小RNA技術(shù)干擾p21聯(lián)合環(huán)磷酰胺對(duì)HepG2細(xì)胞增殖及凋亡的影響

劉紅云，包永芬，單士剛

(1湖北科技學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)免疫學(xué)教研室，咸寧 437100;2湖北科技學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)微生物學(xué)教研室;3湖北科技學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)與遺傳學(xué)教研室;*通訊作者，E-mail:ssgang121@163.com)

P21蛋白是調(diào)控細(xì)胞周期的抑制蛋白，在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖中起非常重要的作用，其基因缺失、失活與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后有關(guān)［1］。近年來(lái)，在癌癥治療當(dāng)中使用的很多新型抗癌藥物、放射療法、基因療法等都與p21有著密切的聯(lián)系，比如:在驗(yàn)證p21基因高表達(dá)的人胃癌細(xì)胞系對(duì)化療藥物的敏感性實(shí)驗(yàn)中，p21基因可提高靶細(xì)胞對(duì)5-FU的敏感性［2］。癌癥的發(fā)生、發(fā)展是癌基因的激活和/或抑癌基因失活的結(jié)果，是多因素、多基因參與引起的，抑癌基因在此起到負(fù)性調(diào)控的作用。而且，p21基因表達(dá)與否與肝細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)性尚需完善。鑒于此，本研究通過(guò)小RNA干擾技術(shù)抑制肝癌細(xì)胞系HepG2中p21基因的表達(dá)，同時(shí)聯(lián)合化療藥物環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide，CTX)觀察其聯(lián)合作用對(duì)HepG2細(xì)胞增殖及細(xì)胞凋亡效應(yīng)的影響，為臨床應(yīng)用提供理論線索。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株和試劑

人肝癌細(xì)胞系HepG2購(gòu)買(mǎi)于武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基為美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品。CTX和四甲基氮唑藍(lán)(methythiazoletrazolium，MTT)購(gòu)自美國(guó) Sigma公司。p21基因siRNA序列由上海生物工程有限公司設(shè)計(jì)并合成。細(xì)胞裂解液、caspase-3、caspase-9和caspase-6活性檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自美國(guó)R＆D公司。細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒為杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。小鼠抗人β－actin一抗、小鼠抗人p21一抗和羊抗鼠二抗均購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HepG2細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化傳代后在含5%CO2的37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每2 d傳代一次。

1.2.2 小RNA對(duì)p21的抑制作用 采用Western blot方法檢測(cè)P21蛋白表達(dá)情況。選處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液(3.0×105/ml)接種在24孔培養(yǎng)板中，每孔1 ml細(xì)胞懸液，待細(xì)胞貼壁后，參照轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行RNA干擾實(shí)驗(yàn)，設(shè)3個(gè)實(shí)驗(yàn)組:空白對(duì)照組(不加小RNA序列);小RNA處理組(加小RNA序列);陰性對(duì)照組(加陰性對(duì)照小RNA)。轉(zhuǎn)染36 h后收集HepG2細(xì)胞。在上述三組細(xì)胞中加入150μl細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞后，按照試劑盒要求提取總蛋白，制作聚丙烯酰胺濃縮膠和分離膠，取不同組別的等量蛋白樣品進(jìn)行電泳，然后依次轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗二抗孵育和洗滌(其中一抗稀釋濃度為1∶400;二抗稀釋濃度為1∶5 000)后，ECL顯色曝光并通過(guò)X線膠片曝光洗片，經(jīng)自動(dòng)電泳凝膠分析系統(tǒng)掃描并測(cè)定各組蛋白條帶的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3 MTT試驗(yàn) 選處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液，以每孔3.0×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板。CTX濃度參考本課題組預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選用10μg/L。細(xì)胞隨機(jī)分成5組:①空白對(duì)照組;②陰性對(duì)照組(陰性小RNA序列);③干擾組(加p21小RNA序列);④CTX組(2 mg/L CTX處理);⑤聯(lián)合組(p21小RNA序列+10μg/L CTX處理)，每孔細(xì)胞設(shè)8個(gè)復(fù)孔。按文獻(xiàn)［2］所述實(shí)驗(yàn)步驟，在處理24 h后，測(cè)定540 nm處的吸光度OD值，計(jì)算細(xì)胞增殖百分率［實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值×100%］。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況 HepG2細(xì)胞按1.2.3所述方法處理24 h后，常規(guī)洗滌消化，離心收集細(xì)胞制備成濃度為5.0×106/ml單細(xì)胞懸液，取 100μl細(xì)胞懸液，加入 400μl 1×Binding Buffer重懸細(xì)胞，分別加入5μl AnnexinⅤ-FITC和10μl PI混勻，室溫避光孵育30 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡變化情況。

1.2.5 采用Elisa方法測(cè)定HepG2細(xì)胞caspase-3、caspase-9和caspase-6活性 HepG2細(xì)胞按1.2.3所述方法處理24 h后，按照1.2.2所述方法提取總蛋白，caspase-3、caspase-9和caspase-6活性具體檢測(cè)方法參照試劑盒說(shuō)明書(shū)的描述進(jìn)行。測(cè)定實(shí)驗(yàn)體系在405 nm處的吸光度OD值，確定各組細(xì)胞中caspase-3、caspase-9和caspase-6的活化水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所獲數(shù)據(jù)均采用SPSS13.0版軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，組間均數(shù)比較用方差分析和t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 p21靶向小RNA序列對(duì)HepG2細(xì)胞p21的沉默效率

Western blot結(jié)果表明，小RNA干擾組P21蛋白表達(dá)水平顯著低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組(P＜0.01);而陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組P21蛋白表達(dá)水平比較則差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，見(jiàn)圖1)。

