脫氫抗壞血酸在重鉻酸鉀對A549細(xì)胞毒性效應(yīng)中的作用

畫寶勇，馬麗華，李時恩

1)鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院勞動衛(wèi)生學(xué)教研室 鄭州 450001 2)鄭州大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院 鄭州 450052

鉻在自然界中分布廣泛，六價鉻[Cr(Ⅵ)]已被證實具有致癌性，其所致的肺癌是8種職業(yè)性腫瘤之一。有研究[1-3]表明，活體細(xì)胞內(nèi)90%的抗壞血酸(ascorbic acid，Asc)參與Cr(Ⅵ)的還原代謝，且是Cr(Ⅵ)的主要還原劑。機(jī)體肺細(xì)胞內(nèi)Asc的平均水平為1.3 mmol/L[4]，但在體外細(xì)胞培養(yǎng)中含量卻非常低[5-6]，脫氫抗壞血酸(dehydroascorbic acid，DHA)孵育可以使細(xì)胞內(nèi)氧化形成Asc，使其達(dá)到或接近機(jī)體正常生理濃度[7]。Reynolds等[8]發(fā)現(xiàn)DHA孵育H460和IMR90細(xì)胞90 min后，再用Cr(Ⅵ)染毒細(xì)胞，細(xì)胞的急性毒性增強(qiáng)。作者用DHA孵育A549細(xì)胞后，觀察重鉻酸鉀(K2Cr2O7)對A549細(xì)胞的增殖及毒性作用，探討DHA在K2Cr2O7致A549細(xì)胞損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1實驗材料、主要試劑人胚肺A549細(xì)胞購于武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心。K2Cr2O7(天津化工廠)，DMEM/F12(美國Gibco公司)，優(yōu)級胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，DHA、二甲基亞砜(DMSO)、四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)(美國Sigma公司)，Sunrise Remote 酶標(biāo)儀(奧地利TECAN公司)。

1.2DHA對K2Cr2O7刺激的A549細(xì)胞增殖的影響用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液復(fù)蘇A549細(xì)胞，培養(yǎng)傳2代后用于實驗。當(dāng)A549細(xì)胞鋪瓶底達(dá)80%～90%時，用2.5 g/L的胰蛋白酶消化制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整密度為4.0 ×104mL-1，以每孔200 μL接種于96孔板，接種6板。每板設(shè)空白組與DHA組各兩組(DHA組預(yù)先于0.6 mmol/L的DHA無血清培養(yǎng)液中孵育90 min，棄舊液，PBS洗3遍)，分別用培養(yǎng)液或10.00 μmol/L的K2Cr2O7孵育3 h，棄舊液，PBS洗3遍。然后用含血清的培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)。共24組，每組均設(shè)置8個復(fù)孔。每過24 h拿出1板，MTT法檢測A549細(xì)胞的增殖情況。連續(xù)6 d，中途不更換培養(yǎng)液。

1.3DHA對不同濃度K2Cr2O7刺激的A549細(xì)胞毒性的影響消化A549細(xì)胞，按每孔3.5×104個細(xì)胞接種于96孔板，37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后棄原培養(yǎng)液，實驗組用DHA 孵育90 min后，分別加入含0.00、1.25、2.50和5.00 μmol/L K2Cr2O7的無血清DMEM/F12培養(yǎng)液；對照組棄原培養(yǎng)液后，直接加入含以上濃度K2Cr2O7的無血清DMEM/F12培養(yǎng)液。每濃度組設(shè)8個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，MTT法檢測細(xì)胞活性。并計算細(xì)胞增殖抑制率及IC50。細(xì)胞增殖抑制率=(1-實驗組D值/對照組D值)×100%。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 12.0進(jìn)行分析，應(yīng)用2×2×6析因設(shè)計方差分析方法比較DHA、 K2Cr2O7與不同培養(yǎng)時間對A549細(xì)胞增殖的影響。采用簡單線性回歸模型分析K2Cr2O7和細(xì)胞增殖抑制率之間的濃度-效應(yīng)關(guān)系，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1DHA對K2Cr2O7刺激的A549細(xì)胞增殖影響的結(jié)果見表1。DHA刺激可影響細(xì)胞增殖(FDHA=38.189，PDHA=0.001)，但是，無K2Cr2O7刺激時，DHA組細(xì)胞均在第4 d增殖達(dá)到頂峰，第5 d出現(xiàn)生長抑制趨勢，分析發(fā)現(xiàn)單獨DHA對細(xì)胞增殖沒有影響(P>0.05)；而K2Cr2O7刺激可抑制細(xì)胞增殖能力(FK2Cr2O7=4 045.865，PK2Cr2O7<0.001)；且在DHA與K2Cr2O7同時存在時細(xì)胞增殖抑制程度明顯高于K2Cr2O7組，兩者具有交互作用(F交互=32.665，P交互=0.007)。

2.2DHA對不同濃度K2Cr2O7刺激的A549細(xì)胞的毒性作用見表2。隨K2Cr2O7濃度的增加細(xì)胞增殖抑制率呈線性升高趨勢，濃度-效應(yīng)回歸方程為：Y=12.58X+2.92(R2=0.962)，見圖1。

