microRNA在結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移中作用機(jī)制的研究進(jìn)展

蔡彥韜(綜述) 陳宗祐(審校)

(復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院普外科 上海 200040)

結(jié)直腸癌(colorectal carcinoma，CRC)是最常見的消化道腫瘤之一，死亡率位居惡性腫瘤第2位，超過50%的CRC患者最終死于腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)的并發(fā)癥。CRC的轉(zhuǎn)移是一個復(fù)雜的多步驟綜合的生物學(xué)過程，包括有腫瘤細(xì)胞抗凋亡、上皮細(xì)胞間質(zhì)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)、增殖侵襲及血管生成等，多種因子交雜成信號網(wǎng)絡(luò)參與調(diào)控。對于轉(zhuǎn)移相關(guān)調(diào)控因子的探索研究將為今后CRC的早期診斷及綜合治療提供理論依據(jù)和進(jìn)一步科研方向。

microRNA(miRNA)是一組長度19到22核苷酸的非編碼序列RNA，參與細(xì)胞分化、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、應(yīng)激以及凋亡等諸多重要細(xì)胞程序過程中的基因表達(dá)調(diào)控，多達(dá)30%的人類基因受到miRNA的調(diào)控［1］。隨著微陣列技術(shù)及RT-PCR的發(fā)展，關(guān)于miRNA與腫瘤發(fā)生發(fā)展的研究正成為科研熱點(diǎn)，以乳腺癌為代表的腫瘤學(xué)研究已證明miRNA參與多種腫瘤轉(zhuǎn)移過程中某些關(guān)鍵步驟的調(diào)節(jié)［2］。而目前類似的研究在CRC中相對較少，由于miRNA表達(dá)具有高度組織特異性，所以盡管近年在分子生物學(xué)、組織學(xué)等方面取得了一定進(jìn)展，其在CRC轉(zhuǎn)移過程中的作用及機(jī)制仍需要更多的研究結(jié)果加以支持。本文通過miRNA在凋亡、上皮細(xì)胞間質(zhì)化、血管生成及細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面進(jìn)行闡述，對近年miRNA在CRC轉(zhuǎn)移各通路中的作用與機(jī)制的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

miRNA合成流程 miRNA在基因組DNA上有各自對應(yīng)的區(qū)域。這些DNA在RNA聚合酶II的作用下得到轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，稱為初級miRNA分子(primary miRNA，pri-miRNA)。pri-miRNA被核酸內(nèi)切酶III-Dorsha及其輔助因子DGCR8加工為前體miRNA(precursorpre-miRNA，pre-miRNA)，premiRNA具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)，長度約為40個核苷酸，通過輸出蛋白5(exportin-5)的協(xié)作，從細(xì)胞核被運(yùn)輸至胞質(zhì)。胞質(zhì)內(nèi)的RNA酶III(Dicer)將pre-miRNA的莖環(huán)結(jié)構(gòu)切開，使之成為miRNA雙鏈體結(jié)構(gòu)，隨后雙鏈結(jié)構(gòu)迅速降解為單鏈結(jié)構(gòu)的miRNA，即成熟的miRNA。成熟的miRNA結(jié)合到RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex，RISC)發(fā)揮其生物效應(yīng)。RISC通過堿基不完全配對結(jié)合至靶mRNA的 3'非翻譯區(qū)(3'untranslated region，3'UTR)，抑制靶mRNA翻譯過程或介導(dǎo)靶mRNA的降解［3］。

miRNA通過堿基不完全配對可與多種靶mRNA結(jié)合?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的1 000種左右miRNA參與超過5 300種人類基因的調(diào)控，占到人類基因的 30%［4］。

miRNA受多種方式的調(diào)節(jié)，包括miRNA基因區(qū)域的過甲基化，組蛋白修飾以及SNP調(diào)節(jié)，以上調(diào)節(jié)方式在腫瘤相關(guān)miRNA的調(diào)控中發(fā)揮重要作用。

miRNA與CRC細(xì)胞凋亡 腫瘤細(xì)胞凋亡通過外源性及內(nèi)源性途徑完成。外源性途徑依靠細(xì)胞膜上凋亡受體(FASL，TRAIL，TNFR)與配體結(jié)合，激活下游caspase8，引發(fā)“瀑布反應(yīng)”導(dǎo)致凋亡。內(nèi)源性途徑以線粒體作為調(diào)控核心，在上游BCL-2家族蛋白的調(diào)解下釋放線粒體蛋白，包括參與caspase9構(gòu)成的細(xì)胞色素C(cytochrome C，cyt C)，從而激活下游caspase的“瀑布反應(yīng)”。

