趨化因子配體及其抗體對(duì)骨癌痛患者脊髓膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響及與骨癌痛的相關(guān)性

汪 洋 王家林 (第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院急診科，上海 200433)

趨化因子配體(CCL2)是一種趨化因子，它作為一種免疫因子參與炎癥反應(yīng)〔1〕，它可以參與疼痛的發(fā)生發(fā)展，但具體機(jī)制并不明確。在一些關(guān)于慢性神經(jīng)病病理性疼痛的研究發(fā)現(xiàn)，CCL2的受體CCR2于脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)廣泛表達(dá)，并能夠參與小膠質(zhì)細(xì)胞活化。小膠質(zhì)細(xì)胞是慢性疼痛發(fā)生的重要因素。本研究為分析骨癌痛患者CCL2對(duì)脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞的影響及骨癌痛的相關(guān)性，于骨癌痛患者髓鞘內(nèi)注射CCL2觀察其對(duì)患者機(jī)械痛敏感程度及小膠質(zhì)細(xì)胞活性影響。

1 材料與方法

1.1 一般資料 2008年12月至2011年12月我院收治的45例脛骨骨癌患者，隨機(jī)分為3組。組A，骨癌痛組15例;組B，骨癌痛+control IgG組15例;組C，骨癌痛+CCL2中和抗體組15例。均經(jīng)過影像學(xué)、病理學(xué)或活檢證實(shí)為骨癌，同時(shí)疼痛度超過Ⅲ級(jí)。病史不超過6個(gè)月。排除其他嚴(yán)重器質(zhì)性疾病。A組男9例，女6例，平均年齡(56.4±13.5)歲;B組男12例，女3例，平均年齡(54.5±10.5)歲;C組男10例，女5例，平均年齡(51.4±15.3)歲。所有患者年齡，性別，患病時(shí)間等基線資料差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。組間具有可比性(P＞0.05)。

1.2 方法 ①均進(jìn)行常規(guī)治療，組B每日于髓鞘內(nèi)注射control IgG(15 μg/15 μl)，組 C 注射 CCL2 中和抗體(劑量同上)，連續(xù)注射3 d。分別測(cè)定注射前1天，注射后6、10、15 d時(shí)各組機(jī)械痛敏閾值(PMWT)。于注射后15 d抽取L4～L5段脊髓測(cè)定其脊髓膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物(IBA-1)的平均光度值(MOD)。②機(jī)械痛敏閾值測(cè)定:使用VonFrey纖維絲采用上下法計(jì)算50%縮足閾值〔2〕。③免疫應(yīng)光學(xué)染色法:各組患者靜脈麻醉后抽取L4～L5段脊髓于4%的多聚甲醛中固定約5 h，溫度不超過5℃，而后靜置于30%的葡萄糖溶液中。冰凍切片25 μm，于PBS中沖洗15 min后于熒光封閉室內(nèi)放置2 h，取出后加入多克隆山羊抗人抗體Iba-1，于室溫4°下12 h，次日再用PBS沖洗15 min。熒光封片，顯微鏡下拍片。Image-proplus分析脊髓免疫陽性細(xì)胞平均光密度(MOD值)，判別方式〔3〕:①胞膜或胞質(zhì)出現(xiàn)綠色為陽性，無綠色則為陰性。②高倍聚焦顯微鏡下連續(xù)選5個(gè)不重疊的事業(yè)，測(cè)定陽性反應(yīng)細(xì)胞光密度的平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件。其中計(jì)量資料采用s的形式。3組間比較采用重復(fù)測(cè)量的方差分析，平均光密度采用單因素方差分析，兩兩組間比較采用Q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 3組機(jī)械痛敏閾值的比較 注射前，3組PMWT值水平比較無顯著差異(P＞0.05)，注射后，組A PMWT值無明顯改變(P＞0.05)，組B降低，組C較前2組PMWT值顯著升高(P＜0.05)。見表1。

表1 各組注射后機(jī)械痛敏閾值的比較( s，n=15)

表1 各組注射后機(jī)械痛敏閾值的比較( s，n=15)

