載脂蛋白A-Ⅰ(apoA-Ⅰ)促進(jìn)單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞產(chǎn)生前列腺素E2(PGE2)和前列腺素D2(PGD2)

王維娜 朱海燕 黃 海 葉 麗 馮美卿

(復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院生物合成教研室 上海 201203)

研究顯示，載脂蛋白A-Ⅰ (apolipoprotein A-Ⅰ，apoA-Ⅰ)作為人血漿高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)的主要蛋白質(zhì)成分和功能執(zhí)行者，不但是預(yù)測(cè)動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)的理想指標(biāo)，還可以通過抗炎、抗血栓形成、血管保護(hù)、參與膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)和斑塊重塑等過程來發(fā)揮抗AS的作用［1－2］。由于長期服用傳統(tǒng)抗AS藥物有嚴(yán)重的不良反應(yīng)，相比之下作為一種人體內(nèi)固有蛋白的apoA-Ⅰ可能會(huì)更加安全，并為AS的治療帶來新的希望，具有廣闊的應(yīng)用前景。單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞是一種在AS的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用的細(xì)胞，它產(chǎn)生的前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)具有舒張血管和抑制血小板聚集的作用;前列腺素D2(PGD2)具有抑制炎性因子和炎性細(xì)胞黏附以及抑制血小板聚集的作用;前列腺素D合酶(lipocalin type prostaglandin D synthase，L-PGDS)是促進(jìn)PGD2合成的關(guān)鍵酶［3－5］。PGE2和 PGD2的這些生理功能均有利于抑制AS的發(fā)生和發(fā)展。目前，國內(nèi)外關(guān)于apoA-Ⅰ抗AS具體機(jī)制的研究主要集中在apoA-Ⅰ對(duì)炎性過程中相關(guān)炎性因子的影響以及對(duì)膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)過程的影響等。而apoA-Ⅰ 的抗AS作用及其與PGE2和PGD2之間的相關(guān)性研究尚未見報(bào)道。我們?cè)O(shè)想apoA-Ⅰ 可能通過影響PGE2和PGD2的合成來發(fā)揮抗 AS作用。本研究觀察了apoA-Ⅰ 對(duì)THP-1細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞產(chǎn)生L-PGDS、PGE2和PGD2的影響，探討它們與 apoA-Ⅰ 抗 AS作用之間可能的關(guān)系。

材料和方法

實(shí)驗(yàn)材料 人單核細(xì)胞株THP-1細(xì)胞(中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫);apoA-Ⅰ(實(shí)驗(yàn)室畢赤酵母表達(dá));佛波酯(phorbol esters，PMA，美國Alexis公司);RMPI 1640培養(yǎng)基和FBS(美國Cibco公司);四甲基偶氮唑藍(lán)MTT(美國Sigma公司);總RNA提取試劑Trizol(美國Invitrogen公司);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(加拿大Fermentas公司);Taq酶(上海申能博彩生物科技有限公司);ELISA試劑盒(美國RND公司)。

實(shí)驗(yàn)方法

細(xì)胞培養(yǎng)及處理 人單核細(xì)胞株THP-1細(xì)胞接種于含 10%FBS、100 IU/mL 青霉素、100 μg/mL鏈霉素的新鮮RPMI1640培養(yǎng)基，置于37℃、飽和濕度、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)至濃度為1×105/mL～1×106/mL時(shí)可傳代。取對(duì)數(shù)生長期的THP-1懸浮細(xì)胞，換用含有100 ng/mL佛波酯的全培養(yǎng)基，以細(xì)胞數(shù)1×106/mL、每孔2 mL接種于6孔板中，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。24～48 h后，THP-1細(xì)胞誘導(dǎo)為呈貼壁生長的巨噬細(xì)胞。細(xì)胞按實(shí)驗(yàn)要求分組，分別用無血清培養(yǎng)液和含 apoA-Ⅰ12．5、25、50、100 和 200 μg/mL的無血清培養(yǎng)液孵育24 h。

