線粒體乙醛脫氫酶2基因多態(tài)性對健康受試者硝酸甘油效應的影響

張怡，趙鵬飛，胡怡，賈秀娟，張仲義，章政

線 粒 體 乙 醛 脫 氫 酶 2(aldehyde dehydrogenase,ALDH2)是硝酸甘油(GTN)的有效代謝物一氧化氮(NO)形成的關鍵酶。自2002年Chen等[1]報道了ALDH2在硝酸甘油的生物活化中起著重要作用，且對ALDH2的抑制可能與引起硝酸甘油的耐藥有關，之后研究者們逐漸意識到ALDH2可能在硝酸甘油發(fā)揮療效過程中起著關鍵作用。如果病人基因中攜帶有突變的ALDH2的基因Glu504Lys，可以使硝酸甘油在體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化過程受阻，藥物難以有效發(fā)揮作用[2]。ALDH2基因多態(tài)性到底對硝酸甘油的藥物效應產(chǎn)生了何種影響，目前尚無明確的定論。本試驗選擇450名我院體檢中心健康志愿者，測定其舌下含服0.5 mg硝酸甘油前后不同時間點的無創(chuàng)血流動力學指標，觀察ALDH2基因多態(tài)性對健康受試者硝酸甘油藥物效應的影響。

1 對象與方法

對象：選擇2011-07至2013-03在青島大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院體檢中心查體的膠東半島地區(qū)漢族健康志愿者450例，男281例，女169例。年齡范圍25～65歲，平均年齡(48.46±12.83)歲。受試者排除標準：3年內(nèi)有心腦血管疾病、內(nèi)分泌疾病、消化系統(tǒng)疾病、腎臟疾病；曾有心肌梗死病史或行心臟手術者；同時服用其他與硝酸酯類作用相似的藥物；臨床診斷肥胖；有酗酒史；參加實驗前化驗有異常；有硝酸甘油服用禁忌癥；高血壓病患者。在入選本實驗研究之前所有志愿者做常規(guī)檢驗包括血常規(guī)、血凝常規(guī)、生化全套、尿常規(guī)等。450名健康志愿者的ALDH2基因型，分為野生型(GG）和突變型(GA/AA)，其中，野生型227例，突變型223例。

試驗方案經(jīng)本院倫理委員會審核批準，所有受試者均自愿簽署知情同意書。

試驗方法：基因型的測定，采集受試血樣2 ml，依地酸（ EDTA）抗凝，使用的血液基因組DNA提取試劑盒購于天根生化科技有限公司；taqman探針檢測試劑盒購自美國Life Tech公司。

提取DNA：ALDH2基因單核苷酸多態(tài)性位點rs671基因型檢測使用美國Life Tech公司taqman探針檢測試劑盒(C__11703892_10)進行分型檢測，檢測流程參照試劑盒使用說明進行；在美國Life Tech公司生產(chǎn)的ABI 9700 PCR儀上開始PCR反應，多聚酶鏈反應（PCR）條件：95℃ 10 min，(92℃ 15 s, 60℃ 1 min) 60個循環(huán)，PCR完成后使用美國應用生物系統(tǒng)公司（ABI）7900HT型熒光定量PCR儀進行數(shù)據(jù)掃描，檢測結(jié)果使用相應軟件基因型判讀。(基因型的測定由上海聯(lián)合基因公司代測)

無創(chuàng)血流動力學參數(shù)的測量（美國Cardio Dynamics公司生產(chǎn)的BioZ.com無創(chuàng)血流動力學檢測儀測定）： 受試者于試驗當日空腹舌下含服硝酸甘油0.5 mg（規(guī)格為每片 0.5 mg，批號為 20110311，北京益民藥業(yè)有限公司生產(chǎn)），分別在服藥前0 min，服藥后5 min、15 min時測量受試者的無創(chuàng)血流動力學指標。測量時，受試者取平臥位，按照無創(chuàng)血流動力學監(jiān)測儀(ICG)的操作說明，由專業(yè)醫(yī)務人員將傳感器置于患者兩側(cè)頸根部、劍突水平與腋中線交界的胸部兩側(cè)，使接觸部位充分導電，輸入受試者個人信息，包括姓名、性別、年齡、身高、體表面積（BSA）等。待波形穩(wěn)定后，記錄血流動力學指標心排血量（CO）、血管外周阻力（SVR）、收縮壓（SBP）、舒張壓（DBP），CO取決于心臟前后負荷和心肌收縮力；SVR反應心臟后負荷，反應機體外周血管舒縮狀態(tài)。

統(tǒng)計學處理：采用Pearson卡方(χ2)檢驗評價基因型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡(HWE)。應用SPSS17.0 統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計分析, 計量資料采用均數(shù)±標準差表示,兩基因型間均數(shù)比較采用t檢驗,多時間點間均數(shù)比較采用方差分析，基因型內(nèi)兩兩比較采用SNK-q檢驗，計數(shù)資料采Pearson卡方(χ2)檢驗及卡方趨勢檢驗（飲酒比例），以P＜0. 05具有統(tǒng)計學意義。應用多元線性回歸分析多個影響ΔCO、ΔSVR的因素與ALDH2基因多態(tài)性之間的線性數(shù)量關系。