與組C比較:1)P＜0.05

組別6 d 10 d 15 d組A 1.70±0.31 1.70±0.311) 1.75±0.221)組B 1.78±0.66 1.51±0.351) 1.13±0.121)組C 1.72±0.35 2.53±0.44 5.74±0.13

2.2 3組患者脊髓標(biāo)記物免疫熒光染色結(jié)果 注射后15 d，組A、B、C脊髓Iba-1標(biāo)記物的MOD值分別為152.4±10.3，150.5±10.4，75.5±3.5。組C MOD值顯著低于其他兩組水平(P＞0.05)。光學(xué)顯微鏡下觀察組C脊髓膠質(zhì)細(xì)胞顏色變淺，數(shù)量減少，熒光強(qiáng)度減弱。

3 討論

大量研究證明CCL2因子除了作用于免疫系統(tǒng)，參與免疫反應(yīng)外，于正常脊髓的初級(jí)傳入神經(jīng)元，小膠質(zhì)細(xì)胞，星形膠質(zhì)細(xì)胞中也廣泛表達(dá)。其受體CCR2主要表達(dá)于脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞。曾有學(xué)者將CCL2于正常大鼠髓鞘內(nèi)注射后發(fā)現(xiàn)可以引起大鼠機(jī)械痛覺過敏反應(yīng)，但若事先給予CCL2受體拮抗劑便能將這一疼痛反應(yīng)降低;一般性神經(jīng)病理性疼痛中，脊髓水平CCL2及CCR2水平明顯上升，但相應(yīng)的大鼠實(shí)驗(yàn)表明若于髓內(nèi)注射一定的CCL2中和抗體可以抑制疼痛發(fā)生〔3〕。故現(xiàn)階段越來越多的學(xué)者認(rèn)為CCL2及其受體CCR2是疼痛發(fā)生發(fā)展的重要相關(guān)因素。

在一項(xiàng)關(guān)于CCL2的研究發(fā)現(xiàn)〔4〕，將正常大鼠制作成為骨癌痛模型并于其髓鞘內(nèi)注射CCL2，可以引起脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，然而在注射CCL2后于鞘內(nèi)注射CCL2中和抗體可以使相應(yīng)活化的膠質(zhì)細(xì)胞抑制。這一研究表明在一些慢性神經(jīng)性疼痛中，CCL2可以通過脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞上的CCR2抗體發(fā)揮其抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化的作用。在骨癌痛的研究中均證實(shí)了脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞大量激活是引起患者疼痛的重要因素〔5〕，當(dāng)給予一定的小膠質(zhì)細(xì)胞抑制劑這一疼痛行為能夠顯著降低。

本研究證實(shí)了CCL2與其受體CCR2是調(diào)節(jié)痛敏的重要機(jī)制。CCL2中和抗體對(duì)疼痛的耐受程度增強(qiáng)，與此同時(shí)通過使用分子標(biāo)記物Iba-1，發(fā)現(xiàn)了注射CCL2中和抗體后患者脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞活化程度受到顯著的抑制同以往學(xué)者的研究類似。鞘內(nèi)注射CCL2中和抗體可以抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活性，減少疼痛對(duì)于患者生理刺激，逆轉(zhuǎn)疼痛。

1 許志亮，朱 珊，孟妍妍，等.趨化因子2對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7趨化活性及趨化因子5mRNA表達(dá)的影響〔J〕.中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2011;28(5):665-7.

2 王 瑩，管業(yè)秋，李文媛，等.神經(jīng)干細(xì)胞移植對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠CXC趨化因子1和2及其趨化因子受體2表達(dá)的影響〔J〕.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2012;29(1):13-7.

3 焦英甫.大鼠CFA炎癥模型中MCP-1對(duì)疼痛產(chǎn)生及維持的作用〔D〕.第二軍醫(yī)大學(xué)，2010.

4 鄒李晶.趨化因子MCP-1對(duì)辣椒素受體(TRPV1)功能的易化作用及其機(jī)制研究〔D〕.第二軍醫(yī)大學(xué)，2011.

5 徐幼苗，申 文，陳 晏，等.趨化因子CCL2中和抗體在大鼠脛骨癌痛治療中的作用〔J〕.臨床麻醉學(xué)雜志，2012;28(1):81-3.