葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導的小鼠腸炎模型中CD19+CD5+CD1dhiB細胞的表達及抑炎作用

汪路曼 錢 靜 劉小明 常麗君 儲以微

(復旦大學基礎醫(yī)學院免疫學系 上海 200032)

人類炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)是一種腸道免疫系統(tǒng)異常反應所致的腸道炎癥損傷性病變，包括克羅恩氏病(Crohn's disease，CD)和潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)，其病因和發(fā)病機制尚未完全明確［1－2］。葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium，DSS)誘導的小鼠腸道損傷是人類炎性腸病的實驗性動物模型。其病程可分為炎癥加重期(第1～10天)和炎癥緩解期(第11天后)，主要癥狀為腹瀉、便血和體重減輕，病理學表現為全結腸的炎性細胞浸潤和糜爛［3－5］。

作為機體中一類重要的免疫細胞，B細胞在免疫和炎癥反應中行使著多種功能。B細胞不僅可以介導體液免疫和細胞免疫發(fā)揮正性免疫調節(jié)作用，近年來的研究顯示B細胞中還存在著發(fā)揮負性調節(jié)作用的細胞亞群［6－7］。CD19+CD5+CD1dhiB 細胞是新近報道的一種發(fā)揮負性調節(jié)作用的B細胞，其免疫調節(jié)作用已在多種疾病模型中得到證實［8－9］。然而有關這類B細胞在腸炎模型中的研究不多，尤其在疾病過程中其數量比例以及功能的動態(tài)變化尚不清楚。因此，本文擬以DSS誘導的小鼠腸炎為研究模型，聚焦CD19+CD5+CD1dhiB細胞，通過流式檢測其在疾病發(fā)展中的比例變化，分析其在疾病進程中的抑炎作用，為臨床IBD的研究和疾病的治療提供新思路。

材料和方法

實驗動物及試劑 8～12周雌性C57BL/6小鼠(200只)購于斯萊克公司，SPF級環(huán)境飼養(yǎng)于復旦大學基礎醫(yī)學院動物實驗中心。相對分子質量(Mr)為36 000～50 000的DSS購自美國MP Biomedicals公司;脂多糖(LPS)、離子霉素(Ionomycin)、佛波酯(PMA)均購自美國Sigma公司;莫能星(monensin)，抗 CD16/CD32 Fc block，FITC-抗 CD19，IFN-γ，TNF-α和IL-6 ELISA抗體均購自美國eBioscience公司;PE-抗CD5和Alexa flour 647-抗CD1d購自美國Biolegend公司。

腸炎模型的誘導以及疾病評價 給予雌性C57BL/6小鼠含有3．5%DSS的飲用水，7天后改成正常飲用水。根據文獻報道及實驗指標，第0～10天為腸炎急性期，第11～25天為腸炎消退期，分別在第8天和第12天處死小鼠，作為不同階段的實驗組，未飲用3．5%DSS水的小鼠作為健康對照組，每組至少5只小鼠。疾病臨床評分(disease activity index，DAI)包括體質量下降的程度、大便性狀以及有無便血。小鼠在不同時間點處死后，取腸組織固定在10%甲醛中，用切片機將其切成5 μm厚度，蘇木精-伊紅染色并進行病理學評分:0分，正常;1分，輕度炎癥，散在的單個核細胞浸潤;2分，中度炎癥，多發(fā)性病灶;3分，重度炎癥，血管增生以及腸壁顯著增厚;4分，嚴重的炎癥反應，伴隨透壁性炎性細胞浸潤以及腸道杯狀細胞脫落。每只小鼠的腸道組織觀察4個視野，取平均值作為該小鼠的病理學評分。

流式檢測脾細胞中CD19+CD5+CD1dhiB細胞的表達 不同時間點的小鼠斷頸處死，70%酒精浸泡消毒后，取小鼠脾臟，研磨成單個細胞后重懸于PBS緩沖液中，置于15 mL離心管并插于冰盒中。1 500 r/min離心5 min，棄上清，加入紅細胞裂解液裂解紅細胞后，1 500 r/min離心5 min，棄上清，加入10 mL RPMI1640細胞培養(yǎng)液重懸，細胞計數。取1×106細胞于流式管中，加入封閉細胞Fc端的抗體抗 CD16/CD32 ，4℃、15 min后加入抗 CD19、抗CD5、抗CD1d抗體，4℃下避光反應 30 min，洗滌2次(1 500 r/min，離心5min)，加入流式洗滌液300 μL重懸，用流式細胞儀分析。