P53作為促使腫瘤細(xì)胞凋亡的重要蛋白，參與多種miRNA的調(diào)控。這種調(diào)控自轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后階段影響許多mRNA的翻譯，與這些靶mRNA匹配的miRNA也隨之受到調(diào)控［5］。相反，P53亦受一些miRNA的調(diào)節(jié)，如 miR29家族，包括 miR29a，miR29b，miR29c，通過作用于CDC42及p85a對P53起到正向調(diào)節(jié)作用，促P53水平升高起到促進(jìn)對于惡變細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)［6］。

miR34家族是 TP53的直接下游靶基因［7］。Tazawa等［8］報道CRC細(xì)胞受miR34a轉(zhuǎn)染后誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入衰老凋亡狀態(tài)，細(xì)胞內(nèi)p53表達(dá)升高，促癌因子E2F下調(diào)，且這種調(diào)控在p53缺失的腫瘤細(xì)胞中無效，證明TP53也是miR34a發(fā)揮抑癌效應(yīng)的可能作用靶位。由此可以推測p53與miR34a間存在正向調(diào)節(jié)的環(huán)路，兩者相互促進(jìn)發(fā)揮促癌細(xì)胞凋亡效應(yīng)［9］。另有研究通過翻譯寡核苷酸轉(zhuǎn)染法去除miR34a功能的小鼠胚胎干細(xì)胞，證明凋亡通路中的BCL-2蛋白家族直接受miR34a的負(fù)向調(diào)節(jié)［10］。miR34基因的丟失導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的抗凋亡，在臨床上顯示為對促凋亡化療藥物的敏感性下降［11］。同樣作用于BCL-2其促凋亡效果的的還有 miR195［12］。

巨噬細(xì)胞遷徙抑制因子(macrophage migration inhibitory factor，MIF)是一種在細(xì)胞免疫、炎癥反應(yīng)中的重要因子，在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展以及缺氧誘發(fā)的凋亡過程中發(fā)揮重要作用，且已被證明具有抑制p53活性的效應(yīng)［13－14］。MIF是miR451的潛在靶點(diǎn)，Bandrés等［15］通過活檢標(biāo)本的檢測，觀察到消化道腫瘤中過表達(dá)的miR451同時抑制MIF的mRNA及蛋白表達(dá)，具有抑制腫瘤生長的效果。

miRNA與CRC細(xì)胞的EMT EMT是體內(nèi)將具有極性且活動性弱的上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槭O性而活動性強(qiáng)的間質(zhì)細(xì)胞的一種細(xì)胞程序，是腫瘤細(xì)胞適應(yīng)微環(huán)境改變的途徑，致其脫離瘤體，進(jìn)入脈管系統(tǒng)發(fā)生轉(zhuǎn)移及播散。

腫瘤細(xì)胞生長過程中合成釋放的轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor β，TGFβ)是 EMT 中最主要的促進(jìn)因子，能夠強(qiáng)烈增加促鋅指結(jié)合蛋白(zincfinger-enhancer binding protein，ZEB)的表達(dá)水平，下調(diào)E鈣黏蛋白而上調(diào)波形蛋白(vimentin)水平，使腫瘤細(xì)胞發(fā)生失極性，黏附力下降以及活動能力提高，促進(jìn)細(xì)胞自瘤體脫落進(jìn)入循環(huán)［16－17］。

EMT與miRNA有相當(dāng)密切的關(guān)系，miR200家族在其中的地位尤其重要。發(fā)生EMT的CRC細(xì)胞內(nèi)存在miR200水平的下降。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)低水平miR200環(huán)境下，胞內(nèi)促進(jìn)胞間緊密連接的E鈣黏蛋白水平降低，促進(jìn)EMT發(fā)生的波形蛋白水平則升高，腫瘤細(xì)胞呈EMT趨勢;相反，高水平miR200轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞，則可觀察到E鈣黏蛋白水平升高及細(xì)胞上皮化(enchymal-epithelial tranition，MET)趨勢。ZEB蛋白被認(rèn)為是miR200抑制EMT效應(yīng)的靶位，同時具有抑制miR200效應(yīng)，兩者構(gòu)成互相抑制的環(huán)路，使 miR200 在 EMT 中更顯重要［18－19］。

