鄰苯二甲酸二乙基己基酯對新生大鼠肺組織發(fā)育的影響

應(yīng)燕芬，胡小婭，梁 園，林 錦，吳海山，蔡曉紅，林振浪，陳尚勤

(1.溫州醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院兒科，浙江溫州 325027;2.浙江省臺州醫(yī)院兒科，浙江臨海317000;3.Department of Neonatology，4.Department of Pathology，Mount Sinai School of Medicine，New York10029，USA)

鄰苯二甲酸二乙基己基酯〔di-(2-ethylhexyl)phthalate，DEHP〕是一種增塑劑，被應(yīng)用于醫(yī)療設(shè)備如血袋、靜脈營養(yǎng)給藥袋、氣管插管、鼻飼管和深靜脈置管中。研究表明，在成年和幼年動物中DEHP作為一種影響內(nèi)分泌的環(huán)境干擾物，對生殖、肝、腎和肺發(fā)育等具有毒性作用[1－2]?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMP)是降解細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的主要介質(zhì)，與其特異性組織抑制劑即金屬蛋白酶組織抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP)在肺發(fā)育過程中共同扮演著重要的角色[3－4]。細(xì)胞和ECM的相互作用和ECM的重建對胎肺的發(fā)育至關(guān)重要，尤其是Ⅳ型膠原為主要成分的基底膜結(jié)構(gòu)變化。MMP-9/TIMP-1主要作用于基底膜的Ⅳ型膠原。MMP-9的過量表達(dá)或MMP-9/TIMP-1的表達(dá)失衡均可導(dǎo)致肺發(fā)育受阻[5－7]。轉(zhuǎn)化生子因子β(transforming growth factor β，TGF-β)是一組功能復(fù)雜的多肽生長因子，在肺支氣管樹分支生成過程和上皮細(xì)胞分化過程中起重要作用[8]，其異常表達(dá)亦影響肺發(fā)育。本研究應(yīng)用DEHP染毒新生大鼠，探討DEHP對肺發(fā)育的影響，并從ECM重建角度探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

DEHP和玉米油，Sigma公司;RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，加拿大Fermentas(MBI)公司;PCR引物，上海英駿生物工程公司合成;SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(Perfect Real Time)定量試劑盒，日本TaKaLa公司;Trizol RNA提取液、山羊抗大鼠MMP-9抗體和兔抗大鼠TGF-β1抗體，美國Santa Cruz公司;兔抗大鼠TIMP-1抗體，武漢博士德公司;辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG多聚體或辣根過氧化物酶標(biāo)記兔抗羊IgG多聚體PV試劑盒，美國GBI公司。實(shí)時熒光定量PCR儀，羅氏Light-Cycler?480實(shí)時熒光定量PCR系統(tǒng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物和分組

SPF級Sprague-Dawley新生大鼠120只購自溫州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心，動物許可證號:SCXK(浙)2005-0019，在SPF級實(shí)驗(yàn)室內(nèi)飼養(yǎng)。隨機(jī)分為溶劑對照組及DEHP 10，100 和 750 mg·kg－1染毒組。DEHP染毒組于出生后第1天開始分別ip給予DEHP，溶劑對照組ip給予等體積玉米油，每天1次。每組1/2大鼠持續(xù)染毒14 d，另一半持續(xù)染毒21 d。各組大鼠出生體質(zhì)量無明顯差異，均母乳喂養(yǎng)。

1.3 肺組織標(biāo)本制備

染毒結(jié)束后第2天，ip給予戊巴比妥鈉35 mg·kg－1麻醉大鼠，每組隨機(jī)取5只，固定，打開胸腔，結(jié)扎右主支氣管，取出肺組織，用4%中性甲醛溶液經(jīng)支氣管給20 cm H2O的氣道壓力進(jìn)行灌注固定，然后結(jié)扎右主支氣管，置于4%中性甲醛溶液固定，48 h后脫水，石蠟包埋，沿肺葉縱軸切片，HE染色，光鏡下觀察組織病理改變;取鼠左肺組織，分離剪去肺門部大支氣管血管，將肺新鮮標(biāo)本用冷生理鹽水漂洗去血跡后，濾紙吸干，用錫箔紙包裹好，1 min內(nèi)迅速置于液氮中保存，轉(zhuǎn)移至－80℃冰箱儲存用于實(shí)時PCR檢測MMP-9，TIMP-1和TGF-β1mRNA表達(dá)水平。

