多重連接依賴(lài)的探針擴(kuò)增(MLPA)技術(shù)在自然流產(chǎn)樣本檢測(cè)中的應(yīng)用

劉敏娟 段程穎 王 瑋 闞慧娟 孫 健 王 挺 李 紅 陳 瑛

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院生殖與遺傳中心 蘇州 215002)

自然流產(chǎn)是產(chǎn)科的常見(jiàn)病之一，導(dǎo)致自然流產(chǎn)的原因很多，國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)均有報(bào)道，自然流產(chǎn)中胚胎染色體異常占50%左右［1］。

目前檢測(cè)染色體異常的技術(shù)有常規(guī)的染色體核型分析、熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)技術(shù)和多重連接依賴(lài)的探針擴(kuò)增(multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA)技術(shù)。核型分析是檢測(cè)染色體異常的常規(guī)方法，但其操作過(guò)程較長(zhǎng)，組織或細(xì)胞要經(jīng)過(guò)培養(yǎng)，若培養(yǎng)失敗、細(xì)胞過(guò)少或染色體形態(tài)較差時(shí)，尤其是流產(chǎn)的絨毛組織存在組織壞死、污染的風(fēng)險(xiǎn)較大，常常影響實(shí)驗(yàn)報(bào)告的準(zhǔn)時(shí)發(fā)放。另外核型分析難以分辨染色體的微小缺失或重復(fù)。FISH較核型分析而言大大縮短了實(shí)驗(yàn)周期，并且分辨率提高至1 kb，但其一次實(shí)驗(yàn)只能檢測(cè)較少的位點(diǎn)。

近年發(fā)展起來(lái)的MLPA具有通量高、分辨率高的特點(diǎn)。MLPA技術(shù)由Sehouten等［2］于2002年提出。它利用簡(jiǎn)單的雜交、連接及PCR擴(kuò)增反應(yīng)，于單一反應(yīng)管內(nèi)可同時(shí)檢測(cè)40個(gè)不同的核苷酸序列的拷貝數(shù)變化。到目前為止廣泛應(yīng)用于基因檢測(cè)及基因診斷等多個(gè)領(lǐng)域。由于13、18、21、X、Y染色體非整倍體發(fā)生率約占所有染色體非整倍體發(fā)生率的65%［3］，本實(shí)驗(yàn)采用MLPA非整倍體篩查試劑盒，探討MLPA技術(shù)在染色體重復(fù)、缺失以及易位時(shí)的檢出能力，以評(píng)價(jià)其在自然流產(chǎn)組織遺傳分析中的可行性和優(yōu)越性。

資料和方法

實(shí)驗(yàn)材料 在患者或家屬知情同意的前提下，收集南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院生殖與遺傳中心經(jīng)超聲檢查發(fā)現(xiàn)胚胎停止發(fā)育后行清宮術(shù)的絨毛組織12份。

實(shí)驗(yàn)方法

核型分析 用常規(guī)絨毛細(xì)胞培養(yǎng)和染色體核型分析。

絨毛DNA的提取 挑取流產(chǎn)絨毛約15 mg，采用Qiagen試劑盒提取DNA。用ND-1000測(cè)定DNA濃度和D260/D280比值，并將DNA稀釋至25 ng/μL。

MLPA反應(yīng) 本實(shí)驗(yàn)采用MLPA SALSA P290-B1試劑盒，其探針混合物包含13條染色體上的51個(gè)探針:除21號(hào)染色體6個(gè)探針，13號(hào)、18號(hào)、X染色體各4個(gè)探針，Y染色體2個(gè)探針之外，還包括17號(hào)染色體8個(gè)探針，15號(hào)染色體6個(gè)探針，22號(hào)染色體5個(gè)探針，1號(hào)、7號(hào)染色體各3個(gè)探針，4號(hào)、5號(hào)、8號(hào)染色體各2個(gè)探針，依照試劑盒操作說(shuō)明操作，產(chǎn)物用ABI3130基因分析儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳。