細(xì)胞毒性試驗(yàn)(MTT法)確定給藥濃度 取對(duì)數(shù)生長期THP-1細(xì)胞，換用含有100 ng/mL佛波酯的全培養(yǎng)基，接種于96孔培養(yǎng)板(細(xì)胞數(shù)為5×105/mL，每孔200 μL)培養(yǎng)24～48 h后得到巨噬細(xì)胞。巨噬細(xì)胞分別換用無血清培養(yǎng)液和含apoA-Ⅰ12．5、25、50、100 和 200 μg/mL 的無血清細(xì)胞培養(yǎng)液孵育，每孔200 μL。24 h后，每孔加人MTT溶液(5 g/L)20 μL繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)基，每孔加入 150 μL DMSO，37℃溫?fù)u 10 min，使其充分溶解。用酶標(biāo)儀于490 nm波長處測(cè)定吸光度值(D)，計(jì)算經(jīng)不同濃度apoA-Ⅰ孵育細(xì)胞的存活率。

RT-PCR檢測(cè)L-PGDS mRNA的表達(dá) 用Trizol一步法分別提取經(jīng)不同濃度(0、12．5、25、50、100、200 μg/mL)apoA-Ⅰ孵育24 h的THP-1細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞總RNA。具體操作如下:用細(xì)胞刮刀消化細(xì)胞后，PBS洗2次，1 000 r/min離心5 min收集于EP管中，加入l mL Trizol混勻，室溫放置5 min后加入氯仿0．2 mL，劇烈振搖，室溫放置3 min，于4℃、12 000 r/min離心15 min。取上清液至EP管中，加入0．5 mL異丙醇，混勻后放置于室溫10 min，4℃、10 000 r/min離心10 min，棄上清即可見RNA沉淀。加入DEPC水處理過的75%乙醇l mL混勻，4℃、7 500 r/min離心5 min后棄上清，自然晾干。加入20 μL DEPC水溶解RNA，－80℃保存?zhèn)溆谩？俁NA經(jīng)純度及濃度檢測(cè)后用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒按說明書操作得到cDNA。采用Primer 5軟件設(shè)計(jì)PCR引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成(表1)。PCR反應(yīng)條件:95℃ 預(yù)變性5 min;95℃ 變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸60 s，共30個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1．2%瓊脂糖凝膠電泳分析并用凝膠成像設(shè)備拍照，圖片用Image Quant TL軟件分析，以L-PGDS和GAPDH表達(dá)量的比值來表示L-PGDS mRNA表達(dá)的相對(duì)水平。

表1 RT-PCR引物Tab 1 The primers used for RT-PCR amplification

ELISA檢測(cè)PGE2和PGD2蛋白的表達(dá) THP-1細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞經(jīng)不同濃度(0、12．5、25、50、100、200 μg/mL)apoA-Ⅰ孵育24 h后，取細(xì)胞上清液用ELISA試劑盒檢測(cè)PGE2和PGD2蛋白的表達(dá)量。具體操作如下:(1)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線:設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔8孔，1～7孔每孔中各加入稀釋到適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL，第8孔為空白對(duì)照。每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和空白做3個(gè)復(fù)孔。(2)加樣:在每個(gè)反應(yīng)孔中加入細(xì)胞培養(yǎng)上清50 μL。每個(gè)樣品做3個(gè)復(fù)孔。(3)立即加入50 μL的生物素標(biāo)記的抗體，蓋上蓋板，輕輕振蕩混勻，37℃溫育1 h。甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30 s，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作3次。(4)每孔中加入60 μL親和鏈酶素-HRP，輕輕振蕩混勻，37℃溫育30 min。甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30 s，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作3次。(5)每孔中加入底物工作液 A、B 各50 μL，輕輕振蕩混勻，37℃ 溫育 10 min。避免光照。(6)取出酶標(biāo)板，迅速加入50 μL終止液，在450 nm波長處測(cè)定各孔的D值。(7)數(shù)據(jù)處理:各測(cè)定的D值減去空白孔D值，為測(cè)試實(shí)際D值。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，D值為縱坐標(biāo)，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)每個(gè)測(cè)定樣品的實(shí)際D值在該曲線圖上查出各自含量。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 11．5統(tǒng)計(jì)分析軟件，計(jì)量數(shù)據(jù)以表示，兩組間均數(shù)的比較用t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，多組之間均數(shù)的比較采用One-Way ANOVA進(jìn)行分析。P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

