限公司，免疫組化二步法試劑盒及濃縮型DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3標(biāo)本采集經(jīng)孕產(chǎn)婦知情同意，在胎盤娩出后15 min內(nèi)避開胎盤邊緣及鈣化、出血、壞死處，分別于胎盤母體面3、6、9、12點處以及中心位置取5塊胎盤全層組織，大小約2 cm×2 cm×1 cm，無菌濾紙反復(fù)吸取組織上的血液，取下的胎盤組織一部分放入體積分?jǐn)?shù)10%的甲醛溶液中固定備用，剩余的組織分裝入無菌凍存管后迅速放入液氮罐內(nèi)，然后置于-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4胎盤組織中Wnt1mRNA表達(dá)的檢測在液氮預(yù)冷的研缽中加入100 mg胎盤組織研磨至粉末狀，Trizol法提取胎盤組織總RNA。10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測所提RNA質(zhì)量，將所提RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，-80 ℃凍存?zhèn)溆?。Wnt1上游引物序列5’-TCCTCCAC GAACCTGCTTAC-3’，下游引物序列5’-CGGATTTTG GCGTATCAGAC-3’，擴(kuò)增片段大小為105 bp；GAPDH上游引物序列5’-TCGTGGAAGGACTCATGACC-3’，下游引物序列5’-AGGGATGATGTTCTGGAGAG-3’，擴(kuò)增片段大小為116 bp。按照熒光定量PCR試劑盒反應(yīng)說明書配制反應(yīng)體系，總體積為20 μL。陰性對照以RNase-free H2O代替cDNA模板，加樣至96孔板中，每個樣品均設(shè)2個復(fù)孔，上Real-time PCR 儀反應(yīng)，反應(yīng)條件為95 ℃ 10 min，95 ℃ 20 s，60 ℃ 1 min，35個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后記錄擴(kuò)增曲線及熔解曲線。根據(jù)擴(kuò)增曲線可得到擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到設(shè)定閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)(Ct)，采用2-ΔΔCt方法[14]分析Wnt1 mRNA相對表達(dá)量。

1.5免疫組化二步法檢測胎盤組織中Wnt1蛋白的表達(dá)情況石蠟包埋的胎盤組織切片，厚度約4 μm且包含母體面至胎兒面全層。操作步驟按免疫組化PV二步法試劑盒說明書進(jìn)行， Wnt1一抗按照1︰100稀釋，DAB顯色。再經(jīng)蘇木素復(fù)染、鹽酸乙醇分化，梯度乙醇脫水、二甲苯透明，中性樹膠封固晾干后在顯微鏡下觀察。用PBS代替一抗作為陰性對照，以胎盤組織中細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞間質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃或棕褐色著色為陽性顯色。采用半定量積分法。染色強(qiáng)度評分：無著色0分，淺黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分。每張切片在高倍鏡(×400)下選擇5個視野，每個視野計數(shù)100個細(xì)胞，按陽性細(xì)胞所占百分比評分：<20%1分，20%～2分，40%～3分，65%～4分。結(jié)果取2項評分的乘積，<3分為陰性，≥3分為陽性。

1.6蛋白印跡法檢測胎盤組織中Wnt1蛋白的表達(dá)情況使用RIPA細(xì)胞裂解液及PMSF裂解胎盤組織，提取組織中總蛋白，BCA法測定蛋白濃度后-80 ℃凍存?zhèn)溆谩Ｈ?00 μg總蛋白，100 ℃變性后上樣，使用100 g/L分離膠、50 g/L積層膠進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(NC膜)，使用脫脂奶粉37 ℃封閉NC膜1 h，加入一抗4 ℃孵育過夜，Wnt1一抗稀釋比例1︰100，β-actin為1︰1 000，一抗孵育完畢TBST洗10 min×3次后加入二抗37 ℃孵育1 h，TBST洗膜10 min×3次后加增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光顯色液，暗室內(nèi)曝光顯影，膠片晾干后拍照，使用Image J測灰度值，以目的蛋白條帶與β-actin條帶灰度值比值作為目的蛋白的相對表達(dá)水平。

1.7統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。2組胎盤組織中Wnt1 mRNA及蛋白相對表達(dá)水平的比較采用兩獨立樣本的t檢驗， 2組胎盤組織中Wnt1蛋白在合體滋養(yǎng)層細(xì)胞及絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞中的陽性表達(dá)率的比較采用χ2檢驗。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 2組胎盤組織中Wnt1mRNA的表達(dá)2組孕產(chǎn)婦胎盤組織中均可檢測到Wnt1 mRNA的表達(dá)，sPE組Wnt1 mRNA表達(dá)水平低于N組，見表1。

