杜氏鹽藻基因FLA8原核表達(dá)載體的構(gòu)建和表達(dá)*

侯永杰，李慶華，薛樂(lè)勛

鄭州大學(xué)生物工程系細(xì)胞生物學(xué)研究室 鄭州 450001

驅(qū)動(dòng)蛋白是一種具有保守馬達(dá)結(jié)構(gòu)域的蛋白，實(shí)驗(yàn)[1]證實(shí)驅(qū)動(dòng)蛋白的作用是結(jié)合在微管和鞭毛上，參與小囊泡和細(xì)胞器的轉(zhuǎn)運(yùn)[2]、紡錘體的形成和延伸[3]、染色體的分離和微管的形成[4-5]等。在驅(qū)動(dòng)蛋白家族中，驅(qū)動(dòng)蛋白2是惟一由異源動(dòng)力亞基組成的復(fù)合物，其由兩個(gè)動(dòng)力亞基(FLA8，F(xiàn)LA10)和一個(gè)非動(dòng)力亞基(KAP)組成。FLA8作為藻類(lèi)驅(qū)動(dòng)蛋白2中的一個(gè)動(dòng)力亞基，具有正末端指向性，牽引完成鞭毛內(nèi)的正向運(yùn)輸[6]。而鞭毛作為細(xì)胞表面上特殊功能的細(xì)胞器通過(guò)組裝和解聚來(lái)保持鞭毛的動(dòng)態(tài)平衡。研究[7]表明，鞭毛功能異常常伴隨人類(lèi)疾病的發(fā)生，如組織的左右不對(duì)稱、多囊腎和多指/多趾等。因此，研究驅(qū)動(dòng)蛋白家族中的FLA8基因能夠更清楚地闡述鞭毛組裝的異常與人類(lèi)疾病的相關(guān)性。作者構(gòu)建了杜氏鹽藻基因FLA8的原核表達(dá)載體，并對(duì)誘導(dǎo)其表達(dá)的條件進(jìn)行了探索。

1 材料與方法

1.1主要試劑及儀器杜氏鹽藻藻株為UTEX-LB-1644，購(gòu)自美國(guó)德州大學(xué)；表達(dá)載體pET28a(+)、工程菌DH5α和DE3為鄭州大學(xué)生物工程系細(xì)胞生物學(xué)研究室保存，HRP-山羊抗兔IgG購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)服務(wù)有限公司。載體pMD-T購(gòu)自北京天根生物技術(shù)公司；LA Taq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和Hind Ⅲ、T4 DNA連接酶購(gòu)自TaKaRa公司；X-Gal和IPTG購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒DNA小提試劑盒購(gòu)自Axygen公司。電泳儀(北京六一實(shí)驗(yàn)儀器廠)，PCR儀(Biometra公司)，凝膠成像儀(Synoptics公司)。

1.2杜氏鹽藻FLA8基因的擴(kuò)增根據(jù)已知的杜氏鹽藻FLA8 cDNA序列設(shè)計(jì)合成引物。上游引物序列：5’-GGAATTCCATATGATGAGCAGCGGAGC CAATCC-3’；下游引物序列：5’-CCCAAGCTTTCAT GCAGGCTTAGAAGAC-3’；上、下游引物近5’端分別為添加NdeⅠ和Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)。PCR反應(yīng)體系：LA Taq酶0.5 μL，上、下游引物(100 μmol/L)各0.5 μL，dNTP(10 nmol/L)4 μL，10×LA Buffer 5 μL，模板cDNA 1 μL，加ddH2O至48.5 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃終止反應(yīng)。PCR反應(yīng)結(jié)束后，10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。

1.3目的基因與pMD-T的連接和鑒定大量擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)凝膠電泳分離后，依照凝膠回收試劑盒說(shuō)明對(duì)目的基因片段進(jìn)行凝膠回收，然后將目的基因與帶有T末端的pMD-T載體進(jìn)行連接。轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，通過(guò)含有X-Gal和IPTG 的Amp+抗性的LB平板進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。挑取白色的單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，將鑒定正確的命名為pMD-T-FLA8并送華大基因生物公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果用DNAMAN軟件與GenBank上登錄的基因?qū)Ρ取?/p>

1.4pET28-FLA8載體的構(gòu)建和鑒定用限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和Hind Ⅲ切割空載體pET28a(+)和克隆載體pMD-T-FLA8，經(jīng)過(guò)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳分離后，回收FLA8的基因片段和線性載體pET28a(+)，用T4 DNA連接酶于16 ℃水浴中過(guò)夜連接。然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DE3中，涂布在含有Kan+抗性的LB平板上，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)直到有單克隆出現(xiàn)。挑取單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，將鑒定正確的質(zhì)粒送華大基因生物公司測(cè)序。