1.4 肺組織HE染色形態(tài)學(xué)觀察和肺間質(zhì)比例測定

制備肺組織石蠟切片，HE染色，顯微鏡下形態(tài)學(xué)觀察并照相，使顯微鏡處于同一放大倍數(shù)(100倍)及電壓，每張切片隨機(jī)選擇5個視野，測量肺間質(zhì)比例。首先將切片中的大血管，支氣管去除，用數(shù)字圖像分析技術(shù)分割圖片，調(diào)整照片，找到肺間質(zhì)和肺泡對比最強(qiáng)烈的像素閾值T，T=100，根據(jù)每個圖像位點(diǎn)的像素不同，可以分割圖片為肺間質(zhì)、肺泡和其他，每個視野肺間質(zhì)的像素與總像素的比值表示肺間質(zhì)比例。

1.5 實(shí)時熒光定量 PCR檢測肺組織 MMP-9，TIMP-1和TGF-β1mRNA 表達(dá)

取100 mg新鮮組織，放到研磨器中，加入液氮充分研磨至粉末，加入1 ml Trizol，提取組織總RNA，紫外分光光度計(jì)測量 A260nm/A280nm，計(jì)算RNA的純度和濃度。Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，TGF-β1的上游引物為5'CCCCTGGAAAGGGCTCAACAC3'，下游引物為 5'TCCAACCCAGGTCCTTCCTAAAGTC3'，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為 136 bp;MMP-9的上游引物為5'ACCCCATGTATCACTACCACGAG3'，下 游引物 為 5'ATAGTGCTGGCTGTGGGGTGTG3'，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為91 bp;TIMP-1的上游引物為5'ATAGTGCTGGCTGTGGGGTGTG3'，下游引物為5'TGATCGCTCTGGTAGCCCTTCTC3'，擴(kuò)增產(chǎn)物的長度為130 bp;內(nèi)參β肌動蛋白的上游引物為5'TCATGAAGTGTGACGTTGACATCCGT3'，下游引物為 5'CCTAGAAGCATTTGCGGTGCACGATG3'，擴(kuò)增產(chǎn)物的長度為285 bp。取總RNA 1 μl按逆轉(zhuǎn)錄操作說明書逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA;取2 μl逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物加入20 μl反應(yīng)體系中，按以下反應(yīng)條件擴(kuò)增:95℃預(yù)變性30 s→95℃變性10 s→57℃退火10 s→72℃延伸20 s，40個循環(huán)，72℃采集熒光信號。用羅氏LightCycler?480實(shí)時熒光定量PCR系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)時PCR檢測。以2－△Ct表示各組目標(biāo)基因mRNA相對表達(dá)水平?！鰿t=Ct目標(biāo)基因－Ctβ肌動蛋白，Ct為擴(kuò)增過程中熒光信號強(qiáng)度達(dá)到閥值的循環(huán)數(shù)。

1.6 免疫組化方法檢測肺組織MMP-9，TIMP-1和TGF-β1蛋白表達(dá)