2.2 2組胎盤組織中Wnt1蛋白表達(dá)的定位Wnt1蛋白主要表達(dá)在胎盤合體滋養(yǎng)層細(xì)胞上，此外其在侵入底蛻膜的絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞上也有表達(dá)，免疫組化結(jié)果顯示合體滋養(yǎng)層細(xì)胞及絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色著色。Wnt1蛋白在2組胎盤組織中均有表達(dá)(圖1)。2組胎盤組織中Wnt1蛋白在合體滋養(yǎng)層細(xì)胞及絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞中的陽性表達(dá)率比較見表2。

圖1 Wnt1蛋白在胎盤合體滋養(yǎng)層細(xì)胞及絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞上的表達(dá)(PV二步法，×200)

表1 2組胎盤組織中Wnt1mRNA和蛋白的相對表達(dá)量比較

表2Wnt1蛋白在合體滋養(yǎng)層
細(xì)胞及絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞的表達(dá)

陽性例數(shù)(%)

2.3 2組胎盤組織中Wnt1蛋白相對表達(dá)量比較

2組孕產(chǎn)婦胎盤組織中均可檢測到Wnt1蛋白的表達(dá)，且sPE組Wnt1蛋白相對表達(dá)量低于N組，見圖2及表1。

圖2 2組胎盤組織中Wnt1蛋白的表達(dá)

3 討論

3.1Wnt信號通路在妊娠過程中的作用有學(xué)者[6]利用半定量PCR技術(shù)檢測了所有已知的Wnt配體及其卷曲受體在人胎盤組織及不同階段的滋養(yǎng)細(xì)胞系中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)19種已知Wnt配體中的14種及10種已知卷曲受體中的8種在胎盤組織中都有表達(dá)，且其表達(dá)特性會隨著孕齡及滋養(yǎng)細(xì)胞系類型不同發(fā)生變化。Wnt信號通路的另一種配體Wnt3a可刺激滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲和遷移過基底膜基質(zhì)，這提示了Wnt信號通路可能參與了滋養(yǎng)細(xì)胞增殖、分化、侵襲、遷移的過程，該通路過度激活可能導(dǎo)致滋養(yǎng)細(xì)胞過度增生和局部侵犯[7]。Wnt信號通路作為調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞及胎盤定植過程的重要通路之一，在妊娠過程中起重要作用，而子癇前期是妊娠期特有的疾病，滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲力下降，凋亡增加，胎盤血管重鑄障礙，胎盤功能紊亂從而導(dǎo)致子癇前期的發(fā)病。

3.2Wnt1與子癇前期發(fā)病的關(guān)系Wnt1基因定位于人類12q13染色體上，它是Wnt信號通路的始動因子，其通過激活Wnt/β-catenin經(jīng)典通路來抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞侵襲及血管生成等作用參與腫瘤的形成。在不同的人類癌癥細(xì)胞系中(包括乳癌、間皮瘤、非小細(xì)胞肺癌、肉瘤)應(yīng)用Wnt1的單克隆抗體和RNAi抑制Wnt1的功能，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡增加，故可以推測Wnt1可以抑制細(xì)胞凋亡[15]。將血管內(nèi)皮細(xì)胞放在含有Wnt1的培養(yǎng)基培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞的Wnt經(jīng)典信號通路活化，細(xì)胞增殖及毛細(xì)血管穩(wěn)定性加強(qiáng)[16]。Wnt1的表達(dá)可促進(jìn)毛細(xì)血管樣網(wǎng)絡(luò)的形成，IL-8作為一種血管生成因子，是Wnt信號通路在血管內(nèi)皮細(xì)胞作用的靶點，Wnt1可誘導(dǎo)IL-8的轉(zhuǎn)錄和分泌[17]。最近發(fā)現(xiàn)Wnt1在體外培養(yǎng)的人類早孕及晚孕期滋養(yǎng)細(xì)胞及纖維母細(xì)胞、早孕期絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞、早孕及晚孕期胎盤組織中均有表達(dá)，而在具有絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞特性的SGHPL-5 細(xì)胞系和JEG-3 絨毛膜癌細(xì)胞系中不表達(dá)[9]。

該研究發(fā)現(xiàn)，sPE組及N組孕產(chǎn)婦晚孕期胎盤組織中均可檢測到Wnt1 mRNA表達(dá)，這與以往報道[12]一致。作者比較了2組胎盤組織中Wnt1 mRNA及蛋白的表達(dá)水平，sPE組Wnt1 mRNA及蛋白表達(dá)水平均低于N組。由此推測，Wnt1 mRNA及蛋白表達(dá)水平下降，有可能影響到了滋養(yǎng)細(xì)胞正常功能，導(dǎo)致滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡增加，增殖、侵襲、遷移能力下降，胎盤淺著床進(jìn)而導(dǎo)致子癇前期的發(fā)生。另外該研究還發(fā)現(xiàn)，Wnt1蛋白主要表達(dá)在胎盤合體滋養(yǎng)層細(xì)胞上，此外其在侵入底蛻膜的絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞上也有表達(dá)。早期胎盤發(fā)育需要更多的母體血液供應(yīng)，這種需要最終通過對母體子宮螺旋動脈的廣泛重塑來完成。血管重塑需依靠一種具有類似腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞來完成，而很多子癇前期病例中，滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲性下降，螺旋動脈重塑不足，以致胎盤循環(huán)量太小[18-20]。而該研究發(fā)現(xiàn)， Wnt1蛋白在sPE組合體滋養(yǎng)層細(xì)胞和絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞中的陽性表達(dá)率均低于N組，進(jìn)一步提示W(wǎng)nt1可能是通過影響滋養(yǎng)細(xì)胞功能來參與子癇前期的發(fā)病。