數(shù)據(jù)分析 用Genemarker軟件分析MLPA產(chǎn)物的毛細(xì)管電泳結(jié)果，并與細(xì)胞遺傳學(xué)分析結(jié)果比對(duì)。

結(jié) 果

核型分析 運(yùn)用常規(guī)染色體核型分析12例流產(chǎn)絨毛樣本，其中1例因培養(yǎng)失敗未能得到核型，故只得到11例核型結(jié)果(表1)。樣本9核型分析結(jié)果為結(jié)構(gòu)異常:46，XX，22q+(圖1A)，增加的片段來(lái)源不明確，懷疑為8號(hào)染色體部分片段。樣本2核型分析結(jié)果為:46，XY，－9，+15?(圖2A)，缺失一條9號(hào)染色體，增加的部分懷疑為15號(hào)染色體的部分片段。

MLPA反應(yīng) 運(yùn)用MLPA技術(shù)成功分析了12例流產(chǎn)絨毛DNA，核型分析未成功的1例樣本經(jīng)MLPA分析未見(jiàn)異常。結(jié)合核型分析結(jié)果，在這12例樣本中共發(fā)現(xiàn)7例非整倍體和1例結(jié)構(gòu)異常(表1)。

表1 細(xì)胞遺傳學(xué)分析與MLPA技術(shù)在流產(chǎn)絨毛染色體檢測(cè)中的比較Tab 1 The comparison of Karyotype and MLPA in chromosome detection of miscarriage villus

樣本9的MLPA檢測(cè)結(jié)果為:女性，8號(hào)染色體8q4．12，8q24．11 上2 個(gè)探針信號(hào)增強(qiáng)，2 個(gè) 22q13．33探針信號(hào)降低(圖1B、C)。提示:22號(hào)染色體增加的片段來(lái)源于8號(hào)染色體，并且22號(hào)染色體上22q13．33區(qū)段缺失。

圖1 樣本9核型分析及MLPA結(jié)果圖Fig 1 Result of Karyotype and MLPA of subject sample No．9

7例非整倍體樣本中，樣本2的MLPA檢測(cè)結(jié)果顯示:男性，15q11、15q24上4個(gè)探針信號(hào)增加，確定增加的染色體來(lái)源于15號(hào)染色體(圖2B、C)，由于MLPA非整倍體試劑盒不包括9號(hào)染色體探針，故該樣本9號(hào)染色體缺失未檢出。

圖2 樣本2核型分析及MLPA結(jié)果圖Fig 2 Result of Karyotype and MLPA of subject sample No．2

另有3例核型分析顯示12、14、16號(hào)染色體上的非整倍體，由于MLPA非整倍體試劑盒中亦不包含12、14、16號(hào)染色體上的探針，因此未檢出異常。再者，MLPA試劑盒不適用于多倍體的檢測(cè)，故1例核型分析為四倍體的樣本MLPA檢測(cè)未見(jiàn)異常。

討 論

孕早期胚胎染色體異常是自然流產(chǎn)的重要原因。有研究表明，自然流產(chǎn)中胚胎染色體異常占50%左右［1］。自然流產(chǎn)胚胎的細(xì)胞遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，由于染色體數(shù)目異常所致的胚胎發(fā)育不良而造成的妊娠中斷，是自然流產(chǎn)最常見(jiàn)的原因之一［4］。受精卵細(xì)胞的正常分裂是胚胎發(fā)育過(guò)程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其中染色體分離異常，不僅可導(dǎo)致胚胎的染色體數(shù)目異常，而且可影響胚胎細(xì)胞的生長(zhǎng)周期，引起細(xì)胞周期的延遲、細(xì)胞分裂的停止，甚至胚胎死亡。