不同濃度apoA-Ⅰ 對(duì)巨噬細(xì)胞細(xì)胞毒性的影響THP-1細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞經(jīng)不同濃度(0、12．5、25、50、100、200 μg/mL)apoA-Ⅰ孵育 24 h 后，用 MTT 法檢測(cè)不同濃度時(shí)細(xì)胞的存活率，每個(gè)樣本重復(fù)3次，取平均值。結(jié)果顯示:分別經(jīng) 12．5、25、50、100、200 μg/mL apoA-Ⅰ孵育的THP-1細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞與不經(jīng)apoA-Ⅰ處理的細(xì)胞相比，細(xì)胞存活率僅略微下降。apoA-Ⅰ濃度為200 μg/mL時(shí)細(xì)胞存活率可達(dá)到98．4%，可以排除apoA-Ⅰ細(xì)胞毒性對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響(圖1)。與對(duì)照組相比，除12．5、25 μg/mL 兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(細(xì)胞存活率均接近100%)，其他3組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．001)。

圖1 不同濃度apoA-Ⅰ對(duì)THP-1細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞存活率的影響Fig 1 Cellular toxicity of apoA-1 in macrophages

apoA-Ⅰ 對(duì)L-PGDS mRNA表達(dá)的影響 用Image Quant TL軟件分析GAPDH和L-PGDS的電泳圖片，以目的基因L-PGDS與內(nèi)參GAPDH含量的比值來表示L-PGDS mRNA表達(dá)的相對(duì)水平，每個(gè)樣本重復(fù)3次，取平均值。結(jié)果顯示:分別經(jīng)12．5、25、50、100和200 μg/mL apoA-Ⅰ孵育的 THP-1細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞與不經(jīng) apoA-Ⅰ處理的細(xì)胞相比，L-PGDS mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別提高7．192%、18．944%、66．991%、49．406%和48．582%，各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．001)。且當(dāng)apoA-Ⅰ的濃度為50 μg/mL時(shí)，提高 L-PGDS mRNA表達(dá)作用最明顯(圖2)。

apoA-I對(duì)PGE2和PGD2蛋白表達(dá)的影響THP-1細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞經(jīng)不同濃度(0、12．5、25、50、100、200 μg/mL)apoA-Ⅰ孵育 24 h 后，用 ELISA方法檢測(cè)細(xì)胞上清液中PGE2和PGD2的蛋白含量，每個(gè)樣本重復(fù)3次，取平均值。結(jié)果顯示:經(jīng)12．5、25、50、100 和 200 μg/mL apoA-Ⅰ處理的巨噬細(xì)胞與對(duì)照組(apoA-Ⅰ0 μg/mL)相比，PGE2的蛋白表達(dá)量分別提高 20．006%、25．421%、32．948%、4．886% 和2．198%(圖 3);PGD2的蛋白表達(dá)量分別提高24．553%、29．831%、48．954%、18．072% 和15．224%(圖4)，各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．001)。且當(dāng)apoA-Ⅰ的濃度為50 μg/mL時(shí)，提高PGE2和PGD2蛋白表達(dá)作用最明顯(圖2)。

圖2 不同濃度apoA-Ⅰ誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞中L-PGDS mRNA的表達(dá)Fig 2 The L-PGDS mRNA expression in macrophages derived from THP-1 cells was determined by RT-PCR after the cells were treated with apoA-Ⅰ

圖3 不同濃度apoA-Ⅰ誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞中PGE2蛋白的表達(dá)Fig 3 The PGE2content in cultured supernatant was determined with ELISA after the macrophages were incubated with apoA-Ⅰfor 24 h

圖4 不同濃度apoA-Ⅰ誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞中PGD2蛋白的表達(dá)Fig 4 The PGD2content in cultured supernatant was determined with ELISA after the macrophages were incubated with apoA-Ⅰfor 24 h

