KATP通道基因多態(tài)性與2型糖尿病及磺脲類藥物療效的相關(guān)性

邵 倩 班 博 施錦繡 張 梅 孫海玲 (山東大學(xué)研究生院，山東 濟(jì)南 500)

2型糖尿病(T2DM)是一種由遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的代謝性疾病，以胰島素分泌及(或)作用受損為特征。研究發(fā)現(xiàn)ATP敏感性鉀(KATP)通道在胰島素分泌中起著重要作用〔1〕，胰島β細(xì)胞膜上KATP通道是由磺脲類受體1(SUR1)及鉀離子內(nèi)向整流(Kir6.2)通道兩種亞單位組成的八聚體，是胰島素分泌的物質(zhì)基礎(chǔ)，通過將細(xì)胞膜電活動(dòng)與細(xì)胞代謝聯(lián)系起來，調(diào)控胰島素的分泌。此外，KATP通道還是磺脲類藥物作用的靶點(diǎn)〔2〕。SUR1由ABCC8基因編碼，Kir6.2由 KCNJ11基因編碼，目前ABCC8和KCNJ11基因已在包括亞洲人群在內(nèi)的多個(gè)種族進(jìn)行了廣泛研究，并且證明和T2DM有關(guān)〔3，4〕，但是尚不清楚這種相關(guān)性是否也影響磺脲類藥物療效。本研究主要探討在山東漢族人群中ABCC8、KCNJ11基因多態(tài)性與T2DM的相關(guān)性，并觀察與磺脲類藥物療效的相關(guān)性。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2010年10月至2012年7月山東地區(qū)漢族人共300例為研究對(duì)象，其中T2DM患者(T2DM組)200例(男105例，女95例);正常對(duì)照組(NC組)100例(男53例，女47例)，為與病人無血緣關(guān)系的血糖正常者。T2DM的診斷依據(jù)1999年WHO標(biāo)準(zhǔn);T2DM患者病例排除標(biāo)準(zhǔn):①糖尿病急性應(yīng)激狀態(tài)如急性心肌梗死、腦卒中、糖尿病酮癥酸中毒、糖尿病非酮癥高滲性昏迷等;②明顯的肝、腎功能異常者;③近期使用過影響肝、腎功能藥物者。所有對(duì)象在知情同意的情況下，簽署知情同意書。以磺脲類藥物是否有效，將200例T2DM患者分為(SFS)組86例(男42例、女44例)，有效組114例(男63例，女51例)。SFS標(biāo)準(zhǔn):曾經(jīng)有至少3個(gè)月初始使用磺脲類(或聯(lián)合二甲雙胍)的有效期，在適當(dāng)飲食、運(yùn)動(dòng)基礎(chǔ)上，磺脲類加至每日最大劑量〔如格列苯脲(優(yōu)降糖)15 mg、格列吡嗪(美吡達(dá))30 mg等〕，失效持續(xù)1～3個(gè)月，尚未使用INS，空腹血糖＞10.0 mmol/L，糖化血紅蛋白＞9.0%?；请孱愔委熡行?biāo)準(zhǔn):糖尿病飲食控制加磺脲類(或聯(lián)合二甲雙胍)空腹血糖＜9.0 mmol/L，糖化血紅蛋白＜8.4%。兩組胰島細(xì)胞表面抗體(ICA)、胰島素抗體(IAA)和谷氨酸脫羧酶抗體(GAD-Ab)均陰性。

1.2 研究方法

1.2.1 一般資料采集 收集所有入選對(duì)象的基本資料，包括年齡、性別、糖尿病病程、測(cè)量身高、體重，計(jì)算體質(zhì)量指數(shù)=體質(zhì)量/身高2(kg/m2)。采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定各組的血糖、糖化血紅蛋白、血脂等指標(biāo)，采用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)T2DM組空腹C肽及標(biāo)準(zhǔn)饅頭餐后2 h-C肽水平。