取肺組織標(biāo)本經(jīng)4%中性多聚甲醛固定，石蠟包埋，5 μm 連續(xù)切片，60℃烤片 2 h，梯度乙醇脫水，3%H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶，依次加入一抗(山羊抗大鼠MMP-9抗體、兔抗大鼠TGF-β1和TIMP-1抗體)，二抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG多聚體或辣根過氧化物酶標(biāo)記兔抗羊IgG多聚體)，DAB顯色，脫水，透明，封片，鏡檢。以細(xì)胞漿中沉著棕黃色顆粒的細(xì)胞為陽性細(xì)胞。用Imagepro-plus6.0圖像分析軟件測定10個視野中陽性部位的積分吸光度(integrated absorbance，IA)，計(jì)算IA平均值以表達(dá)待測蛋白的相對表達(dá)水平。IA值越大，蛋白表達(dá)水平越高。

2 結(jié)果

2.1 DEHP對新生大鼠肺發(fā)育形態(tài)和肺間質(zhì)比例的影響

Fig.1 Effect of di-(2-ethylhexyl)phthalate(DEHP)given for 14 d(A)and 21 d(B)on lung histopathological changes in newborn rats(HE ×100).The newborn rats were ip given DEHP from the postnatal 1st day，once daily，for 14 or 21 d.The solvent control group(DEHP 0 mg·kg －1)was given equal volume of corn oil.1:solvent control group;2，3 and 4:DEHP 10，100 and 750 mg·kg－1 groups，respectively.

由圖1和表1結(jié)果看出，DEHP染毒14d，溶劑對照組新生大鼠(圖1A1)肺泡形態(tài)發(fā)育正常，未見炎癥反應(yīng)，未見出血;與溶劑對照組比較，DEHP 10 mg·kg－1組(圖1A2)肺間質(zhì)比例無顯著性差異，肺泡未見明顯炎癥細(xì)胞浸潤和出血;DEHP 100和750 mg·kg－1組(圖 1A3 和 A4)可見肺間質(zhì)增厚，肺泡隔增厚，間質(zhì)細(xì)胞增多，肺間質(zhì)比例增大(P＜0.05)。DEHP 染毒 21 d ，DEHP 10，100 和750 mg·kg－1組(圖1B2～B4)肺間質(zhì)比例、肺泡大小和肺間質(zhì)厚度與溶劑對照組(圖1B1)相比無明顯差異。

Tab.1 Effect of DEHP on lung interstitial tissue proportion of newborn rats

2.2 DEHP染毒對新生大鼠肺組織 MMP-9，TIMP-1和TGF-β1mRNA表達(dá)的影響

實(shí)時 PCR 結(jié)果顯示，MMP-9、TIMP-1、TGF-β1和β肌動蛋白擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解曲線均為特異性單峰，擴(kuò)增曲線呈“S”型，表明所用引物特異性較好。由表2可以看出，DEHP染毒14 d，隨著染毒劑量的增加，新生大鼠肺組織MMP-9和TGF-β1mRNA表達(dá)增加(r=0.979，P＜0.01;r=0.990，P＜0.01)，TIMP-1 mRNA 表達(dá)降低(r=0.904，P＜0.01)。DEHP染毒21 d，隨著染毒劑量的增加，MMP-9 和 TGF-β1mRNA 表達(dá)降低(r=0.878，P＜0.01;r=0.935，P＜0.01)，TIMP-1 mRNA 表達(dá)增加(r=0.819，P＜0.01)。

Tab.2 Effect of DEHP on expression of matrix metalloproteinase 9(MMP-9)，tissue inhibitor of metalloproteinase-1(TIMP-1)，and transforming growth factor-β1(TGF-β1)in lung tissue of newborn rats