除miR200家族外，miR21也參與腫瘤細(xì)胞EMT的過程。CRC細(xì)胞中 miR21所在基因區(qū)域的拷貝增加較常見，在CRC轉(zhuǎn)移株中則更普遍。組織學(xué)研究證實(shí)CRC肝轉(zhuǎn)移組織內(nèi)miR21水平顯著高于原位CRC組織［20］。TGFβ可能是miR21的上游因子，依據(jù)來自高水平TGFβ處理CRC后可觀察到 miR21表達(dá)增加［21］。miR21在CRC中促進(jìn)EMT的機(jī)制可能與抑制程序性細(xì)胞死亡因子4(programmed cell death 4，PDCD4)有關(guān)，Selcuklu等［22］在 miR21 基因區(qū)敲除后的腫瘤細(xì)胞中觀察到PDCD4表達(dá)升高且侵襲性下降，這種反向關(guān)系在CRC組織中也得到了證實(shí)［23］。

miRNA與CRC血管生成 血管生成是腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移過程中的重要步驟。缺氧是誘發(fā)新生血管生成最主要的因素，血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是其中最關(guān)鍵的細(xì)胞因子。當(dāng)腫瘤組織出現(xiàn)缺氧時，缺氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)即刻高表達(dá)。HIF-1刺激VEGF-A mRNA高表達(dá)，隨即VEGF-A組織水平升高，同時出現(xiàn)VEGF受體表達(dá)升高，以此介導(dǎo)新生血管形成以對抗缺氧，且為瘤細(xì)胞脫落遷徙提供途徑［24］。

多種miRNA可能參與上述缺氧-HIF-VEGF通路的調(diào)控。Yamakuchi等［25］發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌組織中miR22水平低于正常組織，并證實(shí)CRC細(xì)胞內(nèi)高水平的 miR22可抑制HIF1a的表達(dá)，下游VEGF的表達(dá)減少;相反，敲除內(nèi)源性 miR22后則觀察到HIF1a和VEFG水平的升高。故可以明確miR22作用于HIF1a，抑制CRC細(xì)胞內(nèi)缺氧誘導(dǎo)的血管生成效應(yīng)。

miR619作用于VEGF基因，上調(diào)VEGF蛋白合成促進(jìn)腫瘤血管生成，且miR619本身受VEGF蛋白正向調(diào)控，兩者構(gòu)成正向反饋調(diào)節(jié)環(huán)路。而抗VEGF處理的 CRC細(xì)胞，其 miR619水平亦發(fā)生下調(diào)［26］。

抑癌基因TP53對于腫瘤血管生成存在抑制效應(yīng)，促腫瘤細(xì)胞進(jìn)入凋亡程序。miR107定位于染色體10q23．31區(qū)，在11%的CRC患者中存在該區(qū)域的缺失［27］。TP53可促進(jìn)下游的miR107表達(dá)增加，后者結(jié)合mRNA抑制HIF-1的翻譯以抑制腫瘤血管生成［28］。缺氧處理的CRC細(xì)胞中，高miR107水平組其VEGF顯著低于低miR107水平組。動物試驗(yàn)也證實(shí)高miR107導(dǎo)致VEGF低表達(dá)，低血管密度以及低腫瘤大小的特點(diǎn)。

miRNA與CRC細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo) 腫瘤細(xì)胞通過多條胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路傳遞以獲得增殖、侵襲及遷徙能力，KRAS途徑是其中最重要的一條通路。Let-7家族是最早被發(fā)現(xiàn)的miRNA之一，其作用位點(diǎn)在KRAS上，抑制KRAS的表達(dá)起到抑癌作用。Akao等［29］報道let-7miRNA在CRC組織中多呈低表達(dá)。let-7轉(zhuǎn)染CRC細(xì)胞后，在翻譯水平下調(diào)胞內(nèi)KRAS以及促腫瘤血管生成的c-myc蛋白水平，阻止新生血管形成。

miRNA143定位于染色體5q32，CRC標(biāo)本中5q24-32區(qū)常發(fā)生丟失，miR143于腫瘤組織內(nèi)低表達(dá)［21，30］。miRNA143前體轉(zhuǎn)染入CRC細(xì)胞導(dǎo)致KRAS通路下游因子ERK5蛋白水平的下降，盡管具體作用靶點(diǎn)尚不清楚，其抑制RAS通路發(fā)揮抑制腫瘤發(fā)展的作用是可以肯定的［20，31］。

miR17/92受c-myc蛋白正調(diào)控，對CRC細(xì)胞使用miR17/92轉(zhuǎn)染以及基因區(qū)敲除實(shí)驗(yàn)，證明其直接下調(diào)抑癌因子，即抗血管生成蛋白1(antiangiogenic thrombospondin-1，Tsp1)和結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)的合成，促進(jìn)CRC侵襲與轉(zhuǎn)移［32］。

