趨化因子受體7(CXCR7)在食管鱗形細(xì)胞癌組織中的表達(dá)及其臨床意義

郭 晶 盧春來(lái) 古 杰 葛 棣

(復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院胸外科 200032 上海)

食管癌是常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一，病理學(xué)類(lèi)型主要為鱗癌和腺癌。在我國(guó)，食管癌病理類(lèi)型仍以鱗癌為主［1］。即使隨著手術(shù)技術(shù)、化療、放療等治療手段的不斷進(jìn)步，食管癌患者的總體生存情況仍不樂(lè)觀，目前報(bào)道其5年生存率僅為30%［2］。造成這種局面的一個(gè)重要原因是食管癌較早且較易發(fā)生淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。因此，研究食管癌的生物學(xué)特點(diǎn)及尋找新的治療靶點(diǎn)已成為提高食管癌患者預(yù)后的關(guān)鍵。

趨化因子屬于細(xì)胞因子類(lèi)蛋白超家族成員，能激活趨化因子受體并與之結(jié)合，從而在胚胎發(fā)育、血管生成、造血、炎癥、腫瘤和艾滋病等多種生理或病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用［3］。目前，已發(fā)現(xiàn)至少50個(gè)趨化因子，根據(jù)其分子結(jié)構(gòu)中氨基酸區(qū)域上半胱氨酸殘基的數(shù)量及空間排列不同將其分為4個(gè)亞型，即C、CC、CXC、和 CX3C［4－6］。自 Muller等［7］首次報(bào)道趨化因子受體(chemokine receptor，CXCR)和乳腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)系之后，越來(lái)越多的趨化因子受體被發(fā)現(xiàn)與腫瘤有著密切的關(guān)系。CXCR4是其中一種重要的趨化因子受體，廣泛表達(dá)于多種腫瘤細(xì)胞表面，多項(xiàng)研究表明CXCL12/CXCR4信號(hào)軸在腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中起到非常重要的作用［8］。過(guò)去認(rèn)為CXCR4是趨化因子CXCL12的唯一受體，然而最近研究發(fā)現(xiàn)CXCL12尚存在 CXCR7 這一新受體［9－10］，且 CXCL12/CXCR7 信號(hào)軸同樣可能在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用。目前研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)CXCR7在乳腺癌、肺癌、前列腺癌和惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤等多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，且與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［11－14］。關(guān)于CXCR7在食管鱗形細(xì)胞癌中的表達(dá)，目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)報(bào)道。本研究利用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)胸段食管鱗癌組織標(biāo)本中CXCR7的表達(dá)水平，探討CXCR7與食管鱗癌患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。

資料和方法

研究對(duì)象 選取2006年在復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院胸外科行根治性手術(shù)的154例胸段食管鱗形細(xì)胞癌患者石蠟標(biāo)本，同時(shí)選取49例正常食管鱗狀上皮組織標(biāo)本進(jìn)行對(duì)照。收集患者臨床病理資料，包括性別、年齡、腫瘤大小、浸潤(rùn)深度、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移個(gè)數(shù)。pTNM分期參照食管癌UICC第7版分期。

病例一般情況 男性119例，女性35例;年齡38～85歲，平均年齡61．3歲，其中≤60歲76例，＞60歲78例;按腫瘤大小分組，＜3 cm 69例，≥3 cm 85例;按腫瘤浸潤(rùn)深度分組，黏膜及黏膜下12例，侵犯肌層41例，侵犯食管外膜95例，侵犯食管周?chē)M織(T4a)6例;按腫瘤分化程度分組，高分化14例，中分化114例，低分化26例;按淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移個(gè)數(shù)分組，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移91例，＜3個(gè)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移44例，≥3個(gè)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移19例;按 pTNM分期(UICC第7版)分組，Ⅰ期(Ⅰa+Ⅰb)12例，Ⅱ期86例，Ⅲ期(Ⅲa+Ⅲb)52例，Ⅳ期4例(表1)。

隨訪情況 154例患者中，67例在術(shù)后接受了規(guī)則化療(鉑類(lèi)+5-Fu，4～6周期)，無(wú)任何患者接受過(guò)術(shù)前新輔助化療或術(shù)后輔助性放療。隨訪至2011年12月31日，中位生存時(shí)間為40個(gè)月，最短隨訪時(shí)間2個(gè)月，最長(zhǎng)隨訪時(shí)間71個(gè)月。

