凝血酶受體激活肽對豚鼠心室肌細胞腺嘌呤核苷三磷酸敏感性鉀通道的作用

趙宏飛，劉麗萍

腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）敏感性鉀(KATP)通道是將細胞膜電活動與細胞代謝聯(lián)系在一起的重要通道。心肌細胞上KATP通道和心肌梗死和心律失常的發(fā)生有密切關(guān)系[1]。KATP通道對心肌細胞有保護作用，對心臟疾病的治療有重要意義。KATP參與心肌缺血預適應反應，增加心肌氧供,減少氧耗,改善心臟功能，改善心肌能量代謝,維持細胞正常結(jié)構(gòu)等對心肌缺血的多種保護作用及其機制已得到闡明。對于凝血酶受體激活肽（TRAP），有研究表明其能通過促進血管再生，促進缺血創(chuàng)面愈合與表皮細胞增生、移行的作用[2]。TRAP能減少急性心肌梗死向室性心律失常的發(fā)展，為觀察TRAP的該作用是否和KATP通道有關(guān)，本實驗應用膜片鉗單通道電流記錄技術(shù)研究TRAP對豚鼠心室肌細胞KATP通道在保護心肌細胞方面的作用，探討 TRAP對于心血管疾病的治療有重要意義。

1 材料與方法

材料：2011-10至2012-12，健康成年豚鼠，體重250～350克，雌雄不限。吡那地爾（Pinacidil）、格列苯脲（Glibenclamide）、TRAP、膠原酶Ⅱ、乙二醇二乙醚二胺四乙酸（EGTA）、小牛血清白蛋白(BSA)、腺嘌呤核苷三磷酸 (ATP)均購自美國Sigma公司。

玻璃微電極的制備：本研究選用厚壁硬質(zhì)玻璃（外徑1.5 mm，壁厚0.5 mm）制備記錄電極，經(jīng)日本Narirshige公司的微電極拉制儀PP-830分兩步垂直拉制而成。第一次拉制使毛細管中部主細拉長，直徑約 200 μm，長度約 7～10 mm；第二次拉制將玻璃管拉斷，尖端直徑約 0.5～1.0 μm。

心肌細胞的分離：腹腔注射3 %戊巴比妥鈉50 mg/kg麻醉，仰臥位固定，經(jīng)頸靜脈注射肝素150 U/kg，開胸，取出心臟，置于4℃有鈣臺氏液中，打開心包，修剪多余組織，游離主動脈根部，迅速掛上Langendorff裝置，經(jīng)主動脈行逆行灌流。先以有鈣臺氏液灌流，當心臟復跳后改灌無鈣臺式液，待心臟停跳 8～10 min后，用 50 ml無鈣臺式液（含膠原酶 II 5mg，BSA 6 mg）繼續(xù)灌流，約20min左右當心臟呈現(xiàn)松軟，顏色粉紅時停止消化。剪下心室在心肌細胞保存液（KB）中剪碎，鑷子夾入裝有KB液的試管反復吹打后，吸去組織塊，放入4 ℃穩(wěn)定1小時后待用。實驗過程中所有灌流液均需充氧飽和。整個灌流過程中不斷用滴管潤濕心臟，變換灌流液時更換滴管。灌流溫度保持37 ℃，關(guān)閉門窗減少空氣流動保證恒溫。

單通道記錄膜片鉗技術(shù)：用Axon200B Patchclamp放大器記錄豚鼠心室肌細胞KATP通道電流，同時輸送到8道Bassel濾波器中0.2KHz的頻率進行濾波處理及Axon interface做數(shù)字化處理。數(shù)字化后資料用膜片鉗數(shù)據(jù)采集和分析軟件pclamp 9.2進行記錄、儲存和分析。

實驗步驟：實驗分成5個部分，記錄方式采取內(nèi)面向外模式（第3部分實驗除外），余為細胞黏附記錄模式，均記錄3次以上。① 記錄豚鼠心室肌細胞KATP通道電流，在鉗制電壓分別為 0mV、 -20 mV、-40 mV、-60 mV、-80 mV、-100 mV時，記錄電流30s以上，分別用clampfit 9.2軟件和Gaussian方程計算出各個電壓下的離子電流幅度。② 觀察吡那地爾對KATP通道電流的作用：記錄到KATP通道后，觀察2 min，加入KATP通道激活劑吡那地爾，使浴槽中吡那地爾的濃度達到0.05 mmol/L。計算2min后電流開放幾率，用通道活動度（通道開放概率與通道開放數(shù)的乘積）作為衡量通道活性大小的指標，它是與加藥前進行自身對照。③ 觀察ATP對KATP通道電流的作用： 在吡那地爾存在時，在形成細胞貼附式封接后，向上提起電極形成內(nèi)面向外模式，記錄到KATP通道電流后，加入ATP，使浴槽中ATP的濃度達到0.1 mmol/L。計算2 min后電流通道活動度，與加藥前進行自身對照。④ 觀察格列苯脲對KATP通道電流的作用：吡那地爾存在下，形成細胞貼附式封接后，向浴槽內(nèi)加入格列苯脲，使浴槽中格列苯脲的濃度達到 0.1 mmol/L，計算2 min后電流通道活動度，與加藥前進行自身對照。⑤ 觀察TRAP(10 mmol/L)對心肌細胞KATP通道的作用：在吡那地爾存在時，實驗中記錄到KATP通道后觀察2～3 min后再加入TRAP，分別計算通道活動度，加藥前后分別比較。