在本實(shí)驗(yàn)的流產(chǎn)絨毛染色體分析中，有66．7%(8/12)出現(xiàn)染色體異常，其中結(jié)構(gòu)異常1例，占異常核型的12．5%;數(shù)目異常7例，占異常核型的87．5%。細(xì)胞染色體數(shù)目異常在群體中發(fā)生率約3%，在前3個(gè)月的自然流產(chǎn)胚胎中發(fā)生率可高達(dá)50%～60%，這種染色體數(shù)目異常的改變主要有常染色體三體、X單體和多倍體等［5］。染色體數(shù)目畸變的主要發(fā)生源自雙親之一的配子形成時(shí)或妊娠初期受精卵卵裂時(shí)出現(xiàn)了某號(hào)染色體不分離，則導(dǎo)致該染色體增多或減少一條，亦即導(dǎo)致三體性或單體性。21-三體在活產(chǎn)兒中最常見(jiàn)，13-三體、18-三體也偶爾可見(jiàn)，而其他常染色體的三體性大多導(dǎo)致流產(chǎn)，本實(shí)驗(yàn)所用的MLPA P290試劑盒主要用于檢測(cè)13、18及21號(hào)染色體的微缺失或微重復(fù)。性染色體的三體性在活產(chǎn)女?huà)胫杏幸?jiàn)，性染色體的單體性不僅見(jiàn)于流產(chǎn)兒，也見(jiàn)于兒童或成人。多倍體在流產(chǎn)兒中也十分常見(jiàn)，本文為1例，占全部樣本的8．3%。這種染色體的數(shù)目異?？稍醋孕碌耐蛔儯蛟醋噪p親之一配子形成中的異常有絲分裂或源自精母細(xì)胞或卵母細(xì)胞減數(shù)分裂中的異常，也可源自雙受精等。

目前，檢測(cè)染色體的非整倍性改變的基本方法為染色體核型分析，但是它在檢測(cè)羊水細(xì)胞、絨毛或其他胎兒細(xì)胞時(shí)，需要進(jìn)行體外細(xì)胞培養(yǎng)，若培養(yǎng)失敗、細(xì)胞過(guò)少或染色體形態(tài)較差時(shí)，常常影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。應(yīng)用MLPA檢測(cè)這類(lèi)標(biāo)本時(shí)，不需要體外培養(yǎng)，少量標(biāo)本即可進(jìn)行檢測(cè)，針對(duì)易發(fā)生非整倍性改變的染色體上的幾個(gè)熱點(diǎn)基因設(shè)計(jì)特異性探針，根據(jù)特定基因拷貝數(shù)的改變，即可確定染色體數(shù)目的異常。

MLPA具有高度特異性，如果靶序列與探針序列不完全互補(bǔ)，即使只有一個(gè)堿基的差別，也會(huì)導(dǎo)致雜交不完全，使連接反應(yīng)無(wú)法進(jìn)行。只有當(dāng)連接反應(yīng)完成，才能進(jìn)行隨后的PCR擴(kuò)增并收集到相應(yīng)探針的擴(kuò)增峰，如果檢測(cè)的靶序列發(fā)生點(diǎn)突變或缺失、擴(kuò)增突變，則相應(yīng)探針的擴(kuò)增峰便會(huì)缺失、降低或增加，因此，根據(jù)擴(kuò)增峰的改變就可判斷靶序列是否有拷貝數(shù)的異常或點(diǎn)突變存在。