3.3結(jié)論總之，子癇前期是一個多因素參與的復(fù)雜的病變過程，而該研究提示，胎盤組織中Wnt1的表達(dá)量下降可能參與了子癇前期的發(fā)病過程。當(dāng)然，早孕、中孕期胎盤組織中Wnt1的表達(dá)情況及完整的Wnt通路在子癇前期中發(fā)揮的作用還有待進(jìn)一步研究。

[1] 冷雪梅.78例重癥妊娠高血壓疾病患者妊娠結(jié)局分析[J].吉林大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版,2008,34(4):593

[2] 李留霞,吳改英,王寧,等.子癇前期患者胎盤組織中內(nèi)皮分化基因2的表達(dá)[J].鄭州大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版,2012,47(4):497

[3] 陳麗紅,邱中原,胡繼芬.子癇前期患者胎盤中p38MAPK及COX-2的表達(dá)及意義[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,2012,34(6):521

[4] 李雪蘭,李春芳,王少麗,等.survivin蛋白及其mRNA在子癇前期患者胎盤中的表達(dá)[J].西安交通大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版,2010,31(5):631

[5] Pennington KA, Schlitt JM, Jackson DL, et al. Preeclampsia: multiple approaches for a multifactorial disease[J]. Dis Model Mech, 2012, 5(1):9

[6]Niehrs C, Acebron SP. Wnt signaling: multivesicular bodies hold GSK3 captive[J]. Cell, 2010, 143(7):1044

[7] MacDonald BT, Tamai K, He X. Wnt/beta-catenin signaling: components, mechanisms, and diseases[J]. Dev Cell, 2009, 17(1):9

[8] Korzh V. Winding roots of Wnts[J]. Zebrafish, 2008, 5(3):159

[9] Sonderegger S, Husslein H, Leisser C, et al. Complex expression pattern of Wnt ligands and frizzled receptors in human placenta and its trophoblast subtypes[J].Placenta, 2007, 28(Suppl A):S97

[10]Pollheimer J, Loregger T, Sonderegger S, et al. Activation of the canonical wingless/T-cell factor signaling pathway promotes invasive differentiation of human trophoblast[J]. Am J Pathol, 2006, 168(4):1134

[11]Fitzgerald JS, Germeyer A, Huppertz B, et al. Governing the invasive trophoblast: current aspects on intra- and extracellular regulation[J]. Am J Reprod Immunol, 2010, 63(6):492

[12]Sonderegger S, Pollheimer J, Knofler M. Wnt signalling in implantation, decidualisation and placental differentiation-review[J]. Placenta, 2010, 31(10):839

[13]樂杰.婦產(chǎn)科學(xué)[M].7版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2008:92

[14]Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCTmethod[J].Methods, 2001, 25(4): 402

[15]He B, You L, Uematsu K, et al. A monoclonal antibody against Wnt-1 induces apoptosis in human cancer cells[J]. Neoplasia, 2004, 6(1):7

[16]Goodwin AM, Kitajewski J, D' Amore PA. Wnt1 and Wnt5a affect endothelial proliferation and capillary length; Wnt2 does not[J]. Growth Factors, 2007, 25(1):25

[17]Masckauchan TN, Shawber CJ, Funahashi Y, et al. Wnt/beta-catenin signaling induces proliferation, survival and interleukin-8 in human endothelial cells [J]. Angiogenesis,2005,8(1):43

[18]楊博萍，韓健，韓新美,等.重度子癇前期胎盤合體滋養(yǎng)細(xì)胞微絨毛膜脫落與Rho/ROCK分子表達(dá)的關(guān)系[J].解放軍醫(yī)學(xué)雜志,2012，37(3):190

[19]劉大艷，陳士嶺，王晨虹，等.早發(fā)型與晚發(fā)型重度子癇前期患者絨毛組織代謝足跡差異的研究[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2011，31(9)：1547

[20]馮亞玲，梁小勤，周昌菊.Rho-GDI在子癇前期蛻膜組織中的表達(dá)及其意義[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2011，31(1)：167