EGFR、KRAS、BRAF、PI3K基因突變與非小細(xì)胞肺癌靶向藥物治療的關(guān)系

孫麗娟，付 群，李宏云，秦 超，馮永海

鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院呼吸科鄭州450052

△女，1976年11月生，碩士，主治醫(yī)師，研究方向:分子生物學(xué)，E-mail:erhugege@163.com

肺癌的發(fā)病率和病死率呈逐年上升趨勢，其傳統(tǒng)的化療、放療方法和近年提出的腫瘤細(xì)胞免疫治療、放射免疫治療均給患者及社會帶來了極大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)［1-2］。如何實(shí)現(xiàn)肺癌的個(gè)體化治療已逐漸成為腫瘤治療的新方向［3-4］。近年來出現(xiàn)的表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)酪氨酸激酶抑制劑(如吉非替尼、厄洛替尼)備受關(guān)注。研究［5］發(fā)現(xiàn)，吉非替尼對存在EGFR 基因突變的患者有較好的療效，但存在KRAS、BRAF、磷脂酰肌醇3 激酶(phosphoinositide 3-kinases，PI3K)基因突變的患者對吉非替尼表現(xiàn)出耐藥現(xiàn)象。所以，應(yīng)盡早檢測患者癌基因突變情況，選擇正確的治療方案。分子標(biāo)志物(靶標(biāo))檢測是個(gè)體化治療的前提。作者利用RT-PCR 技術(shù)檢測EGFR mRNA 的表達(dá)水平，并對吉非替尼治療效果差的患者檢測EGFR、KRAS、BRAF、PI3K 基因突變情況，為臨床靶向治療提供理論依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集2009年2月至2011年2月鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院診治的經(jīng)病理證實(shí)為非小細(xì)胞肺癌的患者80例，其中男46例，女34例，年齡28～75(56.8±10.7)歲。肺腺癌50例，鱗癌27例，腺鱗癌2例，大細(xì)胞癌1例。52例有吸煙史。腫瘤分期:Ⅲa 期32例，Ⅲb 期29例，Ⅳ期19例。病例入選標(biāo)準(zhǔn):①病理證實(shí)為非小細(xì)胞肺癌的患者。②未接受任何相關(guān)治療。③愿接受靶向藥物治療。排除標(biāo)準(zhǔn):①診斷不明確。②年齡＞75 歲。③小細(xì)胞肺癌。④曾接受靶向藥物治療。⑤合并有嚴(yán)重心、肝、腎臟器功能損害。

1.2 非小細(xì)胞肺癌患者腫瘤組織中EGFR mRNA表達(dá)量的RT-PCR 檢測 取冰凍腫瘤組織50 mg，按照試劑盒說明書的方法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為DNA。EGFR 及GAPDH 引物序列均由上海鼎國生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)。EGFR 上游引物序列:5’-AACACAGTGGAGCGAATTCCTTT-3’，下 游引物序列:5’-GGAAGTCCATCGACATGTTGCT-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物大小153 bp。PCR 反應(yīng)體系:10× PCR Buffer 2 μL，dNTP Mixture 0.8 μL，上游及下游引物各0.5 μL，cDNA 模板2 μL，Taq 酶0.2 μL，加RNase Free ddH2O 至20 μL。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性1 min;94℃變性45 s，56℃退火45 s，72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10 min。所有PCR 反應(yīng)均設(shè)陰性對照。最終取PCR 產(chǎn)物10 μL 行瓊脂糖凝膠電泳，用圖像分析儀掃膠，以EGFR mRNA 和GAPDH 灰度值的比值表示EGFR mRNA 基因相對表達(dá)量。

1.3 吉非替尼的應(yīng)用 選擇EGFR mRNA 高表達(dá)(即腫瘤組織EGFR mRNA 表達(dá)水平高于癌旁正常組織)的患者口服吉非替尼，250 mg/d，30 d 為1 療程，服用3 個(gè)療程后評價(jià)治療效果。

1.4 療效判定標(biāo)準(zhǔn) 按照實(shí)體瘤療效評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評估。對患者進(jìn)行血、尿常規(guī)，肝腎功能，腫瘤標(biāo)志物，心電圖，CT 及彩超等檢查，評價(jià)治療效果。

1.5 EGFR、KRAS、BRAF、PI3K 基因突變檢測取患者全血5 mL，放進(jìn)抗凝管中，離心取血漿，4～8℃低溫保存。使用富集突變-液相芯片技術(shù)檢測EGFR、KRAS、BRAF、PI3K 基因突變情況(由廣州益善生物技術(shù)有限公司完成)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0 進(jìn)行分析，應(yīng)用配對t 檢驗(yàn)比較腫瘤患者癌組織和癌旁正常組織中EGFR mRNA 相對表達(dá)量的差異，應(yīng)用Pearson 法分析不同療效患者EGFR、KRAS、BRAF、PI3K 基因突變檢測結(jié)果及療效與基因突變的相關(guān)性，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 EGFR mRNA 的表達(dá) 80例患者腫瘤組織EGFR mRNA 相對表達(dá)量為13.8±5.7，癌旁正常組織EGFR mRNA 相對表達(dá)量為1.2±0.4，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=23.675，P ＜0.001)。其中65例患者EGFR mRNA 表達(dá)水平高于癌旁正常組織。