2 結(jié)果

豚鼠心室肌細胞KATP通道電流的電流—電壓曲線：在細胞黏附模式下，鉗制電壓為0 mV時，記錄到電流，觀察到該KATP通道電流的幅值隨著電壓的變化而變化：鉗制電壓是0 mV時，電流幅值是1.30 pA； 鉗制電壓是 -20 mV 時，電流幅值是 2.82 pA，鉗制電壓是-40 mV時，電流幅值是3.25 pA，鉗制電壓是-60 mV時，電流幅值是4.09 pA，鉗制電壓是-80 mV時，電流幅值是5.5 pA，鉗制電壓是-100 mV時，電流幅值是6.05 pA（圖1）。隨著膜的逐漸超極化，電流的幅值逐漸增加（圖2）。根據(jù)豚鼠心室肌細胞KATP通道電流的電流—電壓曲線，計算出反轉(zhuǎn)電位（即當電流為0時的電壓數(shù)值）為 32.28 mV。

圖1 豚鼠心室肌細胞KATP通道電流的電流—電壓曲線

圖2 豚鼠心室肌細胞KATP通道的電流—電壓曲線

吡那地爾對豚鼠心室肌細胞KATP通道電流的作用：鉗制電壓為0 mV時，加入吡那地爾后KATP通道的通道活動度為（0.55±0.07）比加藥前（0.23±0.04）增加(記錄5次)，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01)。圖3、4

圖3 吡那地爾對豚鼠心室肌細胞KATP通道的影響

圖4 吡那地爾對豚鼠心室肌細胞KATP通道的影響

ATP對豚鼠心室肌細胞KATP通道電流的作用：加入ATP后 KATP通道的通道活動度 （0.12±0.04）較加藥前為（0.49±0.12）減少 (記錄4次)，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05 ）。圖 5、6

格列苯脲對豚鼠心室肌細胞KATP通道電流的作用：加入格列苯脲后KATP通道的通道活動度為（0.06±0.03）較加入藥物前（0.56±0.18）減少(記錄5 次 )，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05 ）。 圖 7、8

圖5 ATP（0.1mmol/L）對豚鼠心室肌細胞KATP通道的影響

圖6 ATP（0.1 mmol/L）對豚鼠心室肌細胞KATP通道的影響

圖7 格列苯脲（0.1 mmol/L）對豚鼠心室肌細胞KATP通道的影響

圖8 格列苯脲對豚鼠心室細胞KATP通道的作用

TRAP對豚鼠心室肌細胞KATP通道的作用：加入 TRAP (10 mmol/L)后 KATP通道的通道活動度為（0.48±0.11）較加藥前（0.15±0.11） 增加 (記錄 5次 )，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05)。 圖 9、10

圖9 TRAP對豚鼠心室肌細胞KATP通道的作用

圖10 TRAP對豚鼠心室肌細胞KATP通道的作用

3 討論

鉀離子（K+）在機體的多種生命活動中起著非常重要的作用，但其功能的實現(xiàn)要依賴于細胞膜上的各種K+通道。K+通道是一類鑲嵌于細胞膜脂質(zhì)中的蛋白復合體家族，廣泛存在于各種細胞，在不同的組織細胞中分別執(zhí)行著各種重要的生理功能。

KATP通道是電壓非依賴性的、配體門控通道，由Noma[1]于1983年首先在豚鼠的心肌細胞上發(fā)現(xiàn)。KATP的開放對心肌缺血和梗死時縮短動作電位的時程起到重要作用，對細胞外K+的聚集也有部分貢獻[2,3]。心肌缺血缺氧時，KATP被激活，引起冠脈及其側(cè)枝血管擴張，以增加缺血區(qū)血液供應。KATP開放產(chǎn)生負性肌力作用，缺血心肌收縮性能迅速降低，心肌耗氧量下降，從而保護心肌免遭更嚴重的缺血性損傷。KATP開放可促進細胞內(nèi)ATP濃度增加，恢復細胞正常的能源供應，從而減輕缺血性損傷，維持細胞正常的功能和結(jié)構(gòu)。KATP調(diào)節(jié)糖代謝，對抗缺血產(chǎn)生的能量代謝障礙。KATP開放能減少細胞內(nèi)酶的泄漏，阻止膜磷脂缺失，保持細胞的超微結(jié)構(gòu)[4]。缺血期此通道一定程度的開放有助于使心肌細胞進入“緊張” 防御狀態(tài)。以前認為低氧和缺血激活KATP通道導致細胞內(nèi)失K+，繼而促進細胞內(nèi)鈣離子（Ca2+）超負荷和再灌注損傷?，F(xiàn)在認為細胞內(nèi)鈉離子（Na+）的積累而并非KATP通道激活是失K+的主要原因?？闪_卡林激活KATP，減少心肌K+含量，進而抑制Na+和Ca2+在心肌再灌注的蓄積，而發(fā)揮對心肌缺血再灌注損傷的保護作用。因此，對心臟KATP通道的研究具有較高理論價值和應用前景。