討 論

AS是心腦血管事件發(fā)生的共同基礎(chǔ)，是造成心腦血管疾病和死亡的重要因素，其發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜且相互交織，有關(guān)學(xué)說甚多。其中炎性反應(yīng)學(xué)說對(duì)AS的發(fā)生發(fā)展過程解釋的較為全面，被認(rèn)為是AS發(fā)生和發(fā)展的核心機(jī)制，炎性因子參與了AS從發(fā)生到發(fā)展以及惡化的所有過程［6－7］。

長期服用臨床上常用的抗AS藥物存在著嚴(yán)重不良反應(yīng)，亟待找到安全、有效、不良作用小的抗AS藥物。由于apoA-Ⅰ是人體內(nèi)HDL的主要蛋白質(zhì)成分，安全、不良作用小的優(yōu)點(diǎn)使其開發(fā)前景十分誘人。關(guān)于HDL的抗AS作用及其機(jī)制的研究報(bào)道已經(jīng)很多，因此apoA-Ⅰ抗AS的機(jī)制研究越來越受到大家的關(guān)注。研究表明［8－9］:apoA-Ⅰ在將膽固醇由外周組織轉(zhuǎn)運(yùn)到肝中代謝的膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)(reverse cholesterol transport，RCT)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。apoA-Ⅰ可以顯著抑制AS的進(jìn)展，apoA-Ⅰ的長期穩(wěn)定表達(dá)能夠延緩AS的進(jìn)展，并使斑塊重塑到穩(wěn)定的表型。apoA-Ⅰ可能通過其抗炎、抗血栓形成和內(nèi)皮功能保護(hù)等多種作用抑制AS的發(fā)生和發(fā)展。但是目前關(guān)于apoA-Ⅰ抗AS具體作用機(jī)制的研究還有待完善，還有很多方面需要深入研究。

近年來，花生四烯酸及其代謝產(chǎn)物與AS病變的發(fā)生、發(fā)展及其與血管保護(hù)因子作用機(jī)制間的關(guān)系越來越受到關(guān)注。環(huán)氧化酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)是催化花生四烯酸產(chǎn)生前列腺素H2(prostaglandin H2，PGH2)的限速酶，后者在不同酶的催化下合成各種前列腺素類(prostaglandin，PG)產(chǎn)物，如在前列腺素E合成酶-1(type 1 membrane PGES，mPGES-1)催化下生成PGE2;在L-PGDS催化下生成PGD2等。PGE2和PGD2是單核巨噬細(xì)胞花生四烯酸代謝的兩種重要產(chǎn)物。研究顯示［10］，PGE2可防止血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，抑制SMC增殖;增強(qiáng)內(nèi)皮依賴性舒張功能，改善血凝纖溶失衡，抑制血小板聚集和血栓形成;并且對(duì)抗氧化應(yīng)激從而抑制DM性AS發(fā)生發(fā)展。近期有文獻(xiàn)表明PGE2還可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯水解和膽固醇排出，抑制膽固醇在細(xì)胞內(nèi)積聚;還可能參與巨噬細(xì)胞對(duì)粥樣斑塊穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)［11］。PGD2能抑制炎性細(xì)胞和炎性因子的黏附，并阻止血小板凝集［12－13］。因此PGE2和PGD2的生理功能有利于對(duì)AS的抑制。關(guān)于apoA-Ⅰ對(duì)PGE2和PGD2表達(dá)的影響以及它們與apoA-Ⅰ抗AS作用的關(guān)系尚未見報(bào)道。所以我們觀察了apoA-Ⅰ對(duì)參與AS的一種重要細(xì)胞即巨噬細(xì)胞表達(dá)PGE2和PGD2的影響，并探討它們與apoA-Ⅰ抗AS作用的關(guān)系。

