高表達(dá)受體活性修飾蛋白1對(duì)血管緊張素Ⅱ和降鈣素基因相關(guān)肽誘導(dǎo)的A10細(xì)胞降鈣素受體樣受體膜分布的影響

孫 飛，唐江瓊，鄭元斌，秦又發(fā)，陳臨溪，秦旭平

(1.南華大學(xué)藥物藥理研究所，湖南衡陽(yáng) 421001;2.成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院藥劑科，云南昆明 650032)

降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene-related peptide，CGRP)是辣椒素敏感性感覺神經(jīng)末梢釋放的神經(jīng)肽，在調(diào)節(jié)心血管功能方面發(fā)揮重要作用。前期研究證實(shí)，一定濃度的CGRP能抑制血清或血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)誘導(dǎo)大鼠血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell，VMSC)的增殖[1－2]。CGRP功能發(fā)揮是通過其受體而實(shí)現(xiàn)的。CGRP受體是由降鈣素受體樣受體(calcitonin receptor-like receptor，CRLR)，受體活性修飾蛋白1(receptor activity modifying protein 1，RAMP 1)，受體組分蛋白(receptor component protein，RCP)3個(gè)組分組成。目前研究表明，對(duì)CGRP的應(yīng)答作用主要是磷酸化CRLR的過程，而RAMP1的主要作用是糖基化CRLR和作為一種分子伴侶蛋白，將CRLR 轉(zhuǎn)運(yùn)至胞 膜 上[3－4]。有 實(shí) 驗(yàn) 證 實(shí)，增 加RAMP1表達(dá)可以加強(qiáng)VSMC對(duì)CGRP的應(yīng)答作用[5－6]。本實(shí)驗(yàn)觀察高表達(dá) RAMP1 后，CGRP 對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的VSMC增殖及CRLR蛋白表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌E.coli DH5α由南華大學(xué)生物化學(xué)教研室胡小波博士饋贈(zèng);pCDNA3.1/+質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑

CGRP，AngⅡ和 MTT，購(gòu)自 Sigma公司;DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清，購(gòu)自Gibco公司;BCA Protein Assay Kit，購(gòu)自 HyClone-PIERCE Biotechnology公司;RAMP1(兔多克隆抗體)、CRLR(山羊多克隆抗體)一抗及Western blotting Luminol Reagent，均購(gòu)自Santa Cruz公司;β肌動(dòng)蛋白一抗(兔多克隆抗體)及二抗(HRP-兔抗山羊和HRP-山羊抗兔)，購(gòu)自博士德公司;無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒小提試劑盒，購(gòu)自百泰克;GenClean瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒和DNA快速連接試劑盒，均購(gòu)自上海捷瑞生物公司;LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染液和Trizol試劑，購(gòu)自Invitrogen公司;EcoRI和BamHI內(nèi)切酶、RevertAidTMFirst Stand cDNA Synthesis Kit，購(gòu)自Fermentas LIFE SCIENCES公司;通用PCR試劑，購(gòu)自上海生工生物工程有限公司;其他實(shí)驗(yàn)所需試劑均為分析純。

1.3 主要儀器

Mini PROTEANR 3 cell，美國(guó);凝膠成像系統(tǒng)(Alphalmager TM 2200，美國(guó))，Centrifuge5810/5810R型離心機(jī)，德國(guó);IX70型熒光倒置顯微鏡，日本;TRANS-BLOTR SD SEMI-DRY TRANSFER CELL，美國(guó);MyCyclerTM Thermal cycler，美國(guó)。

1.4 大鼠血管平滑肌細(xì)胞株A10細(xì)胞培養(yǎng)

A10購(gòu)自ATCC。常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，置于37℃ 5%CO2恒濕恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)滿后進(jìn)行傳代培養(yǎng)用于實(shí)驗(yàn)。

1.5 pCDNA3.1(+)-RAMP1 載體構(gòu)建

從A10細(xì)胞中提取總RNA進(jìn)行RT-PCR，獲取帶有酶切位點(diǎn)(EcoRⅠ和BamHⅠ)的RAMP1的開放閱讀框，再經(jīng)過酶切、連接、轉(zhuǎn)化至 E.coli DH5α中，挑單克隆經(jīng)初步鑒定后，送北京諾賽生物公司測(cè)序。

1.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A10細(xì)胞消化接種于24孔板中，每孔1×105個(gè)細(xì)胞，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%融合時(shí)，換成完全培養(yǎng)基進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前1 h用PBS洗2次，每孔加上500 μl opti-MEM培養(yǎng)基。按轉(zhuǎn)染試劑產(chǎn)品說明書提供的方法，用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000介導(dǎo)將帶有RAMP1的基因載體轉(zhuǎn)染入A10細(xì)胞，轉(zhuǎn)染4 h后換成10%FBS培養(yǎng)基，24 h后按1∶10比例進(jìn)行傳代，再常規(guī)培養(yǎng)24 h后各組加入500 μl G418500 mg·L－1進(jìn)行篩選，3 d更換1次篩選培養(yǎng)基。2周后可見克隆形成，將單克隆胰酶消化移至25 ml培養(yǎng)瓶中擴(kuò)大培養(yǎng)(G418250 mg·L－1)，凍存細(xì)胞。