吡那地爾為K+通道開放藥，在臨床上主要用于治療高血壓，使平滑肌細胞的K+通道開放，導致K+外流和靜止膜電位負向轉(zhuǎn)移，使靜息時的細胞超極化，最后的效應是細胞內(nèi)Ca2+減少和平滑肌松弛，外周血管擴張，阻力下降，從而使血壓下降。已有研究[5]表明吡那地爾對缺血心肌有保護作用且KATP通道參與了心肌保護作用，為了進一步證實吡那地爾對心肌細胞的作用，本研究應用膜片鉗單通道電流記錄技術(shù)研究了吡那地爾對豚鼠心室肌細胞KATP通道的作用，我們得到吡那地爾能明顯開放豚鼠心室肌細胞KATP通道，ATP和格列苯脲能抑制該作用。我們的實驗結(jié)果支持了上兩種觀點。

臨床上凝血酶常被用為治療假性動脈瘤，瘤腔內(nèi)注射凝血酶對機體凝血系統(tǒng)無明顯影響[6,7]，凝血酶是與其受體結(jié)合后起作用。已有研究表明[8]凝血酶受體和急性心肌梗死后并發(fā)的心律失常有關(guān)系，并且凝血酶有助于急性心肌梗死發(fā)生時心電圖上升高的ST段降低，降低心肌梗死帶來的危害[9]。有研究表明TRAP能通過促進血管再生，促進缺血創(chuàng)面愈合與表皮細胞增生、移行的作用。本研究觀察TRAP對心肌細胞KATP通道的作用發(fā)現(xiàn)TRAP可以使豚鼠心室肌細胞KATP通道開放幾率增加。因此我們推斷TRAP具有保護心肌免遭缺血性損傷，避免心肌梗死發(fā)生的作用。

本實驗研究了TRAP能使心肌細胞KATP通道的開放概率增加，而KATP通道的開放能夠引起冠脈及其側(cè)枝血管擴張增加心肌血液供應，還能產(chǎn)生負性肌力作用,使心肌收縮性能降低，心肌耗氧量下降，從而保護心肌免遭缺血性損傷，避免心肌梗死的發(fā)生。因此通過本研究可以推斷在心肌缺血缺氧時TRAP可以保護心臟免遭缺血性損傷，減少心臟事件的發(fā)生率，對于心血管疾病的治療有重要意義。

[1] Noma A. ATP-regulated K+ channels in cardiac muscle. Nature, 1983,305： 147-148.

[2] Tsopanoglou NE, Papaconstantinou ME, Flordellis CS, et al. On the mode of action of thrombin-induced angiogenesis： thrombin peptide,TP508, mediates effects in endothelial cells via alphavbeta3 integrin.Thromb Haemost, 2004, 92： 846-857.

[2] Venkatesh N, Stuart JS, Lamp ST, et al. Activation of ATP-sensitive K+ channels by cromakalim. Effects on cellular K+ loss and cardiac function in ischemic and reperfused mammalian ventricle. Circ Res,1992, 71： 1324-1333.

[3] Shivkumar K, Deutsch NA, Lamp ST, et al. Mechanism of hypoxic K loss in rabbit ventricle. J Clin Invest, 1997, 100： 1782-1788.

[4] Seino S, Miki T. Physiological and pathophysiological roles of ATP-sensitive K+ channels. Prog Biophys Mol Biol, 2003, 81： 133-176.

[5] 耿玉六, 周汝元. 吡那地爾對缺血心肌保護作用的實驗研究. 蚌埠醫(yī)學院學報 , 2006, 31： 343-345.

[6] 晉軍, 黃嵐, 覃軍, 等. 凝血酶注射封閉股動脈假性動脈瘤對機體凝血系統(tǒng)的影響 . 中國循環(huán)雜志 , 2004, 19： 446-449.

[7] 廖建寧, 李斌, 姜芳. 超聲引導下注射凝血酶治療假性動脈瘤一例.中國循環(huán)雜志 , 2007, 06： 337-339.

[8] Lilong Tang, Chunyu Deng, Ming Long, et al. Thrombin Receptor and Ventricular Arrhythmias after Acute Myocardial Infarction. Mol Med,2008, 14： 131-140.

[9] Ming Long, Lei Yang, Genya Huang, et al. Thrombin and Its Receptor Enhance ST-Segment Elevation in Acute Myocardial Infarction by Activating the KATP Channel. Mol Med, 2010, 16： 322-332.