1.2.2 DNA提取 所有受檢者取肘靜脈血2 ml，用EDTA-K2抗凝，采用鹽析法抽提基因組DNA(QIAGEN)，應(yīng)用NanoDrop-1000(USA)檢測(cè)其濃度和純度后，稀釋至30 ng/μl。

1.2.3 SNaPshot技術(shù)檢測(cè) (1)多重PCR擴(kuò)增:PCR反應(yīng)體系為 10 μl，含基因組 DNA 1 μl(30 mg/L)，0.3 μl的 dNTP(10 mmol/L)，1 μl 10 × PCR 緩沖 液，0.52 μl MgCl2溶 液(25 mmol/L)，0.1 μl HotStar(Sigma 公司)，6.68 μl無核酸酶的去離子水，各引物對(duì)的終濃度為0.1 μmol/L。多重PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性15 min，94℃變性40 s，63℃退火1 min，每個(gè)循環(huán)下降0.5℃，72℃延伸1.5 min，15個(gè)循環(huán);94℃變性40 s，56℃退火 40 s，72℃延伸 1.5 min，25 個(gè)循環(huán);72℃8 min，4℃保存，PCR反應(yīng)在9700熱循環(huán)儀(ABI公司)中進(jìn)行。(2)擴(kuò)增產(chǎn)物的純化:取1.0 μl擴(kuò)增產(chǎn)物，加入2.0 U蝦堿性磷酸酶(SAP 酶，USB，U.S.A)，2.0 U Exo I酶(Epicentre Biotechnologies，USA)，去離子水 2.6 μl，反應(yīng)總體系為 6 μl，混勻后 37℃保溫60 min，然后75℃滅活15 min，4℃保存。(3)延伸標(biāo)記、純化，反應(yīng)體系為 5 μl，含純化物 2 μl，SNaPshot Multiplex Mix(ABI公司)0.5 μl，去離子水 1.3 μl，每種引物在反應(yīng)體系中的終濃度分別為0.2 μmol/L。PCR循環(huán)條件為:96℃預(yù)變性10 s，96℃變性 10 s，50℃(53 C)退火 5 s，60℃ 延伸 30 s，25 個(gè)循環(huán)，PCR反應(yīng)在9700熱循環(huán)儀(ABI公司)中進(jìn)行。反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行第2次純化，每反應(yīng)產(chǎn)物中加入1 U SAP酶，37℃保溫60 min，75℃滅活15 min，4℃保存。(4)每反應(yīng)體系中加入Hi-Di甲酰胺(ABI 公司)9.25 μl，內(nèi)標(biāo) LIZ-120(ABI 公司)0.1 μl，第 2 次純化產(chǎn)物 1 μl，混勻離心后，95℃ 變性 5 min，迅速冰冷4 min。于ABI公司3730遺傳分析儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳，應(yīng)用GeneMaperV4.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。在所有樣本中，每一個(gè)SNP的基因分型成功率＞98%。在隨機(jī)抽取的樣本中所有的重復(fù)分型的一致率均為100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 以Hardy-Weinberg平衡法檢驗(yàn)研究樣本的群體代表性，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。正態(tài)分布計(jì)量資料以s表示，偏態(tài)分布變量以中位數(shù)(25%位數(shù)，75%位數(shù))表示，組間計(jì)量資料均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，偏態(tài)變量在統(tǒng)計(jì)學(xué)處理前先經(jīng)自然對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換。多因素分析用Logistic回歸分析，計(jì)算比值比(odds ratio，OR)及其95%置信區(qū)間(95%CI)。上述數(shù)據(jù)處理運(yùn)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。

2 結(jié)果

2.1 ABCC8基因rs1799854、KCNJ11基因rs5219基因型和等位基因分布 ABCC8基因rs1799854、KCNJ11基因rs5219分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律。ABCC8基因rs1799854位點(diǎn)基因型頻率分布在NC組和T2DM組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，且“t”等位基因在T2DM組顯著高于NC組(P＜0.05，OR=1.59，95%CI=1.13 ～2.24)。KCNJ11 基因 rs5219基因型頻率分布在NC組及T2DM組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。

2.2 NC組與T2DM組的臨床資料比較 與NC組比較，T2DM組年齡、TG均明顯高于NC組(P＜0.01)，HDL-C明顯低于NC組(P＜0.01)。見表2。

表1 ABCC8基因rs1799854、KCNJ11基因rs5219基因型和等位基因分布〔n(%)〕

表2 T2DM組與NC組臨床資料比較(s)