由于MLPA技術(shù)具有方便快捷、特異性高的特點(diǎn)，國(guó)內(nèi)外均有研究將該技術(shù)作為核型分析的補(bǔ)充手段，用于胎兒、新生兒及流產(chǎn)組織的非整倍體檢測(cè)［6－8］，這些研究多采用端粒試劑盒(P036、P069 或P070)，在核型分析的基礎(chǔ)上大大增加了染色體異常的檢出率?？紤]到流產(chǎn)絨毛染色體的異常多發(fā)于13、18、21、X 和 Y 染色體［8］，還包括了其他染色體的數(shù)目異常［9］和微缺失［10－11］等，為盡可能覆蓋與已知流產(chǎn)密切相關(guān)的染色體畸變，本實(shí)驗(yàn)選擇了組合型試劑盒SALSA P290-B1，除能檢查常見(jiàn)的13、18、21、X和Y 5條常見(jiàn)染色體非整倍體情況，同時(shí)還可對(duì)常見(jiàn)14種染色體微缺失/微重復(fù)情況進(jìn)行檢測(cè)。因?yàn)槠涓叨鹊奶禺愋?，本?shí)驗(yàn)中1例結(jié)構(gòu)異常樣本，細(xì)胞遺傳學(xué)分析僅能判斷出22號(hào)染色體上有一段增加的染色體片段，懷疑來(lái)源于8號(hào)染色體，但無(wú)法判斷其確切來(lái)源，且無(wú)法分析微缺失或微重復(fù)。MLPA則準(zhǔn)確檢測(cè)出此段染色體來(lái)源于8號(hào)染色體，并檢測(cè)出22q13．33有微缺失，可能由于22q13．33區(qū)段位于22號(hào)染色體長(zhǎng)臂末端，在8號(hào)染色體片段易位其上時(shí)丟失。另外，由于常規(guī)的染色體核型分析通過(guò)鏡下觀(guān)察，染色體片段較小時(shí)判讀困難，本實(shí)驗(yàn)中1例非整倍體樣本細(xì)胞遺傳學(xué)分析結(jié)果為:46，XY，-9，+15?，懷疑增加的那條染色體來(lái)源于15號(hào)染色體，MLPA檢測(cè)結(jié)果為:男性，15q11、15q24上4個(gè)探針信號(hào)增加，證實(shí)增加的那條染色體來(lái)源于15號(hào)染色體，對(duì)核型分析結(jié)果起到了補(bǔ)充校正作用。

然而MLPA也有其不足之處，它僅能檢測(cè)出實(shí)驗(yàn)所用探針?biāo)甘镜奈稽c(diǎn)，也就是說(shuō)無(wú)法檢測(cè)未知位點(diǎn)的缺失、重復(fù)或突變。本實(shí)驗(yàn)所用的 MLPA P290-B1試劑盒不包含12號(hào)、14號(hào)、16號(hào)等其他10條染色體信息，故本實(shí)驗(yàn)中4例發(fā)生在9、12、14、16號(hào)染色體上的數(shù)目異常未能檢出。若能針對(duì)相應(yīng)染色體的熱點(diǎn)基因設(shè)計(jì)特定探針便可解決這一問(wèn)題。另外，由于MLPA技術(shù)是依據(jù)基因拷貝數(shù)比較來(lái)判讀結(jié)果，不適用于多倍體的檢出，故本實(shí)驗(yàn)中1例92，XXYY未能檢出。

總之，作為一種新的技術(shù)，MLPA技術(shù)基于其高效、特異、快速、簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，已被運(yùn)用于18-三體、21-三體、假肥大性肌營(yíng)養(yǎng)不良、脊髓性肌萎縮癥、Dandy-Walker綜合征等多種臨床疾病的基因檢測(cè)。但同時(shí)仍存有一些不足，如需要精確測(cè)量DNA濃度，不適合檢測(cè)未知突變位點(diǎn)、平衡易位及多倍體。在流產(chǎn)樣本的染色體分析中，它能彌補(bǔ)傳統(tǒng)細(xì)胞遺傳學(xué)分析的不足，檢測(cè)微小缺失、重復(fù)或突變，且與FISH、微陣列基因組雜交等方法比較，除了具有操作簡(jiǎn)單快捷的優(yōu)點(diǎn)外，其經(jīng)濟(jì)成本也較低，可廣泛應(yīng)用于臨床，作為核型分析的重要補(bǔ)充，以提高染色體異常的檢出率。

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