免疫組化 切片常規(guī)脫蠟至水，加入3%過(guò)氧化氫室溫孵育15 min，消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，PBS液洗，EDTA高溫修復(fù)抗原，滴加山羊血清，室溫孵育30 min后加入CXCR7鼠抗人單克隆抗體(IgG2a，clone 358426;R＆D system)，4℃ 冰箱孵育過(guò)夜，PBS漂洗后，滴加二抗室溫孵育30 min，PBS洗后，滴加三抗，室溫孵育，PBS液洗后于顯微鏡下 DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，PBS代替一抗做陰性對(duì)照。

結(jié)果判斷 CXCR7陽(yáng)性結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn):細(xì)胞膜或胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)淡黃至棕黃色染色為陽(yáng)性細(xì)胞，隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野(×400)進(jìn)行判斷。結(jié)果參照文獻(xiàn)報(bào)道［15］，陽(yáng)性細(xì)胞范圍∶無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞，計(jì)0分，1% ～29%，計(jì)1分，30% ～59%計(jì)2分，≥60%計(jì)3分;染色強(qiáng)度∶陰性計(jì)0分，輕度染色計(jì)1分，中度染色計(jì)2分，強(qiáng)染色計(jì)3分;按陽(yáng)性細(xì)胞范圍×染色強(qiáng)度評(píng)分，＜2分計(jì)為陰性，≥2分計(jì)為陽(yáng)性。

表1 CXCR7表達(dá)與食管鱗癌患者臨床病理特征的關(guān)系Tab 1 Analysis of the associations between CXCR7 expression and clinicopathologic features［n(%)］

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。不同分組間比較行χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)。使用Kaplan-Meier法計(jì)算生存率，繪出曲線(xiàn)并進(jìn)行Log-rank檢驗(yàn)。多因素分析使用Cox風(fēng)險(xiǎn)比例模型評(píng)估分析與預(yù)后相關(guān)的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素。P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

食管鱗癌組織中CXCR7表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系 分析154例胸段食管鱗癌患者的組織標(biāo)本，正常食管鱗狀上皮組織中CXCR7的陽(yáng)性表達(dá)率為6．1%(4/49)，且表達(dá)均為弱陽(yáng)性(圖1 A);在腫瘤組織中，CXCR7表達(dá)主要定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)(圖1 B～D)，根據(jù)上述評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)判斷:154例胸段食管鱗癌患者組織標(biāo)本中CXCR7陽(yáng)性116例(75．3%)，CXCR7 陰性 38 例(24．7%)。腫瘤組織中的CXCR7蛋白陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于正常食管鱗狀上皮組織，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．01，表1)。CXCR7表達(dá)水平與腫瘤的浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及pTNM分期等具有明顯相關(guān)性(表2)，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0．01);而與患者年齡、性別、腫瘤生長(zhǎng)部位、腫瘤分化程度及腫瘤大小無(wú)明顯相關(guān)性，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)。

圖1 CXCR7在食管正常鱗狀上皮組織及食管鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)(×400)Fig 1 Immunohistochemical staining for CXCR7 in normal esophageal squamous epithelium and ESSC(×400)

表2 食管鱗癌患者預(yù)后的單因素及多因素分析Tab 2 Univariate and multivariate analysis of patients'survival

CXCR7表達(dá)水平與患者預(yù)后的關(guān)系 分析CXCR7的表達(dá)情況與患者無(wú)瘤生存期(disease free survival，DFS)及總生存期(overall survival，OS)的關(guān)系，隨訪截至日期2011年12月31日，154例患者中有88例患者術(shù)后發(fā)生復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，84例患者因腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移死亡，中位無(wú)瘤生存時(shí)間為29個(gè)月，總中位生存期為40個(gè)月。Kaplan-Meier曲線(xiàn)(圖2)顯示，CXCR7陽(yáng)性表達(dá)組患者術(shù)后無(wú)瘤生存時(shí)間和總生存時(shí)間明顯低于CXCR7陰性表達(dá)組，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．01)。

圖2 CXCR7表達(dá)與食管鱗癌患者術(shù)后無(wú)瘤生存期及總生存期的關(guān)系Fig 2 Kaplan-Meier analysis of disease-free survival and overall survival for patient suffering esophageal squamous cell carcinoma

單因素及多因素分析 單因素分析結(jié)果顯示性別、年齡、腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、pTNM分期和CXCR7表達(dá)水平為食管鱗癌復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)因素(P＜0．05)。多因素分析結(jié)果顯示腫瘤的pTNM分期和CXCR7表達(dá)水平為食管癌獨(dú)立不良預(yù)后因素(P＜0．05，表2)。