表2 T2DM組與NC組臨床資料比較(s)

與NC組比較:1)P＜0.01

項(xiàng)目 NC組(n=100)T2DM組(n=200)53/47 105/95年齡(歲)51.69±7.85 56.46±9.051)BMI(kg/m2)25.43±3.33 25.20±2.91 TG(mmol/L)1.56±1.59 2.09±0.771)TC(mmol/L)5.08±0.97 4.90±1.01 HDL-C(mmol/L)1.63±1.39 1.23±0.221)LDL-C(mmol/L)男/女(n)2.89±0.87 2.81±0.72

2.3 ABCC8基因rs1799854、KCNJ11基因rs5219在磺脲類藥物繼發(fā)失效組及有效組基因型和等位基因分布 觀察了200例應(yīng)用磺脲類降糖藥物患者，按其療效分組，可見失效組和有效組間，ABCC8基因rs1799854基因型頻率分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，且“t”等位基因在失效組明顯高于有效組(P＜0.05，OR=1.87，95%CI=1.23～2.85);KCNJ11基因 rs5219基因型頻率分布在失效組及有效組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表3。

表3 ABCC8基因rs1799854、KCNJ11基因rs5219基因型和等位基因分布〔n(%)〕

2.4 ABCC8基因rs1799854在T2DM組不同基因型間臨床資料比較 ABCC8基因rs1799854 t/t基因型SFS發(fā)生率、FPG、HbA1c、2 h PG顯著高于 c/t+c/c型組(P﹤0.01)，而 BMI、2 h-C肽顯著低于c/t+t/t組(P﹤0.01)。見表4。

表4 ABCC8基因外顯子rs1799854不同基因型間臨床資料比較(s)

表4 ABCC8基因外顯子rs1799854不同基因型間臨床資料比較(s)

與c/c+c/t組比較:1)P＜0.01

項(xiàng)目 c/c+c/t(n=121)t/t(n=79)64/57 41/38年齡(歲)57.05±9.89 55.66±7.55 BMI(kg/m2)25.72±2.99 24.41±2.591)病程(歲)6.00(2.00，10.00)7.00(3.00，14.00)SFS〔n(%)〕 40(33.1)46(58.2)1)HbA1c(%)8.84±1.43 9.70±2.081)FPG(mmol/L)9.24±2.42 10.54±3.741)2 h PG(mmol/L)17.79±3.67 19.33±3.811)F-C肽(mmol/L)2.11±0.67 1.99±0.69 2 h-C肽(mmol/L)7.20±2.56 6.09±2.241)男/女(n)

3 討論

ABCC8基因是ATP結(jié)合盒(ABC)C亞單位8號(hào)成員，編碼磺脲類受體1(SUR1)，KCNJ11基因是內(nèi)向整流鉀通道蛋白J亞單位11號(hào)成員，編碼內(nèi)向整流鉀通道(Kir6.2)蛋白，二者均位于染色體11p15.1上，相距4.5 kb，4個(gè)SUR1亞單位圍繞4個(gè)Kir6.2亞單位共同組成KATP通道，該通道在調(diào)節(jié)胰島素的分泌中起著重要作用，其調(diào)控過程呈血糖依賴性，當(dāng)血糖波動(dòng)時(shí)，細(xì)胞內(nèi)ATP/ADP比例改變，通過ABCC8基因及KCNJ11基因調(diào)節(jié)KATP通道的開關(guān)，進(jìn)而影響胰島素的釋放〔5〕。