2.3 DEHP染毒對新生大鼠肺組織 MMP-9，TIMP-1和TGF-β1蛋白表達(dá)的影響

由圖2看出，新生大鼠肺組織MMP-9，TIMP-1和TGF-β1蛋白免疫組化染色陽性信號均為棕黃色顆粒，定位于胞漿。溶劑對照組肺組織MMP-9，TIMP-1和TGF-β1蛋白在上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞均有表達(dá) (圖 2A1，B1，C1);DEHP 10，100 和750 mg·kg－1染毒14 d，MMP-9 和TGF-β1蛋白在肺泡上皮細(xì)胞、支氣管上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和肺泡間質(zhì)細(xì)胞表達(dá)增加(圖2A2～A4，C2～C4)，TIMP-1蛋白表達(dá)減少(圖2B2～B4)。圖像分析結(jié)果見表3，可見DEHP染毒14 d，新生大鼠肺組織MMP-9和TGF-β1蛋白表達(dá)隨著DEHP染毒劑量的增加而增加 (r=0.770，P＜0.01;r=0.959，P＜0.01)，TIMP-1蛋白表達(dá)隨著DEHP染毒劑量的增加而降低 (r=0.795，P＜0.01)。

由圖3看出，溶劑對照組新生大鼠肺組織MMP-9，TIMP-1和TGF-β1蛋白在上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞均有表達(dá)(圖3A1，B1，C1)，DEHP 10，100 和750 mg·kg－1染毒 21 d，隨 DEHP 染毒劑量的增加，MMP-9和TGF-β1蛋白在肺泡上皮細(xì)胞、支氣管上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和肺泡間質(zhì)細(xì)胞表達(dá)減少(圖3A2～A4，C2～C4)，TIMP-1蛋白表達(dá)增加(圖3B2～B4)。圖像分析結(jié)果可見(表3)，MMP-9和TGF-β1蛋白表達(dá)隨著DEHP染毒劑量的增加而降低(r=0.904，P＜0.01;r=0.819，P＜0.01)，TIMP-1蛋白表達(dá)隨著DEHP染毒劑量的增加而增加 (r=0.619，P＜0.01)。

Fig.2 Effect of DEHP given for 14 d on protein expression of MMP-9(A)，TIMP-1(B)and TGF-β1(C)in lung tissue of newborn rats(×200).See Fig.1 for the rat treatment.1 －4:DEHP 0，10，100 and 750 mg·kg－1group.↑:immunostaining positive cells.

Tab.3 Effect of DEHP on protein expression of MMP-9，TIMP-1 and TGF-β1in lung tissue of newborn rats

Fig.3 Effect of DEHP given for 21 d on protein expression of MMP-9(A)，TIMP-1(B)and TGF-β1(C)in lung tissue of newborn rats(×200).See Fig.1 for the rat treatment.1 －4:DEHP 0，10，100 and 750 mg·kg－1groups.↑:immunostaining positive cells.

3 討論

環(huán)境污染物DEHP在人類生活環(huán)境中廣泛分布，其污染成為世界范圍內(nèi)威脅人類健康的重大問題。DEHP可通過多種途徑進(jìn)入人體，DEHP及其代謝物對機(jī)體生殖系統(tǒng)、肺和呼吸系統(tǒng)等均有毒性作用。目前其肺毒性的作用機(jī)制尚不清楚。肺泡發(fā)育以肺泡壁的變薄以及次級隔的長出、呼吸膜面積的成倍擴(kuò)大為特征，此過程有賴于細(xì)胞、ECM的相互作用和ECM的重建。在肺血管的成熟中ECM的重建也至關(guān)重要。MMP-9能特異性地降解ECM中各型膠原、蛋白聚糖和彈性蛋白等[9]。因此，MMP-9/TIMP-1在肺發(fā)育過程中通過對ECM的重構(gòu)而扮演重要角色[3－4]，它們不僅參與胎肺發(fā)育早期呼吸道結(jié)構(gòu)的形成和肺分枝形態(tài)的發(fā)生，而且還參與肺泡化過程中肺泡壁的變薄和膠原蛋白的沉積與更新，同時通過促進(jìn)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的遷移以及向肺泡Ⅰ型上皮細(xì)胞分化并覆蓋新形成的肺泡間隔，擴(kuò)大呼吸膜內(nèi)表面積，促進(jìn)肺組織發(fā)育成熟。而在肺泡化后期，則有益于肺泡結(jié)構(gòu)和功能的維持與穩(wěn)定。TGF-β是一組功能復(fù)雜的多肽生長因子，在肺分支的形態(tài)生成過程和上皮細(xì)胞分化進(jìn)而合成表面活性物質(zhì)的成熟過程中起重要作用[8]。大量研究表明，TGF-β1與支氣管肺發(fā)育不良有著密切的聯(lián)系。過度表達(dá)的TGF-β1可以抑制肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞增殖、分化而導(dǎo)致新生鼠肺發(fā)育障礙[10－11]。據(jù)報道，母大鼠孕期暴露DEHP可導(dǎo)致新生大鼠尿道下裂，陰莖內(nèi) TGF-β1的表達(dá)增加，且呈劑量依賴性。同時 MMP-9 能激活 TGF-β1，TGF-β1選擇性抑制MMP的表達(dá)，誘導(dǎo)TIMP的表達(dá)[12]。

