HPLC測(cè)定消痔坐浴劑中5－O－甲基維斯阿米醇苷的含量*

★ 田曉東 侴桂新 藍(lán)悠 李暉 (.廣東省深圳市第六人民醫(yī)院 深圳5805;.上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥標(biāo)準(zhǔn)化研究中心 上海0003)

消痔坐浴劑是我院肛腸科根據(jù)多年臨床經(jīng)驗(yàn)，經(jīng)反復(fù)實(shí)踐及總結(jié)篩選的一個(gè)協(xié)定處方，由黃柏、澤瀉、黃芩、檳榔、熟大黃、防風(fēng)等11味中藥組成。主要采用熏洗、熱敷之法，使藥力加熱力，直接作用于肛門(mén)病變部位，，刺激肛門(mén)皮膚，促進(jìn)血液和淋巴循環(huán)，從而達(dá)到解毒、消腫、止痛、生肌的作用。為實(shí)現(xiàn)制劑的質(zhì)量控制，保證臨床用藥安全，進(jìn)一步提高、完善其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，作者參照有關(guān)文獻(xiàn)［1－2］，采用HPLC，選擇防風(fēng)特有的有效成分5－O－甲基維斯阿米醇苷的含量作為指標(biāo)，建立了準(zhǔn)確有效的測(cè)定方法，對(duì)消痔坐浴劑的質(zhì)量控制有重要意義。

1 儀器與試藥

Agilent 1100高效液相色譜儀、DAD檢測(cè)器、四元泵、Agilent1100工作站(美國(guó) Agilent公司，DE43630806);WT2003H電子天平(常州萬(wàn)泰)，5－O－甲基維斯阿米醇苷對(duì)照品(批號(hào):111523－20201007，含量 96.5%，中國(guó)藥品生物制品檢定所)，實(shí)驗(yàn)中中藥材均購(gòu)于深圳市一致藥材有限公司，甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取5－O－甲基維斯阿米醇苷對(duì)照品13.27 mg置100 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，再精密量取上述溶液5 mL置50 mL量瓶中加甲醇稀釋至刻度，即得(含5－O－甲基維斯阿米醇苷12.81μg/mL)。

2.2 消痔坐浴劑的制備 取黃柏290 g、澤瀉290 g、當(dāng)歸 290 g、黃芩 290 g、檳榔 240 g、熟大黃 240 g、生地 240 g、秦艽 240 g、防風(fēng) 240 g、桃仁 144 g，加水60 000 mL，武火沸后轉(zhuǎn)文火煎15分鐘，4層紗布濾出濾液，放涼后分裝至100瓶500 mL玻璃瓶中，冷藏備用。

2.3 供試品溶液制備 取消痔坐浴劑，用0.45μm的濾膜濾過(guò)，精密量取濾液50 mL，于蒸發(fā)皿中水浴上濃縮至5 mL左右，移置50 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度。

2.4 色譜條件及干擾試驗(yàn) 色譜柱:Shimadzu VP2ODS(250 mm ×4.60 mm，5 μm);流動(dòng)相:乙腈為流動(dòng)相A，0.1%磷酸水溶液為流動(dòng)相B，按表1比例進(jìn)行梯度洗脫;流速:1.00 mL/分;檢測(cè)波長(zhǎng):254 nm;柱溫:30℃;進(jìn)樣量:10 μL。在此條件下，5－O－甲基維斯阿米醇苷與鄰峰基線分離，分離度＞5.6，理論板數(shù)按5－O－甲基維斯阿米醇苷峰計(jì)≥6500。取除防風(fēng)外的其他幾味藥，制成缺防風(fēng)的陰性樣品，再按“2.2、2.3”項(xiàng)下方法制成陰性樣品溶液，依“2.4”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，陰性樣品溶液無(wú)干擾，說(shuō)明試驗(yàn)專屬性良好，色譜圖見(jiàn)圖1。

表1 流動(dòng)相洗脫比例(%)

圖1 HPLC色譜圖

2.5 線性關(guān)系考察 精密量取對(duì)照品溶液適量，用甲醇稀釋，得濃度為 2.56，5.12，10.25，12.81，19.22，25.62μg/mL的5－O －甲基維斯阿米醇苷系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按2.4項(xiàng)下的色譜條件分別進(jìn)樣10μL，以峰面積值(Y)對(duì)進(jìn)樣量(X)進(jìn)行線性回歸，得5－O－甲基維斯阿米醇苷標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:Y=2.257×106X －1.834×104(r=0.999 3)。結(jié)果表明5－O－甲基維斯阿米醇苷在2.56 －25.62 μg范圍內(nèi)，峰面積與進(jìn)樣量呈良好的線性關(guān)系。