2 結(jié)果

基因多態(tài)性的遺傳平衡檢驗：對450位受試者的等位基因、基因型分布進行基因多態(tài)性遺傳平衡檢驗，基因型分布符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律 (χ2= 2.156，P＞0.05)，表明樣本具有群體代表性。

野生型與突變型一般臨床資料的比較：野生型與突變型的樣本數(shù)、性別、年齡、吸煙、飲酒比例差異無統(tǒng)計學意義 (P均＞0.05)。表1

表1 患者的一般臨床資料特征

野生型與突變型無創(chuàng)血流動力學參數(shù)CO、SVR、心率、收縮壓、舒張壓變化的比較：突變型的CO在服 藥 前 0 min， 服 藥 后 5 min、15 min（CO0min，CO5min，CO15min）三個時間點比較差異有統(tǒng)計學意義

(P=0.025)，其中 CO15min較 CO0min降低顯著 (P=0.008)；

野生型的CO在該三個時間點比較差異有統(tǒng)計學意 義 (P=0.019)， 其 中 CO5min較 CO0min升 高 顯 著(P=0.005)；突變型的SVR在該三個時間點比較差異無統(tǒng)計學意義 (P=0.404)。野生型的SVR在該三個時間點比較差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.001)，SVR5min及SVR15min較 SVR0min均顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義(P均＜0.001)。表2

表2 野生型及突變型不同時間點心排血量及血管外周阻力的比較（±s）

表2 野生型及突變型不同時間點心排血量及血管外周阻力的比較（±s）

注：與 CO0 min比 *P＜0.05；與 SVR0 min比△P＜0.05。CO： 心排血量 SVR： 血管外周阻力。余注見表 1

基因型 CO0 min CO5 min CO15 min SVR0 min SVR5 min SVR15 min GA/AA 5.644±1.692 5.333±1.735 5.214±1.729* 1118.909±302.095 1077.81±333.142 1098.76±329.977 GG 5.519±1.152 5.836±1.139* 5.639±1.317 1161.528±282.726 992.096±274.779△ 1091.28±290.670△

突變型的心率、收縮壓、舒張壓在三個時間點比較差異無統(tǒng)計學意義（P=0.126，0.467，0.083）；野生型的心率、收縮壓、舒張壓在三個時間點比較差異無統(tǒng)計學意義（P=0.051，0.139，0.070）。

ALDH2基因多態(tài)性與ΔCO、ΔSVR的關系（ΔCO1=CO0min-CO5min，ΔSVR1=SVR0min-SVR5min，ΔCO2=CO0min-CO15min，ΔSVR2=SVR0min-SVR15min）：將ΔCO1作為因變量，將ALDH2基因多態(tài)性、性別、年齡、體表面積、吸煙史、飲酒史作為自變量，進行多元線性回歸分析。選擇逐步回歸分析，對方程檢驗，F(xiàn)=168.055，P＜0.001，有統(tǒng)計學意義。對方程中各自變量單獨檢驗，自變量“性別、年齡、體表面積、吸煙史、飲酒史”對因變量的影響不顯著，P值分別為：0.773、0.561、0.949、0.969、0.654，均剔除。僅自變量“ALDH2基因多態(tài)性”對因變量的影響顯著，P值為：0.000，回歸方程為：ΔCO1=-0.948+0.631 ALDH2基因多態(tài)性。 將 ΔCO2、ΔSVR1、ΔSVR2分別作為因變量，僅自變量“ALDH2基因多態(tài)性”對因變量的影響顯著，P值均＜0.001，回歸方程分別為：ΔCO2=-0.670+0.550 ALDH2基因多態(tài)性；ΔSVR1=297.774-128.342 ALDH2基因多態(tài)性；ΔSVR2=120.351-50.105 ALDH2 基因多態(tài)性。

野生型與突變型無創(chuàng)血流動力學參數(shù)CO、SVR變化的組間比較：野生型與突變型在ΔCO1比較、ΔSVR1比較有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.001，P＜0.001)；野生型與突變型ΔCO2比較 、ΔSVR2比較亦有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.001，P=0.004)。表3

表3 不同基因型 ΔCO 及 ΔSVR 的比較（±s）

表3 不同基因型 ΔCO 及 ΔSVR 的比較（±s）

注：縮略語注解見表2

GG GA/AA t P ΔCO1 -0.317±0.350 0.311±0.643 12.907 ＜0.001 ΔSVR1 169.432±117.415 41.090±135.001 -10.766 ＜0.001 ΔCO2 -0.119±0.043 0.430±0.046 8.786 ＜0.001 ΔSVR2 70.245±12.769 20.139±11.356 -2.929 0.004

