正交設(shè)計(jì)優(yōu)選五倍子提取工藝研究

★ 鄭玲英 劉芳菊 王躍生 曾文雪 (1.南昌立健藥業(yè)有限公司 南昌00;.石家莊四藥有限公司 石家莊05001;.中藥固體制劑制造技術(shù)國家工程研究中心 南昌0006;4.江西中醫(yī)學(xué)院

南昌330006)

五倍子為漆樹科植物鹽膚木Rhus chinensis Mill.等葉上的蟲癭，主要由五倍子蚜 Melaphis chinensis(Bell)Baker寄生而形成。五倍子具有斂肺降火，澀腸止瀉，斂汗，止血，收濕斂瘡等功效［1］。五倍子中含有大量鞣質(zhì)，鞣質(zhì)具有收斂作用，是治療久瀉久痢、癰腫瘡毒的有效成分之一，易溶于水。故采用傳統(tǒng)水煎煮法提取芪仙沖劑中有效成分。

本實(shí)驗(yàn)以鞣質(zhì)水解后的沒食子酸為指標(biāo)，采用L9(34)正交試驗(yàn)，對(duì)煎煮次數(shù)、煎煮時(shí)間、加水倍量等因素進(jìn)行考察，以轉(zhuǎn)移率、干浸膏得率為提取工藝的評(píng)價(jià)指標(biāo)，優(yōu)化其提取工藝，為其后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

AL104/01電子天平(梅特勒－托利多儀器(上海)公司);RE－5210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠);RT－02L粉碎機(jī)(臺(tái)灣榮聯(lián)鐵工廠);Agilent 1100系列高效液相色譜儀;KQ－250超聲波清洗器(昆山市超聲波儀器有限公司)。

五倍子為漆樹科植物鹽膚木Rhus chinensis Mill、青麩楊 Rhus potaninii Maxin.葉上的蟲癭，由五倍子蚜寄生而形成，為肚倍，購自江西江中飲片廠，藥材鑒定均符合《中國藥典》2005版一部的規(guī)定。沒食子酸對(duì)照品(含測(cè)用，批號(hào):110831－200302，中國藥品生物制品檢定所)，甲醇為色譜純，其它試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 沒食子酸含量測(cè)定

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取沒食子酸對(duì)照品12.5mg，置于250mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，配制成濃度為0.05mg/mL的沒食子酸溶液

2.1.2 供試品溶液的制備 取五倍子粉末(過四號(hào)篩)約10 g，加入10倍量的水，提取2次，每次2小時(shí)，濾過，合并濾液，定容至500mL容量瓶中。精密吸取5mL置塞錐形瓶中，水浴揮干，精密加入4mol/L鹽酸溶液50mL，水浴中加熱水解3.5小時(shí)，放冷，濾過。精密量取續(xù)濾液1mL，置100mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得。

2.1.3 色譜條件［2］色譜柱:Hypersil ODS 柱(250mm ×4.6mm，5μm);流動(dòng)相:甲醇:0.05%磷酸水溶液(5:95);檢測(cè)波長:271nm;流速:1mL/分;柱溫:25℃。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別精密吸取2.1.1項(xiàng)下對(duì)照品溶液 2.5，5，10，15，20 mL 至 25mL 量瓶中，加水稀釋至刻度。分別精密吸取10μL，依次注入液相色譜儀，進(jìn)行測(cè)定，以峰面積對(duì)濃度(μg/mL)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=39.944X+17.758(r=0.999 8)。結(jié)果表明，沒食子酸在 0.1μg －0.534μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液10μL，按上述色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)定對(duì)照品溶液中沒食子酸峰面積值，結(jié)果RSD=0.96%。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份提取液供試品溶液，分別在0，2，4，6，8，10，12 小時(shí)進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，結(jié)果表明供試品溶液在12小時(shí)內(nèi)峰面積積分值基本穩(wěn)定，RSD=0.83%。

2.2 正交試驗(yàn)優(yōu)選提取工藝

2.2.1 正交設(shè)計(jì)優(yōu)化工藝 以浸膏得率以及五倍子中的沒食子酸含量為考察指標(biāo)采用正交試驗(yàn)，考察不同加水量，提取次數(shù)，提取時(shí)間對(duì)提取效果的影響，每個(gè)因素確定為3個(gè)水平，見表1。

表1 提取工藝因素水平表

2.2.2 提取試驗(yàn) 稱取五倍子九份，每份稱取處方原藥材36.64 g，按表 2.1.2 中的方法，采用 L9(34)正交表安排試驗(yàn)進(jìn)行提取，提取液濃縮并定容至250mL，以供測(cè)定沒食子酸含量以及浸膏得率。

2.3 膏得率的測(cè)定

用移液管精密移取2.2項(xiàng)下定容到250mL的提取液25mL置于已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，先于水浴上揮干，然后按2005年版中國藥典一部附錄IX H烘干法進(jìn)行測(cè)定，即將盛有樣品溶液的蒸發(fā)皿置于烘箱中，在105℃下干燥3小時(shí)，然后移置于干燥器中冷卻30分鐘，精密稱定重量，再在上述溫度干燥1小時(shí)，冷卻，稱重，至連續(xù)2次稱重的差異不超過5 mg為止。根據(jù)以下公式計(jì)算藥材干浸膏的得率。

2.4 沒食子酸轉(zhuǎn)移率及浸膏得率的測(cè)定結(jié)果

按2.1.3項(xiàng)下的色譜條件，測(cè)定各正交試驗(yàn)提取液中的沒食子酸含量，并測(cè)定其浸膏得率，計(jì)算沒食子酸的轉(zhuǎn)移率，進(jìn)行極差和方差分析，結(jié)果見表2－4。

表2 正交實(shí)驗(yàn)方案及試驗(yàn)結(jié)果分析結(jié)果

表3 以沒食子酸轉(zhuǎn)移率為為指標(biāo)的方差分析表

表4 以浸膏得率為指標(biāo)的方差分析表

結(jié)果分析:由方差分析表和正交試驗(yàn)結(jié)果可以看出，以沒食子酸轉(zhuǎn)移率為指標(biāo)因素A有顯著性差異，以浸膏得率為指標(biāo)因素A和B有顯著性差異，三因素對(duì)提取的影響效果程度為A＞B＞C，故結(jié)合直觀分析，考慮節(jié)約成本，縮短工藝時(shí)間，確定組合工藝為A2B2C2，即加10倍量水，煎煮2次，每次煎煮2小時(shí)。

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

稱取藥材三份，按優(yōu)選工藝進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)方法同上，測(cè)定沒食子酸的轉(zhuǎn)移率和浸膏得率，結(jié)果見表2。

表2 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明，按優(yōu)選的提取工藝提取，所得沒食子酸的轉(zhuǎn)移率和浸膏得率穩(wěn)定，表明工藝可行。

3 討論

水為中藥提取中最常用的溶劑，具有價(jià)廉，易得，安全，無毒，無污染等特點(diǎn)。五倍子中的主要有效成分為鞣質(zhì)及沒食子酸，其中五倍子鞣質(zhì)又叫單寧酸，易溶于水，因此本文采用水煎煮法提取五倍子的有效成分。

五倍子中具有多種有效成分，故本試驗(yàn)對(duì)五倍子提取物的浸膏得率進(jìn)行了研究，以最大化提取其中的有效成分群。

［1］國家藥典委員會(huì).中國藥典2010年版一部［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社。2010:62.

［2］劉芳菊，王躍生，羅曉健，等.HPLC法測(cè)定芪仙湯微丸中沒食子酸含量［J］.江西中醫(yī)藥，2009，，40(5):63 －64.