研究表明，ABCC8基因和KCNJ11基因與T2DM相關(guān)，ABCC8基因和KCNJ11基因的變異均可引起新生兒糖尿病及家族性持續(xù)性高胰島素低血糖癥〔6，7〕。目前文獻(xiàn)報(bào)道，ABCC8基因某些位點(diǎn)的多態(tài)性與T2DM存在相關(guān)性，但在不同的人種結(jié)果往往存在差異性。在本研究中，rs1799854基因型分布在T2DM組與NC組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，這與日本、土耳其、北歐白種人、中國北方人群的研究結(jié)果一致〔3，8～10〕，而與高加索人、中國南方人群的研究結(jié)果不一致〔11，12〕。KCNJ11 基因rs5219是在高加索人及亞洲人中研究最多的位點(diǎn)，研究證明在高加索人中rs5219與T2DM相關(guān)〔13～15〕，而在亞洲人的研究報(bào)道中結(jié)果不一。本研究發(fā)現(xiàn)山東漢族人群中rs5219在T2DM組與NC組基因型分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，這與日本、丹麥、中國安徽、青島地區(qū)人群的報(bào)道相同〔3，16～18〕，而與中國南方人群的研究不同〔12〕。ABCC8及KCNJ 11基因多態(tài)性的分布由于環(huán)境、遺傳背景不同可能在不同種族間存在差異，那么，如何解釋中國人的基因分布在南北方人群中結(jié)果的差異呢?最近中國人類起源的遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)中國人類起源于非洲，從南方進(jìn)入中國，然后遷徙至北方〔19〕，在遷徙過程中可能以自然條件分割，形成了不同的隔離人群，如中國的黃河、長(zhǎng)江等，不同的隔離人群其遺傳物質(zhì)可能是有差異的。

本研究顯示，T2DM組年齡、TG顯著高于NC組，而HDL-C顯著低于NC組，在進(jìn)行非條件多因素Logistic分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)rs1799854 t/t基因型、年齡是 T2DM發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，HDL-C與T2DM的發(fā)生呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。這提示T2DM的發(fā)生擁有復(fù)雜的機(jī)制，可能是遺傳因素與環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。因此，對(duì)于年齡較大的人群更應(yīng)該合理膳食，注意維持提質(zhì)量、血脂等的正常，以減少危險(xiǎn)因素的聚集。

磺脲類藥物作為一種胰島素促泌劑，通過與胰島β細(xì)胞膜上的磺脲類受體結(jié)合，關(guān)閉細(xì)胞膜上ATP敏感性鉀離子通道，使鉀離子外流減少，細(xì)胞膜去極化，導(dǎo)致電壓門控性鈣通道開放，鈣離子內(nèi)流，促進(jìn)胰島素的釋放。本研究發(fā)現(xiàn)ABCC8基因rs1799854多態(tài)性與SFS發(fā)生相關(guān)，且t等位基因分布頻率在SFS組明顯高于有效組，這與袁莉等〔20〕的報(bào)道一致。比較T2DM組rs1799854不同基因型，SFS發(fā)生率在t/t型組顯著高于c/t+c/c型組，且t/t型組2h-c肽顯著低于c/t+t/t型組，這與紀(jì)立農(nóng)等〔21〕的研究報(bào)道一致。與此同時(shí)，HbA1c水平在t/t型組顯著高于c/t+t/t型組，而在Nikolac等〔22〕的報(bào)道中，也發(fā)現(xiàn)在應(yīng)用磺脲類藥物治療的T2DM患者，t/t型組HbA1c顯著高于其他基因型組。

ABCC8基因rs1799854與SFS的關(guān)系少有報(bào)道，且具體機(jī)制尚不清楚，推測(cè)可能機(jī)制:(1)由于該突變位于外顯子16剪切部位上游，在轉(zhuǎn)錄過程中，影響了正常的剪接，使SUR1功能受到影響，進(jìn)而影響KATP通道，導(dǎo)致胰島素釋放障礙。(2)也可能與ABCC8基因上發(fā)生變異的其他功能性位點(diǎn)存在強(qiáng)烈的連鎖不平衡〔3〕，影響胰島素的分泌功能而導(dǎo)致SFS。(3)由于t/t型血糖控制較差，高糖毒性可能又反過來加重了胰島分泌功能障礙，進(jìn)一步影響藥物療效。

綜上所述，ABCC8基因rs1799854可能是山東漢族T2DM人群的易感基因，并可能通過改變KATP通道功能而影響磺脲類藥物療效。由于T2DM的高度異質(zhì)性及降糖療效的顯著差異，這一研究結(jié)果還需要在不同地域、不同種族的人群中進(jìn)行大樣本的重復(fù)來驗(yàn)證。

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