酪氨酸激酶受體激活通過PI3K-AKT途徑激發(fā)腫瘤細(xì)胞內(nèi)抗凋亡反應(yīng)，也是腫瘤細(xì)胞生存、轉(zhuǎn)移所依賴的重要細(xì)胞通路。Schimanski等［33］通過miR196轉(zhuǎn)染CRC細(xì)胞觀察到AKT磷酸化的增高，說明miR196作用下PI3K-AKT途徑受到促進(jìn)。此外miR196在CRC轉(zhuǎn)移組織中的水平高于原位組織，都說明其促進(jìn)CRC轉(zhuǎn)移的作用。

總結(jié)與展望 本文總結(jié)了miRNA在CRC轉(zhuǎn)移中各通路中的作用機(jī)制與靶位(表1)。

表1 CRC轉(zhuǎn)移相關(guān)miRNA在CRC中的表達(dá)、作用機(jī)制及靶點(diǎn)Tab 1 miRNA involved in metastasis of CRC-functions and targets

有關(guān)miRNA與CRC轉(zhuǎn)移的研究在逐漸揭示CRC發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的機(jī)制同時，也為將來CRC的早期診斷、預(yù)后評估及靶向治療等領(lǐng)域照亮了前路。隨著微陣列技術(shù)與qRT-PCR的發(fā)展與普及，miRNA可作為腫瘤標(biāo)志物對腫瘤發(fā)生以及腫瘤轉(zhuǎn)移進(jìn)行早期診斷，針對特定miRNA的干預(yù)有望提高化療藥物對于CRC原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶的治療敏感性，靶向干預(yù)miRNA也可作為新理念用以開發(fā)新型化療藥物。隨著越來越多實(shí)驗(yàn)及臨床證據(jù)的積累，miRNA在CRC轉(zhuǎn)移過程中的機(jī)制逐漸被揭示，也為CRC轉(zhuǎn)移的臨床診斷及治療提供了美好的發(fā)展前景。

［1］ Rajewsky N．microRNA target predictions in animals［J］．Nat Genet，2006，38:S8 － S13．

［2］ Nicoloso MS，Spizzo R，Shimizu M，et al．MicroRNAs—the micro steering wheel of tumour metastases［J］．Nature Rev Cancer，2009，9(4):293 －302．

［3］ Bartel DP．MicroRNAs，genomics，biogenesis，mechanism，and function［J］．Cell，2004，116(2):281 － 297．

［4］ Lewis BP，Burge CB，Bartel DP．Conserved seed pairing，often flanked by adenosines，indicates that thousands of human genes are microRNA targets［J］．Cell，2005，120(1):15－20．

［5］ Xi Y，Shalgi R，F(xiàn)odstad O，et al．Differentially regulated micro-RNAsand actively translated messenger RNA transcripts by tumor suppressor p53 in colon cancer［J］．Clin Cancer Res，2006，12:2014 －2024．

［6］ Park SY，Lee JH，Ha M，et al．miR-29 miRNAs activate p53 by targeting p85 alpha and CDC42［J］．Nat Struct Mol Biol，2009，16(1):23 －29．

［7］ Raver-Shapira N，Marciano E，Meiri E，et al．Transcriptional activation of miR-34a contributes to p53-mediated apoptosis［J］．Mol Cell，2007，26(5):731 －743．

［8］ Tazawa H，Tsuchiya N，Izumiya M，et al．Tumor-suppressive miR-34a induces senescence-like growth arrest through modulation of the E2F pathway in human colon cancer cells［J］．Proc Natl Acad Sci USA，2007，104(39):15472－15477．

［9］ Yamakuchi M，F(xiàn)erlito M，Lowenstein CJ．miR-34a repression of SIRT1 regulates apoptosis［J］．Proc Natl Acad Sci U S A，2008，105(36):13421 －13426．

［10］ Bommer GT，Gerin I，F(xiàn)eng，Y，et al．p53-mediated activation of miRNA34 candidate tumor-suppressor genes［J］．Curr Biol，2007，17(15):1298 －1307．

［11］ Fujita Y，Kojima K，Hamada N，et al．Effects of miR-34a on cell growth and chemoresistance in prostate cancer PC3 cells［J］．Biochem Biophys Res Commun，2008，377(1):114－119．

［12］ Lin L，Chen L，Xu Y，microRNA-195 promotes apoptosis and suppresses tumorigenicity of human colorectal cancer cells［J］．Biochem Biophys Res Commun，2010，400(2):236－240．

［13］ Wilson JM，Coletta PL，Cuthbert RJ，et al．Macrophage migration inhibitory factor promotes intestinal tumorigenesis［J］．Gastroenterology，2005，129(5):1485 －1503．