圖1 Western blot檢測(cè)HepG2細(xì)胞中P21蛋白表達(dá)Figure 1 Expression of P21 protein in HepG2 cells by Western blot

2.2 細(xì)胞增殖率檢測(cè)結(jié)果

相對(duì)于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，干擾組、CTX組和聯(lián)合組細(xì)胞增殖率顯著降低(P＜0.01);同時(shí)，聯(lián)合組細(xì)胞增殖率相對(duì)于CTX組亦明顯降低(P＜0.01，見(jiàn)圖2)。

2.3 細(xì)胞凋亡分析結(jié)果

相對(duì)于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，干擾組、CTX組和聯(lián)合組凋亡細(xì)胞百分率顯著升高(P＜0.01);同時(shí)，聯(lián)合組凋亡細(xì)胞百分率相對(duì)于CTX組亦顯著升高(P＜0.01，見(jiàn)圖3)。

圖2 經(jīng)不同處理后HepG2細(xì)胞增殖率變化(±s).Figure 2 Changes of HepG2 cell proliferation after different treatments(±s)

圖3 經(jīng)不同處理方式后HepG2細(xì)胞凋亡百分比變化(±s)Figure 3 Changes of HepG2 cell apoptosis after different treatments(±s)

2.4 caspase-3、caspase-9 和caspase-6 活化程度變化

相對(duì)于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，干擾組、CTX組和聯(lián)合組細(xì)胞中caspase-3、caspase-9和caspase-6活化程度均有顯著升高(P＜0.01);同時(shí)，聯(lián)合組細(xì)胞中caspase-3、caspase-9和caspase-6活化程度亦明顯高于CTX組(P＜0.01，見(jiàn)表1)。

3 討論

表1 不同處理方式對(duì)HepG2中caspase-3、caspase-9和caspase-6活性的影響(±s，n=3)Table 1 Changes of activities of caspase-3，caspase-6 and caspase-9 in Hep G2 cells after different treatments(±s，n=3)

表1 不同處理方式對(duì)HepG2中caspase-3、caspase-9和caspase-6活性的影響(±s，n=3)Table 1 Changes of activities of caspase-3，caspase-6 and caspase-9 in Hep G2 cells after different treatments(±s，n=3)

與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組比較，*P＜0.01;與 CTX組比較，#P＜0.01

干擾組CTX 組 8.560 9±0.45* 6.923 1±0.30* 5.265 1±0.15*聯(lián)合組 10.281 9±0.23*#7.624 1±0.14*#6.016 2±0.25*#

DNA損傷引發(fā)的細(xì)胞凋亡是目前臨床應(yīng)用DNA烷化劑類(lèi)化療藥物發(fā)揮抗癌作用的普遍分子機(jī)制［3］。當(dāng)DNA損傷可激活抑癌基因p53，活化的p53可以在轉(zhuǎn)錄水平啟動(dòng)p21的表達(dá)，作為細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶抑制因子p21可以通過(guò)抑制細(xì)胞周期中DNA的合成過(guò)程，使細(xì)胞周期阻滯在S期，進(jìn)而使受損細(xì)胞有充分的時(shí)間完成DNA修復(fù)，如修復(fù)不完全，細(xì)胞則通過(guò)啟動(dòng)程序性細(xì)胞死亡即凋亡來(lái)防止受損DNA 傳遞到下一代［4，5］。因此，我們?cè)O(shè)想通過(guò)小RNA干擾技術(shù)抑制p21基因，使細(xì)胞周期調(diào)節(jié)通路p53-p21受阻，導(dǎo)致受損細(xì)胞無(wú)法及時(shí)完成DNA修復(fù)進(jìn)而增強(qiáng)其對(duì)化療藥物的敏感性。

本實(shí)驗(yàn)以肝癌細(xì)胞HepG2為研究對(duì)象，觀察p21沉默聯(lián)合CTX處理對(duì)HepG2細(xì)胞的生物學(xué)作用，檢驗(yàn)p21沉默在肝癌治療中的作用及可行性。細(xì)胞增殖率和流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，相對(duì)于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，干擾組、CTX組和聯(lián)合組細(xì)胞凋亡率顯著上升，同時(shí)，聯(lián)合組細(xì)胞凋亡率亦明顯高于CTX組，提示在本研究中，p21沉默和CTX處理兩者聯(lián)合應(yīng)用有明顯的協(xié)同作用。caspase家族成員是啟動(dòng)和執(zhí)行哺乳動(dòng)物細(xì)胞凋亡關(guān)鍵蛋白因子，細(xì)胞凋亡發(fā)生時(shí)，caspase-9為凋亡始動(dòng)因子，可以在其他凋亡因子參與下發(fā)生自我活化并激活下游凋亡執(zhí)行因子caspase-3和caspase-6，后者則作用于特異性底物使細(xì)胞發(fā)生生化及形態(tài)學(xué)改變，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［6］。本研究表明，相對(duì)于 CTX組，p21小 RNA序列聯(lián)合 CTX處理可明顯增強(qiáng) HepG2細(xì)胞中caspase-9、caspase-3和caspase-6的活化程度，又由于caspase-9是線粒體依賴性細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵細(xì)胞因子［6］，提示線粒體在p21沉默對(duì)細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

綜上所述，本研究通過(guò)針對(duì)p21基因的小RNA序列有效地抑制了HepG2細(xì)胞中p21基因的表達(dá)，阻礙DNA損傷修復(fù)過(guò)程，而達(dá)到促進(jìn)HepG2細(xì)胞凋亡的作用。因此，p21基因沉默結(jié)合傳統(tǒng)化療可能在肝癌的治療中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

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