本研究結(jié)果表明，ip給予新生大鼠DEHP染毒，DEHP對新生大鼠肺形態(tài)發(fā)育具有毒性作用，且與DEHP的染毒劑量呈一定的相關(guān)性。同時研究發(fā)現(xiàn)，DEHP染毒14 d，新生大鼠肺組織 MMP-9 mRNA和蛋白表達(dá)隨DEHP染毒劑量增加而增加，DEHP 100和750 mg·kg－1組肺組織出現(xiàn)明顯的病理改變，即肺泡數(shù)目減少，肺泡體積增大，肺間質(zhì)增厚，肺泡發(fā)育受阻;該結(jié)果與本研究集體前期研究報道一致[13]。DEHP 染毒 21 d，新生大鼠肺組織MMP-9 mRNA和蛋白表達(dá)隨DEHP染毒劑量增加而減少，DEHP 100和750 mg·kg－1組肺組織病理改變減輕，即肺泡間質(zhì)變薄，肺泡隔變薄，肺間質(zhì)比例接近溶劑對照組。導(dǎo)致該結(jié)果的原因之一可能是隨著新生大鼠的發(fā)育，各器官功能逐步完善，如肝解毒作用加強(qiáng);另外，隨著大鼠發(fā)育其自身修復(fù)功能亦增強(qiáng);原因之二是染毒14 d時新生大鼠間質(zhì)性肺炎反應(yīng)較重，染毒21 d時間質(zhì)性肺炎反應(yīng)較輕。因此推測，MMP-9過量表達(dá)可能是 DEHP肺形態(tài)發(fā)育毒性的作用機(jī)制之一。

TIMP-1是MMP-9特異性抑制劑。本研究結(jié)果表明，DEHP染毒14 d，新生大鼠肺組織 TIMP-1 mRNA和蛋白表達(dá)隨著DEHP染毒劑量的增加而減少;DEHP染毒21 d，肺組織 TIMP-1 mRNA和蛋白表達(dá)隨著DEHP染毒劑量的增加而增加;這與MMP-9表達(dá)的變化趨勢相反。由此可見，TIMP-1對MMP-9的表達(dá)有調(diào)控作用，這與文獻(xiàn)報道一致[14]。據(jù)報道，MMP-9/TIMP-1平衡關(guān)系的破壞勢必影響肺組織正常發(fā)育，從而發(fā)生病理形態(tài)變化[15]。由此提示，MMP-9/TIMP-1失衡可能是DEHP肺毒性的作用機(jī)制之一。

本研究結(jié)果表明，DEHP染毒14 d，新生大鼠肺組織TGF-β1mRNA和蛋白表達(dá)隨DEHP染毒劑量的增加而增加，DEHP 100和750 mg·kg－1組肺組織出現(xiàn)明顯的病理改變，即肺泡數(shù)目減少，肺泡體積增大，肺間質(zhì)增厚，肺泡隔增厚。DEHP染毒21 d，新生大鼠肺組織TGF-β1mRNA和蛋白表達(dá)隨DEHP染毒劑量的增加而減少，DEHP 100和750 mg·kg－1組肺組織病理改變減輕，即肺泡間質(zhì)變薄，肺泡隔變薄。由此提示，DEHP的肺毒性可能與其導(dǎo)致肺組織TGF-β1異常表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，DEHP染毒可以抑制新生大鼠肺形態(tài)發(fā)育，其作用機(jī)制可能與其影響肺組織MMP-9/TIMP-1平衡以及TGF-β1基因和蛋白表達(dá)有關(guān)。