體內轉輸實驗 如前所述，不同時間點的小鼠斷頸處死，脾細胞制成單細胞懸液，用流式抗體抗CD19、抗CD5、抗CD1d抗體染色后，用細胞分選儀分選出 CD19+CD5+CD1dhiB細胞。將1×106/100 μL濃度的細胞通過尾靜脈轉輸到DSS誘導1天的小鼠體內，PBS組作為陰性對照。觀察小鼠的體重變化，給予DAI評分。

局部細胞因子的檢測 取轉輸了CD19+CD5+CD1dhiB細胞的DSS小鼠局部腸組織，加入含蛋白酶抑制劑的PBS碾碎后，離心(12 000×g，20 min)取上清，用ELISA試劑盒檢測腸局部IFN-γ，TNF-α和IL-6的表達。

統(tǒng)計學分析 用統(tǒng)計軟件 Prism 5．0分析，兩組間比較采用 t檢驗，多組間比較采用 One-way ANOVA檢驗，P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

小鼠腸炎模型的疾病評估 對經DSS誘導的腸炎小鼠分別進行體質量、臨床評分(DAI)以及病理學評分，結果顯示:第0～10天，小鼠體質量減輕，DAI疾病指數升高，病理學切片發(fā)現腸壁有大量炎癥細胞浸潤，腸黏膜受損、腸腺體杯狀細胞減少(放大倍數:200×)，病理學評分增高，表明0～10天是小鼠腸炎的疾病加重期;而11天后，小鼠體質量回升、DAI及病理學評分則逐步下降，提示11天以后為疾病的恢復期(圖1A～C)。

腸炎病程中CD19+CD5+CD1dhiB細胞的改變我們首先檢測了腸炎小鼠脾臟中B細胞的變化，發(fā)現與對照組相比，DSS處理組B細胞比例增加(P=0．046 4，t=2．849，圖2A)。隨后，我們對于代表正常(第0天)、炎癥急性期(第8天)以及炎癥恢復期(第12天)小鼠脾細胞中的CD19+CD5+CD1dhiB細胞的比例分別進行了分析，結果顯示在炎癥急性期，脾細胞中的CD19+CD5+CD1dhiB細胞的比例明顯增加(P=0．000 9，F=28．13，圖2B)。

圖1 DSS誘導的小鼠腸炎模型(×200)Fig 1 DSS-induced inflammatory bowel disease model(×200)

圖2 腸炎小鼠脾臟中CD19+CD5+CD1dhiB細胞的比例變化Fig 2 The proportion change of splenic B cells and CD19CD5CD1dB cells in DSS-induced inflammatory bowel disease

CD19+CD5+CD1dhiB細胞在炎癥不同時期的功能差異 為了探究CD19+CD5+CD1dhiB細胞在炎癥不同階段的功能改變，我們在DSS誘導的小鼠腸炎模型中分選第0、8和12天小鼠脾細胞中CD19+CD5+CD1dhiB細胞，分別轉輸到DSS誘導的急性期小鼠體內(圖3A)。結果發(fā)現，只有轉輸了第8天即炎癥急性期的CD19+CD5+CD1dhiB細胞能使小鼠急性腸炎癥狀得到減輕，而轉輸了第0天和第12天的CD19+CD5+CD1dhiB細胞，小鼠腸炎癥狀無明顯改善(圖3B)。提示在腸炎急性期，CD19+CD5+CD1dhiB細胞的抑炎功能增強。

CD19+CD5+CD1dhiB細胞對腸道炎性因子的影響 IFN-γ，TNF-α和IL-6是小鼠腸炎模型中腸道重要的炎性因子，為了驗證CD19+CD5+CD1dhiB細胞對于它們的作用，我們分別檢測了轉輸PBS對照組和炎癥急性期CD19+CD5+CD1dhiB細胞的小鼠腸道局部炎性因子的變化。結果表明轉輸CD19+CD5+CD1dhiB 細胞可明顯下調 IFN-γ、TNF-α 和IL-6的分泌(圖4)，提示下調局部炎性細胞因子的產生很有可能是CD19+CD5+CD1dhiB細胞的免疫調節(jié)機制之一。

圖3 體內轉輸CD19+CD5+CD1dhiB細胞的抑炎作用Fig 3 CD19+CD5+CD1dhiB cells suppress disease symptoms in DSS-induced inflammatory bowel disease