本研究結(jié)果表明，與不經(jīng)apoA-Ⅰ孵育的THP-1細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞相比，經(jīng)不同濃度(12．5、25、50、100、200 μg/mL)apoA-Ⅰ孵育 24 h 后，巨噬細(xì)胞合成及釋放PGE2和PGD2的水平顯著提高，同時(shí)巨噬細(xì)胞中L-PGDS mRNA的表達(dá)水平也顯著提高。當(dāng)apoA-Ⅰ 濃度為 50 μg/mL時(shí)，其提高 L-PGDS mRNA表達(dá)及促進(jìn)PGE2和PGD2產(chǎn)生的作用最明顯。

本實(shí)驗(yàn)證明，apoA-Ⅰ可以顯著上調(diào)THP-1細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞中 L-PGDS mRNA及PGE2、PGD2蛋白的表達(dá)。我們認(rèn)為apoA-Ⅰ增加PGD2蛋白表達(dá)的作用是通過增加L-PGDS表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。促進(jìn)產(chǎn)生的PGE2和PGD2可以分別發(fā)揮自身的抗AS和血管保護(hù)作用。所以，我們認(rèn)為apoA-Ⅰ 除了可以通過已經(jīng)報(bào)道的一些作用機(jī)制發(fā)揮抗AS作用外，還可能通過增加PGE2和PGD2的表達(dá)來發(fā)揮抗AS的作用。此過程中可能還涉及復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制，我們會(huì)進(jìn)一步深入研究。

［1］ Wang L，Chen WZ，Wu MP，et al．Apolipoprotein A-Ⅰinhibits chemotaxis，adhesion，activation of THP-1 cells and improves the plasma HDL inflammatory index［J］．Cytokine，2010，49(2):194 －200．

［2］ Pedersen TX，Bro S，Andersen MH，et al．Effect of treatment with human apolipoprotein A-Ⅰon atherosclerosis in uremic apolipoprotein-E deficient mice［J］．Atherosclerosis，2009，202(2):372－381．

［3］ Moore KJ，Tabas I．Macrophages in the pathogenesis of atherosclerosis［J］．Cell，2011，145(3):341 －355．

［4］ Saleem S，Shah ZA，Urade Y，et al．Lipocalin-prostaglandin D synthase is a critical beneficial factor in transient and permanent focal cerebral ischemia［J］．Neuroscience，2009，160(1):248－254．

［5］ Cipollone F，CicoliniG，BucciM．Cyclooxygenase and prostaglandin synthases in atherosclerosis:Recent insights and future perspectives［J］．Pharmacol Ther，2008，118(2):161－180．

［6］ Patel S，Celermajer DS，Bao S．Atherosclerosis-Underlying inflammatory mechanisms and clinical implications［J］．Int J Biochem Cell Biol，2008，40(4):576 －580．

［7］ Di Tarantoa MD，Morgante A，Bracaled UM，et al．Altered expression of inflammation-related genes in human carotid atherosclerotic plaques［J］．Atherosclerosis，2012，220(1):93－101．

［8］ Rocco AG，Sensi C，Gianazza E，et al．Structural and dynamic features of apolipoprotein A-I cysteine mutants，Milano and Paris，in synthetic HDL［J］．J Mol Graph Model，2010，29(3):406－414．

［9］ Zhang Q，Liu L，Zheng XY．Protective roles of HDL，apoA-I and mimetic peptide on endothelialfunction:through endothelial cells and endothelial progenitor cells［J］．Int J Cardiol，2009，133(3):286 －292．

［10］ Smith JP，Haddad EV，Downey JD，et al．PGE2 decreases reactivity of human platelets by activating EP2 and EP4［J］．Thromb Res，2010，126(1):e23 － e29．

［11］ Linton MF， Fazio S．Cyclooxygenase products and atherosclerosis［J］．Cardiovasc Dis，2008，5(1):25 － 36．

［12］ Inoue T，Eguchi Y ，Matsumoto T，et al．Lipocalin-type prostaglandin D synthase is a powerful biomarker for severity of stable coronary artery disease［J］．Atherosclerosis，2008，201(2):385－391．

［13］ Tanaka R，Miwa Y，Mou K，et al．Knockout of the l-pgds gene aggravates obesity and atherosclerosis in mice［J］．Biochem Bioph Res Commun，2009，378(4):851 －856．