討 論

CXCR7又稱(chēng)為 RDC-1，屬于 G蛋白偶聯(lián)受體，由362個(gè)氨基酸序列組成，基因定位于人染色體2q37。既往觀點(diǎn)認(rèn)為CXCR4是CXCL12的唯一受體。然而，Balabanian等［9］在研究CXCL12趨化T淋巴細(xì)胞時(shí)，發(fā)現(xiàn)CXCL12能和RDC-1受體結(jié)合，且其趨化T淋巴細(xì)胞的作用可被RDC-1抗體所抑制。之后，Burns等［10］發(fā)現(xiàn)敲除 CXCR4基因的小鼠胎肝細(xì)胞仍可與CXCL12結(jié)合，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)CXCL12結(jié)合的新位點(diǎn)就是RDC-1分子。并且RDC-1在氨基酸保守序列上與CXCR4具有相似性，同樣也是HIV的復(fù)合受體，故將其命名為CXCR7。由于其與CXCR4的相似性，故針對(duì)CXCR7在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用也開(kāi)始受到廣泛關(guān)注。

我們之前的研究發(fā)現(xiàn)CXCR4在食管鱗癌組織中呈高表達(dá)，且與患者的不良預(yù)后密切相關(guān)［16－18］。因此我們推測(cè)，作為CXCL12的另一高親和性受體CXCR7在食管癌中可能具有同CXCR4類(lèi)似的作用。本次實(shí)驗(yàn)運(yùn)用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)CXCR7在食管正常鱗狀上皮及食管鱗癌組織標(biāo)本中的表達(dá)情況，并分析其與患者臨床病理特征之間的關(guān)系。我們發(fā)現(xiàn)，CXCR7陽(yáng)性表達(dá)率在正常食管鱗狀上皮組織中低，而在食管鱗癌組織中高，且表達(dá)主要定位于腫瘤細(xì)胞的胞膜及胞質(zhì)。這與早前的研究結(jié)果提示CXCR7表達(dá)于多種腫瘤細(xì)胞表面的結(jié)果一致［11－14］。目前的研究發(fā)現(xiàn)，CXCR7主要表達(dá)于轉(zhuǎn)化細(xì)胞或胚胎細(xì)胞表面，而極少表達(dá)于正常細(xì)胞［10］。

本次研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，CXCR7的陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移個(gè)數(shù)與腫瘤的分期呈明顯相關(guān)性。這與我們之前關(guān)于CXCR4與食管鱗癌臨床病理特征相關(guān)性研究的結(jié)果一致［16－18］。CXCR7作為 CXCL12又一高親和性受體，主要通過(guò)與CXCL12的相互作用，參與腫瘤的增殖、抗凋亡、黏附、侵襲、轉(zhuǎn)移和血管生成等重要病理生理活動(dòng)。Miao等［11］在一項(xiàng)體外實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，CXCR7的表達(dá)不僅促進(jìn)乳腺癌及肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)及血管生成，還促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生肺轉(zhuǎn)移。而Wang等［13］研究發(fā)現(xiàn)CXCR7可提高前列腺癌細(xì)胞的黏附及侵襲能力。多項(xiàng)研究還表明CXCR7可促進(jìn)血管生成因子、IL-8及VEGF等細(xì)胞因子的分泌，從而促進(jìn)腫瘤的血管新生［11］。

我們的研究還發(fā)現(xiàn)CXCR7陽(yáng)性表達(dá)組的患者術(shù)后無(wú)瘤生存期和總生存時(shí)間均明顯低于CXCR7陰性表達(dá)組的患者。這一研究結(jié)果同CXCR7與肺癌［12］、膽囊癌［15］和腎癌［19］預(yù)后相關(guān)性研究的結(jié)果相一致。

盡管CXCR7的表達(dá)與腫瘤的增殖及轉(zhuǎn)移相關(guān)，但其具體作用機(jī)制仍不明確。體外實(shí)驗(yàn)中，利用CXCL12刺激CXCR7可以促使CXCR7進(jìn)入細(xì)胞膜，并以配體依賴(lài)途徑通過(guò)β抑制蛋白-2激活絲裂原活化蛋白激酶的級(jí)聯(lián)反應(yīng)［20－22］。更有學(xué)者提出CXCR7只有與其他趨化因子受體形成二聚體后才能發(fā)揮作用［23－24］。Sierro 等［25］發(fā)現(xiàn) CXCR7 在細(xì)胞內(nèi)同CXCR4形成功能性異二聚體，這種異二聚體與SDF-1結(jié)合可以產(chǎn)生強(qiáng)烈的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)。

本次研究我們首次發(fā)現(xiàn)食管鱗癌組織中CXCR7表達(dá)水平與患者臨床病理特征及預(yù)后密切相關(guān)，推測(cè)CXCR7在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起到重要作用。然而關(guān)于CXCR7在食管鱗癌中轉(zhuǎn)移的具體作用機(jī)制及信號(hào)通路則需要進(jìn)一步的體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)研究。

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