1.5目的基因的原核表達(dá)將轉(zhuǎn)化有pET28a-FLA8的大腸桿菌DE3在1 mmol/L IPTG下誘導(dǎo)，于37 ℃振蕩培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌液離心，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，以確定目的基因是否表達(dá)。

1.6目的蛋白的可溶性檢測(cè)取誘導(dǎo)蛋白1.5 mL離心棄上清，用1×PBS緩沖液將沉淀洗滌2～3次，12 000 r/min離心1 min。用1×PBS緩沖液重懸菌體后超聲破碎離心，將上清轉(zhuǎn)移到另一潔凈的EP管中。將2×SDS-PAGE 蛋白質(zhì)凝膠上樣緩沖液分別加入上清液及沉淀中，100 ℃沸水浴中煮沸 10 min 進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，觀察目的蛋白是以包涵體沉淀為主還是以可溶性上清為主。

1.7目的蛋白的Westernblot檢測(cè)含有目的基因的載體和空載體分別在大腸桿菌中表達(dá)，取菌破碎后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，將電泳條帶點(diǎn)轉(zhuǎn)移到NC膜上，TBST洗膜3次。加兔抗FLA8抗體(稀釋12 000 倍)過(guò)夜孵育，再用TBST洗膜3次，用110 000 的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗與NC膜雜交，室溫振蕩孵育1 h，用TBST洗膜3次，ECL發(fā)光顯影成像。

2 結(jié)果

2.1杜氏鹽藻FLA8基因PCR擴(kuò)增結(jié)果擴(kuò)增后得到一條大小為2 355 bp的片段(圖1)。

圖1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2克隆載體pMD-T-FLA8的鑒定pMD-T-FLA8雙酶切結(jié)果見(jiàn)圖2，提示與目的基因開(kāi)放閱讀框和已知載體的大小基本一致。

圖2 pMD-T-FLA8載體酶切鑒定結(jié)果

2.3pET28-FLA8和鑒定雙酶切質(zhì)粒得到2 300和5 000 bp的片段各1條(圖3)，其大小與FLA8的開(kāi)放閱讀框和線性表達(dá)載體pET28a(+)的大小相接近。

2.4目的基因的原核表達(dá)見(jiàn)圖4。

2.5目的蛋白的可溶性檢測(cè)結(jié)果目的蛋白主要以包涵體形式存在，見(jiàn)圖5。

2.6目的蛋白的Westernblot檢測(cè)結(jié)果Western blot結(jié)果顯示，在87 000可見(jiàn)一條特異較高的條帶(圖6)。

圖3 pET28-FLA8載體的雙酶切結(jié)果

M：Marker；1：pET28a(+)-FLA8雙酶切結(jié)果；2：pET28a(+)-FLA8質(zhì)粒。

圖4 目的基因的原核表達(dá)

圖5 目的蛋白的可溶性檢測(cè)

M：蛋白Marker；1：菌體裂解后的包涵體沉淀；2菌體裂解后的上清。

圖6 目的蛋白的Western blot檢測(cè)結(jié)果

3 討論

研究[8]證明了衣藻中的驅(qū)動(dòng)蛋白2與鞭毛內(nèi)運(yùn)輸有關(guān)。鞭毛內(nèi)運(yùn)輸顆粒作為運(yùn)輸體，能夠?qū)⒈廾M裝所需“貨物”運(yùn)輸?shù)奖廾M裝部位。鞭毛有動(dòng)力蛋白和驅(qū)動(dòng)蛋白兩個(gè)馬達(dá)蛋白。驅(qū)動(dòng)蛋白能在ATP酶水解能量的驅(qū)動(dòng)下，使“貨物”沿細(xì)胞骨架微管蛋白從基底部運(yùn)送至鞭毛頂端，在鞭毛的正向端卸下“貨物”，用來(lái)組裝微管。另外，驅(qū)動(dòng)蛋白還能參與細(xì)胞器或小囊泡的轉(zhuǎn)運(yùn)、微管的形成、染色體的分離和紡錘體的形成和延伸等[9-12]。作為驅(qū)動(dòng)蛋白2中的兩個(gè)動(dòng)力亞基，F(xiàn)LA10的功能研究相對(duì)較多，但是對(duì)動(dòng)力亞基FLA8的研究相對(duì)較少。因此，研究FLA8的功能可以更廣泛地了解驅(qū)動(dòng)蛋白2在鞭毛內(nèi)運(yùn)輸中的功能，馬達(dá)蛋白的轉(zhuǎn)換以及鞭毛內(nèi)運(yùn)輸?shù)臋C(jī)制。作者克隆了杜氏鹽藻的FLA8基因，將其連接到原核表達(dá)載體，并成功誘導(dǎo)其蛋白表達(dá)。以上結(jié)果有助于在基因和蛋白質(zhì)水平研究杜氏鹽藻。

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