［14］ Ohkawara T，Nishihira J，Takeda H，Pathophysiological roles of macrophage migration inhibitory factor in gastrointestinal，hepatic，and pancreatic disorders［J］．Gastroenterol，2005，40(2):117－122．

［15］ Bandrés E，Cubedo E，Agirre X，et al，Identification by realtime PCR of 13 mature microRNAs differentially expressed in colorectal cancer and non-tumoral tissues［J］．Mol Cancer，2006，5:29．

［16］ Zhang H，Li Y，Lai M．The microRNA network and tumor metastasis［J］．Oncogene，2010，29(7):937 － 948．

［17］ Hugo H， Ackland ML， Blick T， et al．Epithelialmesenchymaland mesenchymal-epithelialtransitionsin carcinoma progression［J］．Cell Physiol，2007，213(2):374－383．

［18］ Gregory PA，Bert AG，Paterson EL，et al，The miR-200 family and miR-205 regulate epithelial to mesenchymal transition by targeting ZEB1 and SIP1［J］．Nature Cell Biol，2008，10(5):593 －601．

［19］ Burk U，Schubert J，Wellner U，et al，A reciprocal repression between ZEB1 and members of the miR-200 family promotes EMT and invasion in cancer cells［J］．EMBO Rep，2008，9(6):582－289．

［20］ Kulda V，Pesta M，Topolcan O，et al．Relevance of miR-21 and miR-143 expression in tissue samples of colorectal carcinoma and its liver metastases［J］．Cancer Genet Cytogenet，2010，200(2):154 －160．

［21］ Michael MZ，van Holst Pellekaan NG，Young GP，et al．Reduced accumulation of specific microRNAs in colorectal neoplasia［J］．Mol Cancer Res，2003，1(12):882 － 891．

［22］ Selcuklu SD，Donoghue MT，Spillane C．miR 21 as a key regulator of oncogenic processes［J］．Biochem Soc Trans，2009，37(4):918 －925．

［23］ Chang KH，Miller N，Kheirelseid EA．MicroRNA-21 and PDCD4 expression in colorectal cancer［J］．Eur J Surg Oncol，2011，37(7):597 －603．

［24］ Shweiki D，Itin A，Soffer D，et al．Vascular endothelial growth factor induced by hypoxia may mediate hypoxiainitiated angiogenesis［J］．Nature，1992，359:843 － 845．

［25］ Yamakuchi M，Yagi S，Ito T，et al．MicroRNA-22 regulates hypoxia signaling in colon cancer cells［J］．PLoS One，2011，6(5):202 －209．

［26］ Dumoutier L，Leemans C，Lejeune D，et al．Cutting edge:STAT activation by IL-19，IL-20 and mda-7 through IL-20 receptor complexes of two types［J］．Immunol，2001，167(7):3545－3549．

［27］ De Angelis PM，Clausen OP，Schjolberg A，etal ．Chromosomalgains and losses in primary colorectal carcinomas detected by CGH and their associations with tumour DNA ploidy，genotypes and phenotypes［J］．Br J Cancer，1999，80(3 －4):526 －535．

［28］ Yamakuchi M，Lotterman CD，Bao C，et al．P53-induced microRNA-107 inhibits HIF-1 and tumor angiogenesis［J］．Proc Natl Acad Sci USA，2010，107(14):6334 －6339．

［29］ Akao Y，Nakagawa Y，Naoe T．let-7 microRNA functions as a potential growth suppressor in human colon cancer cells［J］．Biol Pharm Bull，2006，29(5):903 －906．

［30］ De Angelis PM，Clausen OP， Schjolberg A， et al．Chromosomalgains and losses in primary colorectal carcinomas deteted by CGH and their associations with tumour DNA ploidy，genotypes and phenotypes［J］．Br J Cancer，1999，80(3 －4):526 －535．

［31］ Akao Y，Nakagawa Y，Naoe T．MicroRNAs 143 and 145 are possible common oncomicroRNAs in human cancers［J］．Oncol Rep，2006，16(4):845 －850．

［32］ Zhao HY，Ooyama A，Yamamoto M，et al．Down regulation of c-Myc and induction of an angiogenesis inhibitor，thrombospondin-1，by 5-FU in human colon cancer KM12C cells［J］．Cancer Lett，2008，270(1):156 － 163．

［33］ Schimanski CC，F(xiàn)rerichs K，Rahman F，et al．High miR-196a levels promote the oncogenic phenotype of colorectal cancer cells［J］．World J Gastroenterol，2009，15(17):2089－2096．