2.2 吉非替尼應(yīng)用后的療效 65例EGFR mRNA高水平表達(dá)的患者口服吉非替尼3 個(gè)月，33例效果較好，表現(xiàn)為原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶縮小，有效率50.8%。32例吉非替尼治療效果差，表現(xiàn)為原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶進(jìn)展。

2.3 不同療效患者EGFR、KRAS、BRAF、PI3K 基因突變檢測結(jié)果及療效與基因突變的關(guān)系 見表1。

表1 吉非替尼治療效果與EGFR、KRAS、BRAF、PI3K 基因突變的關(guān)系例

3 討論

EGFR 主要位于細(xì)胞膜，屬于受體酪氨酸激酶家族。目前，針對EGFR 的靶向藥物主要有兩類:①EGFR-TKI，如吉非替尼和厄洛替尼，通過抑制胞內(nèi)區(qū)酪氨酸激酶的活性而發(fā)揮作用。②抗EGFR 單克隆抗體藥，如西妥昔單抗和帕尼單抗，通過與EGFR特異性配體競爭結(jié)合EGFR，阻斷依賴于配體的EGFR 活化。

臨床觀察［6］發(fā)現(xiàn)，EGFR-TKI 僅對10%～30%的患者有顯著療效，抗EGFR 單克隆抗體藥僅對10%～20%的患者有效。美國國家綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(NCCN)臨床實(shí)踐指南中推薦:非小細(xì)胞肺癌患者接受靶向藥物治療之前，應(yīng)進(jìn)行EGFR mRNA 表達(dá)水平檢測，確定是否給予靶向藥物治療。

KRAS 基因突變與非小細(xì)胞肺癌患者對EGFRTKI 靶向藥物的原發(fā)性耐藥有關(guān)［7-8］。NCCN 臨床實(shí)踐指南中明確指出:對于明確存在KRAS 基因突變的非小細(xì)胞肺癌患者，應(yīng)考慮吉非替尼以外的藥物。

BRAF 基因定位于人染色體7q34，編碼具有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性的Raf 蛋白。Raf 是EGFR 信號通路中KRAS 下游重要的信號分子，將信號從KRAS 傳導(dǎo)至MEK1/2，參與調(diào)控細(xì)胞的生物學(xué)事件。臨床研究［5］顯示，部分KRAS 基因未突變的非小細(xì)胞肺癌患者也會對EGFR 靶向藥物產(chǎn)生耐藥性，這主要是由于BRAF 基因存在突變而導(dǎo)致。

PI3K 是一組蛋白多聚體，其活化可產(chǎn)生多種生物學(xué)效應(yīng)，包括調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、存活和細(xì)胞周期等。PI3K 基因的點(diǎn)突變可發(fā)生于多個(gè)外顯子，最常見的突變位點(diǎn)為外顯子9 和20。PI3K 突變會導(dǎo)致非小細(xì)胞肺癌患者對EGFR 靶向藥物不敏感［9］。

該研究顯示吉非替尼的療效與EGFR E18 和EGFR E19 基因突變呈正關(guān)聯(lián)，與EGFR E20、KRAS、BRAF、PI3K 基因突變呈負(fù)關(guān)聯(lián)。

綜上所述，對腫瘤患者進(jìn)行靶向藥物治療前，行靶標(biāo)檢測能夠科學(xué)預(yù)測治療效果，幫助患者選擇最佳治療方案。

［1］張毅，Michael Nishimura.腫瘤的細(xì)胞免疫治療［J］.鄭州大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2011，46(2):165

［2］關(guān)鋒，林秋玉，趙紅光，等.惡性腫瘤放射免疫治療的研究進(jìn)展［J］.吉林大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2011，37(1):179

［3］王理偉，王雷，李寧.臨床腫瘤基因組學(xué)與腫瘤個(gè)體化治療［J］.臨床腫瘤學(xué)雜志，2010，15(6):481

［4］Roberts PJ，Stinchcombe TE，Der CJ，et al.Personalized medicine in non-small cell lung cancer［J］.J Clin Oncol，2010，28(31):4769

［5］Schmid K，Oehl N，Wrba F，et al.EGFR/KRAS/BRAF mutations in primary lung adenocarcinomas and corresponding locoregional lymph node metastases［J］.Clin Cancer Res，2009，15(14):4554

［6］Janku F，Stewart DJ，Kurzrock R.Targeted therapy in nonsmall cell lung cancer:is it becoming a reality?［J］.Nat Rev Clin Oncol，2010，7(7):401

［7］Gao B，Sun Y，Zhang J，et al.Spectrum of LKB1，EGFR and KRAS mutations in chinese lung adenocarcinomas［J］.J Thorac Oncol，2010，5(8):1130

［8］韓越，梁軍，呂紅英，等.晚期非小細(xì)胞肺癌ERCC1 XRCC1 基因多態(tài)性與鉑類化療療效研究［J］.中國實(shí)用內(nèi)科雜志，2011，31(8):638

［9］Lee SY，Kim MJ，Jin G，et al.Somatic mutations in epidermal growth factor receptor signaling pathway genes in nonsmall cell lung cancers［J］.J Thorac Oncol，2010，5(11):1734