[1]Wang KX，Cai HT.Practical Industrial Additives Book(實(shí)用工業(yè)助劑全書)[M].Beijing:Chemical Industry Press，2001:133-135.

[2]Giam CS，Chan HS，Neff GS，Atlas EL.Phthalate ester plasticizers:a new class of marine pollutant[J].Science，1978，199(4327):419-421.

[3]Vu TH，Werb Z.Matrix metalloproteinases:effectors of development and normal physiology[J].Genes Dev，2000，14(17):2123-2133.

[4]Fassina G，F(xiàn)errari N，Brigati C，Benelli R，Santi L，Noonan DM，et al.Tissue inhibitors of metalloproteases:regulation and biological activities[J].Clin Exp Metastasis，2000，18(2):111-120.

[5]Manji JS，O'Kelly CJ，Leung WI，Olson DM.Timing of hyperoxic exposure during alveolarization influences damage mediated by leukotrienes[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2001，281(4):L799-L806.

[6]Méhats C，F(xiàn)ranco-Montoya ML，Boucherat O，Lopez E，Schmitz T，Zana E，et al.Effects of phosphodiesterase 4 inhibition on alveolarization and hyperoxia toxicity in newborn rats[J].PLoS One，2008，3(10):e3445.

[7]Franco-Montoya ML，Bourbon JR，Durrmeyer X，Lorotte S，Jarreau PH，Delacourt C.Pulmonary effects of keratinocyte growth factor in newborn rats exposed to hyperoxia[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2009，297(5):L965-L976.

[8]Bartram U，Speer CP.The role of transforming growth factor beta in lung development and disease[J].Chest，2004，125(2):754-765.

[9]Visse R，Nagase H.Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases:structure，function，and biochemistry[J].Circ Res，2003，92(8):827-839.

[10]Zhao QQ，Deng C，Guo CB，Hua ZY，F(xiàn)eng J.Intra-amniotic endotoxin and postborn hyperoxic exposure upregulate transforming growth factor-β1and α-smooth muscle actin in newborn mice lung[J].Acta Acad Med Mil Tert(第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報)，2010，32(7):642-646.

[11]Jobe AH，Bancalari E.Bronchopulmonary dysplasia[J].Am J Respir Crit Care Med，2001，163(7):1723-1729.

[12]Liu X，Zhang DY，Wu SD，Xiong J，Wei GH.Di(2-ethylhexyl)phthalate induces hypospadic in mice and its effect on the expression of TGF-β1in genital ubercles[J].Chin J Pediatr Surg(中華小兒外科雜志)，2008，29(9):565-568.

[13]Chen SQ，Chen JN，Cai XH，Chen GR，Gao Y，Ge RS，et al.Perinatal exposure to di-(2-ethylhexyl)phthalate leads to restricted growth and delayed lung maturation in newbornrats[J]. JPerinatMed， 2010， 38(5):515-521.

[14]Wei LQ，Dong Y，Li ZH.Effect of atorvastatin on MMP-9 and TIMP-1 levels in bronchoalveolar lavage fluid and serum of rats with bleomycin-induced pulmonary fibrosis[J].J Zhejiang Univ(Med Sci)〔浙江大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)〕.2011，40(1):64-70.

[15]Liu XY，Xu G，Xue XD.Dynamic expression and effects of MMP-9 and TIMP-1 on typeⅣcollagen in lung tissue of neonatal rats with hyperoxia-induced CLD[J].China J Mod Med(中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志)，2008，18(16):2278-2282，2286.