3 討論

硝酸甘油作為抗心絞痛的經(jīng)典藥物，已有多位學者對其生物轉(zhuǎn)化機制進行了廣泛研究，2002年Chen等發(fā)現(xiàn)在巰基化合物參與下，ALDH2能夠催化硝酸甘油生成1，2-二硝酸甘油和亞硝基硫醇，之后ALDH2在硝酸甘油代謝中的重要作用引起越來越多學者的關注。研究發(fā)現(xiàn)，ALDH2基因在12號外顯子504位點存在一個點突變，出現(xiàn)堿基置換：G-A，因而 ALDH 2 基因存在 ALDH2* 1、ALDH2*2兩個等位基因，ALDH2*1/ALDH2*1 基因型(野生型)具有ALDH2的正?；盍Γ珹LDH2*1/ALDH2*2基因型(突變型雜合型)存在6%的酶活力，而ALDH2* 2/ALDH2*2基因型(突變型純合型)則完全喪失酶的活力[3,4]，這對于40% 的有ALDH2基因變異的亞洲人群具有重要的臨床意義[5]。

基因的多態(tài)性與個體間藥物代謝與效應的差異具有相關性。近幾年國外動物實驗研究提示ALDH2基因在硝酸甘油對肺部及循環(huán)系統(tǒng)血管床的生物轉(zhuǎn)化中發(fā)揮重要作用[6]，且ALDH2基因的突變可部分減少硝酸甘油的擴血管作用[7,8]。而Isla 等[9]對既往文獻報道的回顧，未發(fā)現(xiàn)在ALDH2基因高度突變率的日本人群中存在硝酸甘油的臨床使用障礙，舌下含服硝酸甘油的藥物效應與ALDH2基因多態(tài)性的關系臨床證據(jù)不足。國內(nèi)研究ALDH2對硝酸甘油代謝的影響多從基因多態(tài)性與冠心病患者心絞痛急性發(fā)作時單獨舌下含服硝酸甘油有效與否的角度著手[4,10]，不同研究結(jié)果亦有爭議，此外，上述研究中一項重要的衡量指標為疼痛的緩解程度，其界定存在很大的主觀感受性，而影響實驗結(jié)果。

本臨床研究應用無創(chuàng)血流動力學檢測儀（ICG）評估硝酸甘油的效應，即監(jiān)測健康人含服硝酸甘油前后無創(chuàng)血流動力學指標CO及SVR的變化評價硝酸甘油的效應，國內(nèi)外此類研究不多見，而且本研究使用客觀的數(shù)據(jù)指標評估硝酸甘油的效應，克服了上述實驗的主觀性，為ALDH2基因多態(tài)性影響硝酸甘油的藥物效應提供了臨床證據(jù)。ICG是人體阻抗測量技術在心血管血流動力學方面的一個重要應用[11]，根據(jù)心臟收縮及舒張時胸腔阻抗的變化,可測得心臟血流動力學狀態(tài)[12]，ICG的優(yōu)勢有無創(chuàng)、安全、經(jīng)濟、直觀，能幫助代償性與失代償性心衰患者的診斷、評價冠狀動脈病變的嚴重程度[13]、評估藥物治療的效果和長期預后[14]，本研究根據(jù)硝酸甘油藥物代謝動力學特點，選取含服硝酸甘油前及服藥后5 min、15 min三個具有代表意義的時間點，結(jié)合反應心臟每分輸出量及外周血管阻力的無創(chuàng)血流動力學指標CO、SVR的變化觀察不同基因型受試者含服硝酸甘油的藥效差別。實驗結(jié)果如下，含服硝酸甘油后5 min及15 min較含服硝酸甘油前比較：①野生型 CO均上升，突變型CO均下降。②兩種基因型的SVR均下降，野生型下降幅度較大，即ALDH2基因多態(tài)性影響反應硝酸甘油效應的CO及SVR的變化。

含服硝酸甘油后 5 min 及 15 min，野生型 CO上升，突變型CO下降的可能解釋：①野生型含服硝酸甘油后HR反射性升高明顯，而每搏輸出量降低相對不明顯，據(jù)公式CO=SV×HR，二者乘積增大。②突變型含服硝酸甘油后SV降低明顯而HR升高相對不明顯，二者乘積減小。兩種基因型的SVR均下降，野生型下降幅度較大的可能原因：低濃度的硝酸甘油引起的靜脈舒張遠遠大于小動脈的舒張，繼而左心室舒張末的壓力、外周血管阻力降低，心臟的前后負荷降低，故健康人含服硝酸甘油后外周血管阻力均降低，因野生型具有ALDH2的正常活力，其舒張血管的作用強，所以野生型SVR降低明顯。

本實驗的不足之處：①僅考慮了ALDH2基因多態(tài)性對硝酸甘油代謝的影響，而體外及體內(nèi)研究提示,硝酸甘油的體內(nèi)生物轉(zhuǎn)化過程還受以下多種酶的影響，如：谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶，、細胞色素P450還原酶、黃嘌呤氧化還原酶等在內(nèi)的數(shù)種酶，本研究不能剔除其他酶類對硝酸甘油代謝的影響。②本研究屬于臨床實驗性研究，樣本量尚不足，且限制在健康人群，下一步擬擴大樣本量，納入冠心病患者，進一步觀察ALDH2基因多態(tài)性對硝酸甘油效應及治療效果的影響。

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