表1 K2Cr2O7刺激后A549細(xì)胞增殖情況(n=8)

FDHA=38.189，PDHA=0.001；FK2Cr2O7=4 045.865，PK2Cr2O7<0.001；F時間=873.147,P時間<0.001,FDHA和K2Cr2O7交互=32.665；PDHA和K2Cr2O7交互=0.007。

表2 K2Cr2O7染毒24 h后A549細(xì)胞增殖抑制情況(n=8)

圖1 K2Cr2O7染毒24 h后A549細(xì)胞增殖抑制情況

3 討論

Cr(Ⅵ)是一種重金屬環(huán)境污染物，具有較強(qiáng)的氧化能力，可以導(dǎo)致DNA損傷、干擾DNA修復(fù)，若這些損傷的細(xì)胞不被修復(fù)，并逃避凋亡，在體內(nèi)繼續(xù)增殖就會引起DNA的突變，進(jìn)而致癌。活體細(xì)胞內(nèi)90%的Asc參與Cr(Ⅵ)的還原代謝，是Cr(Ⅵ)的主要還原劑[1-3]。有研究[5]認(rèn)為Asc能在細(xì)胞外生成H2O2對細(xì)胞造成氧化損傷。

Reynolds等[8]采用在細(xì)胞染毒前90 min孵育DHA來形成氧化形式Asc的方法，來彌補(bǔ)體外培養(yǎng)條件下細(xì)胞內(nèi)Asc含量很低的不足。作者采用MTT法檢測DHA在不同時間、相同濃度K2Cr2O7刺激A549細(xì)胞時細(xì)胞增殖的抑制率，以及DHA在相同時間、不同濃度K2Cr2O7刺激A549細(xì)胞時細(xì)胞的增殖抑制率，以此來驗證DHA在K2Cr2O7對A549細(xì)胞毒性效應(yīng)中的作用。結(jié)果顯示，K2Cr2O7刺激可抑制細(xì)胞的增殖能力；但是，在DHA與K2Cr2O7同時存在時細(xì)胞增殖抑制程度明顯增高，兩者具有交互作用。相同時間時，隨K2Cr2O7濃度的增加，細(xì)胞增殖抑制率呈線性升高趨勢，即提高細(xì)胞內(nèi)Asc的含量后，同劑量K2Cr2O7對A549細(xì)胞產(chǎn)生了不同程度的損傷。因此，推測細(xì)胞內(nèi)Asc含量增加后與K2Cr2O7的氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生的活性氧的量和結(jié)合物的量增加，結(jié)合并損傷DNA的程度加劇，DNA修復(fù)機(jī)制不能完全修復(fù)損傷，啟動凋亡機(jī)制使細(xì)胞凋亡，細(xì)胞死亡增多，細(xì)胞增殖抑制率增高。這與國內(nèi)外的研究[9-10]報道一致。

綜上所述，DHA促進(jìn)了K2Cr2O7對A549細(xì)胞的毒性作用。但具體機(jī)制不明，仍需要做進(jìn)一步的研究。

[1]Salnikow K,Zhitkovich A.Genetic and epigenetic mechanisms in metal carcinogenesis and cocarcinogenesis：nickel，arsenic，and chromium[J].Chem Res Toxicol，2008，21(1)：28

[2]劉永，徐新華，江棟.L-抗壞血酸還原降解六價鉻的影響因素[J].環(huán)境科學(xué)研究，2008，21(4)：25

[3]Altun T，Pehlivan E.Removal of Cr(Ⅵ)from aqueous solutions by modified walnut shells[J].Food Chem，2012，132(2)：693

[4]Reynolds M，Armknecht S，Johnston T，et al.Undetectable role of oxidative DNA damage in cell cycle，cytotoxic and clastogenic effects of Cr(Ⅵ)in human lung cells with restored ascorbate levels[J].Mutagenesis，2012，27(4)：437

[5]李霞.牙周膜細(xì)胞膜片構(gòu)建過程中L-抗壞血酸-2-磷酸酯的應(yīng)用及觀察[J].山東醫(yī)藥，2012，52(22)：22

[6]Karaczyn A，Ivanov S，Reynolds M，et al.Ascorbate depletion mediates up-regulation of hypoxia-associated proteins by cell density and nickel[J].J Cell Biochem，2006，97(5)：1025

[7]Reynolds M，Stoddard L，Bespalov I，et al.Ascorbate acts as a highly potent inducer of chromate mutagenesis and clastogenesis：linkage to DNA breaks in G2 phase by mismatch repair[J].Nucleic Acids Res，2007，35(2)：465

[8]Reynolds M，Zhitkovich A.Cellular vitamin C increases chromate toxicity via a death program requiring mismatch repair but not p53[J].Carcinogenesis，2007，28(7)：1613

[9]趙文靜，鐘才高，邊鬟鋒，等.維生素C在Cr(Ⅵ)誘導(dǎo)L-02肝細(xì)胞氧化損傷中的雙面作用[J].衛(wèi)生研究，2009，38(3)：310

[10]Martin BD，Schoenhard JA，Hwang JM，et al.Ascorbate is a pro-oxidant in chromium-treated human lung cells[J].Mutat Res，2006，610(1/2)：74