2.6 精密度試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液在“2.4”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣10 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，5－O－甲基維斯阿米醇苷峰面積的RSD為0.9%。表明試驗(yàn)精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液10 μL，分別于 0，2，4，8，12，16，24 小時(shí)進(jìn)樣，測(cè)得供試品溶液中5－O－甲基維斯阿米醇苷峰面積的RSD為1.7%，表明供試品溶液在24小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 對(duì)批號(hào)為20120422消痔坐浴劑，按“2.3”項(xiàng)下方法制備6份并測(cè)定，結(jié)果5－O－甲基維斯阿米醇苷平均含量為12.48 μg/mL，峰面積的RSD為1.49%，結(jié)果表明該方法的重復(fù)性好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取已知5－O－甲基維斯阿米醇苷含量的，用0.45 μm的濾膜濾過(guò)的消痔坐浴劑50 mL，共6份，濾液分別精密加入含量為128.05 μg/mL(精密稱取含量為 96.5%的 5 － O －甲基維斯阿米醇苷對(duì)照品13.27 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，即得)的5－O－甲基維斯阿米醇苷對(duì)照品溶液5 mL，分別于蒸發(fā)皿中水浴上濃縮至5 mL左右，移置50 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，按“2.4”項(xiàng)下方法測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.10 樣品含量測(cè)定 按“2.3”“2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，注入高效液相色譜儀，記錄峰面積，代入線性方程計(jì)算，測(cè)定樣品中5－O－甲基維斯阿米醇苷的含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 指標(biāo)成分的確定 防風(fēng)作為方中的重要成分，具有祛腸風(fēng)，利水濕的作用，主要含有色原酮類、香豆素類、揮發(fā)油、多糖類等，在色原酮成分中以5－O－甲基維斯阿米醇苷含量最高［3］，故以5－O－甲基維斯阿米醇苷作為本方的質(zhì)量控制指標(biāo)。

3.2 流動(dòng)相的選擇 試驗(yàn)比較了甲醇－水、乙腈－水、乙腈－磷酸的不同配比，結(jié)果以乙腈－磷酸水流動(dòng)相時(shí)，梯度洗脫為好，樣本中的5－O－甲基維斯阿米醇苷能與其他成分實(shí)現(xiàn)基線分離，峰形良好。

3.3 含量限度 參照中國(guó)藥典2010年版一部規(guī)定，防風(fēng)中升麻素苷和5－O－甲基維斯阿米醇苷的總含量≥0.24%［4］，而由深圳市一致藥材有限公司提供給我院的中藥飲片防風(fēng)均產(chǎn)自內(nèi)蒙，其有效成分5－O－甲基維斯阿米醇苷的含量達(dá)到0.28%［5］，根據(jù)本處方資料，理論含量應(yīng)不少于13.44 μg/mL，根據(jù)所測(cè)3批樣品中的5－O－甲基維斯阿米醇苷最低含量為11.57 μg/mL，考慮到用水提取的因素，暫定本品中含5－O－甲基維斯阿米醇苷≥10 μg/mL。

本方法測(cè)定了三批次消痔坐浴劑煎劑中的5－O－甲基維斯阿米醇苷，處理簡(jiǎn)便，結(jié)果穩(wěn)定可靠，可為消痔坐浴劑的質(zhì)量控制和不同配伍比較提供重要參考。

［1］嚴(yán)葉霞.反相高效液相色譜法測(cè)定防風(fēng)通圣丸中5－O－甲基維斯阿米醇苷的含量［J］.中南藥學(xué)，2012，2(10):101 －103.

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［3］姜艷艷，劉斌，石任兵.高效液相色譜法測(cè)定防風(fēng)色原酮部位中4 種成分含量［J］.北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，29(2):128.

［4］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(一部)［M］.北京化學(xué)工業(yè)出版社，2010:140.

［5］李悅悅，王 慧，陳 俊，等，HPLC法測(cè)定防風(fēng)中升麻苷、升麻素、5－O－甲基維斯阿米醇苷和亥茅酚苷的含量［J］.藥學(xué)實(shí)踐雜志，2010，28(6):445 －447.