圖4 CD19+CD5+CD1dhiB細胞抑制腸道炎性因子的分泌Fig 4 The secretion of inflammatory cytokine in local intestine after CD19+CD5+CD1dhiB cells adoptive transfer

討 論

我們的研究表明，CD19+CD5+CD1dhiB細胞可能在小鼠腸炎模型中發(fā)揮著重要的保護性作用。脾臟中CD19+CD5+CD1dhiB細胞的比例與腸炎的嚴重程度正相關;體內轉輸CD19+CD5+CD1dhiB細胞可有效控制疾病的進展，改善疾病的癥狀;CD19+CD5+CD1dhiB細胞的轉輸可明顯降低腸道局部炎性細胞因子的分泌。以上結果表明，CD19+CD5+CD1dhiB細胞可通過抑制腸道炎性細胞因子的分泌在小鼠腸炎模型中發(fā)揮著負性調節(jié)作用。此外，我們的研究還發(fā)現只有疾病急性期(第8天)的CD19+CD5+CD1dhiB細胞才具備有效的抑炎作用，疾病的初始期(第0天)及恢復期(第12天)，此類細胞的負性免疫調節(jié)功能不明顯，提示CD19+CD5+CD1dhiB細胞的功能變化也與小鼠腸炎病情嚴重程度密切相關。這與文獻報道［10］相吻合:研究表明，正常小鼠體內CD19+CD5+CD1dhiB細胞不具備抑制作用，只有處于炎癥環(huán)境中，CD19+CD5+CD1dhiB細胞的免疫功能才能被激活，從而起到緩解和調節(jié)疾病的作用。本研究中，處于健康狀態(tài)的第0天，小鼠CD19+CD5+CD1dhiB細胞處于“靜息”狀態(tài)，因而不具備調節(jié)功能;而在第8天，炎癥處于急性期，CD19+CD5+CD1dhiB被“激活”，產生了調節(jié)性作用;轉輸實驗表明，外源性增加CD19+CD5+CD1dhiB可以緩解疾病的癥狀，但是其調節(jié)疾病的途徑目前存在爭議。文獻表明IL-10是CD19+CD5+CD1dhiB調節(jié)疾病的主要方式，然而越來越多的證據表明，CD19+CD5+CD1dhiB及其他類型的調節(jié)性B細胞通過IL-10非依賴的方式協(xié)同其他調節(jié)性細胞緩解疾病［11－17］。此外，在炎癥環(huán)境中具體是什么因素促進了CD19+CD5+CD1dhiB細胞的調節(jié)作用，尚需進一步的研究證明。本研究中，處于第12天緩解期的CD19+CD5+CD1dhiB細胞同樣不具有調節(jié)性作用，可能是由于炎癥環(huán)境減輕后，CD19+CD5+CD1dhiB細胞受到的刺激作用減弱，調節(jié)作用不能持續(xù)，這個發(fā)現有待進一步驗證。

調節(jié)性B細胞是一群以分泌IL-10為主要特點的免疫功能負調性細胞，它參與調節(jié)多種自身免疫疾病并促進腫瘤轉移［18－19］。在自身免疫性疾病小鼠模型中，如類風濕關節(jié)炎和實驗性自身免疫性腦脊髓炎，清除小鼠體內的B細胞會加重病情，降低自愈傾向［8］。在人外周血中，CD19+CD24hiCD38hi和CD19+CD24hiCD27hiB細胞亞群被證實具有很強的抑制功能［20－21］。而在小鼠體內，調節(jié)性 B細胞(Breg)包含在幾乎每一個B細胞亞群中，比如脾臟的過渡2型 B細胞(T2-MZP)，邊緣性 B細胞(MZB)，腹腔淋巴結中的B-1a型B細胞等，在小鼠脾臟中，通常用CD19+CD5+CD1dhi表示調節(jié)性B細胞［8－9，22］。本研究發(fā)現，在炎癥狀態(tài)最為嚴重的急性期，CD19+CD5+CD1dhiB細胞的比例增多，抑制效率增強;而在炎癥消退后，其比例減少，抑制功能也下降到了正常水平。由此可見，CD19+CD5+CD1dhiB細胞與小鼠腸炎疾病進程有著強烈的正相關性，可能起著與炎性免疫細胞相互制約的作用，并為IBD的自愈傾向打下了基礎。

本研究證實，抑制炎性因子的分泌可能是調節(jié)性B細胞發(fā)揮體內免疫抑制作用的方式之一。深入研究其調節(jié)機制將為自身免疫病的治療提供新的契機。

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