1.7 細(xì)胞分組處理

取生長(zhǎng)良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的正常細(xì)胞(無(wú)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染)、僅轉(zhuǎn)染 pCDNA3.1(+)細(xì)胞〔pCDNA3.1(+)〕及轉(zhuǎn)染 pCDNA3.1(+)-RAMP1質(zhì)粒的細(xì)胞〔pCDNA3.1(+)-RAMP1〕，PBS 洗2 次，胰蛋白酶消化后，用含10%FBS的DMEM制成細(xì)胞懸液，接種于96孔板，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，更換為含0.1%FBS的DMEM培養(yǎng)24 h使細(xì)胞同步化，按照分組，3種細(xì)胞分別用AngⅡ 100 nmol·L－1、CGRP 100 nmol·L－1和CGRP(預(yù)處理30 min)+AngⅡ處理24 h。

1.8 MTT法檢測(cè)A10細(xì)胞存活率

取1.7 處理的細(xì)胞，PBS 洗3 次，加20 μl MTT 5 g·L－1處理4 h 后，加 DMSO 振蕩10 min，用酶聯(lián)免疫儀在波長(zhǎng)570 nm處讀取吸光度(absorbance，A)值，根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞存活率，存活率(%)=A處理組/A對(duì)照組×100%。

1.9 逆轉(zhuǎn)錄 PCR檢測(cè)RAMP1和CRLR mRNA水平

取1.7處理的細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA。細(xì)胞總RNA的提取按Trizol抽提試劑說明書進(jìn)行。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按RevertAidTMFirst Stand cDNA Synthesis Kit說明書進(jìn)行。PCR 反應(yīng)體系組成:9.5 μl ddH2O，12.5 μl 2 ×PCR Master，1 μl cDNA，上下游引物分別是:RAMP1為 5'-CGGGATCCACGGGGCTCTGCTTGCCATG-3'和5'-CCCGGAATTCCTACACGATGCCCTCTGTGCG-3';CRLR為5'-CAGCAGGAACCGAGTCAA-3'和5'-AGGCAGGAAGCAGAGGAA-3';β肌動(dòng)蛋白為5'-CACCCGCGAGTACAACCTTC-3'和5'-CCCATACCCACCATCACACC-3'。取各引物 1 μl(10 μmol·L－1)，混勻后，短速離心，按以下條件進(jìn)行反應(yīng):預(yù)變性94℃ 5 min，變性 94℃ 40s，退 火 40s(RAMP1:65℃，β肌動(dòng)蛋白:62℃，CRLR:62℃)，延伸72℃ 40 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。結(jié)束后，取產(chǎn)物5 μl，1.0%瓊脂糖凝膠電泳(80 V，40 min)，用灰度掃描目標(biāo)條帶的積分吸光度值(integrated absorbance，IA)與內(nèi)標(biāo)IA比值的半定量法分析目的基因的表達(dá)變化。

1.10 Western印跡法檢測(cè)RAMP1和CRLR蛋白水的水平

取1.7處理的細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白。用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，收集蛋白質(zhì)，采用BCA法測(cè)定細(xì)胞蛋白質(zhì)含量。蛋白質(zhì)變性后每孔上樣65 g，經(jīng)SDS-PAGE(RAMP1:12%;CRLR:10%，β肌動(dòng)蛋白:10%)電泳后，10 V，400 mA半干式電轉(zhuǎn)至PVDF膜上(RAMP1:10 V，20 min;CRLR:10 V，40 min;β 肌動(dòng)蛋白:10 V，25 min)。TBST(Tris·Cl 50 mmol·L－1，pH 7.6，NaCl 150 mmol·L－1，0.1%Tween 20)配制的5%脫脂牛奶室溫?fù)u床封閉1 h，加入一抗(RAMP1效價(jià)為1∶100;CRLR 為1∶200;β 肌動(dòng)蛋白為1∶1000)4℃孵育過夜，TBST洗膜4次(每次10 min)后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗(效價(jià)為1∶1000)或兔抗山羊二抗(1∶1000)，室溫下?lián)u床孵育2 h，TBST洗膜4次(每次15 min)，暗室中加發(fā)光劑A、B混液各200 μl于PVDF膜上激發(fā)熒光后壓片30 min后顯影、定影，洗片晾干后，用灰度掃描目標(biāo)條帶與內(nèi)標(biāo)IA比值的半定量法來分析靶蛋白表達(dá)的變化。

1.11 免疫熒光檢測(cè)RAMP1和CRLR的膜分布

取1.7處理的細(xì)胞，PBS洗3次(5 min×3);4%多聚甲醛室溫固定30 min后，PBS洗3次(5 min×3);0.1%TritonX-100處理 10 min后，PBS洗3次(5 min×3);5%BSA封閉1 h后，加入一抗〔RAMP1(1 ∶30);CRLR(1∶60)〕4℃過夜，PBS洗3次(5 min×3)，避光加入熒光標(biāo)記的熒光二抗〔FITC標(biāo)記的驢抗兔IgG(1∶20);TRITC標(biāo)記的驢抗山羊(1∶60)〕室溫下2 h后，PBS避光洗3次(5 min×3)。倒置熒光顯微鏡下觀察，RAMP1帶表現(xiàn)為綠色熒光，CRLR帶表現(xiàn)為紅色熒光。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染RAMP1細(xì)胞的鑒定

圖1A結(jié)果顯示，pCDNA3.1(+)-RAMP1轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中RAMP1 mRNA水平明顯高于無(wú)轉(zhuǎn)染的正常細(xì)胞和pCDNA3.1(+)轉(zhuǎn)染組細(xì)胞(P＜0.05)。圖1B 結(jié)果顯示，pCDNA3.1(+)-RAMP1組細(xì)胞中RAMP1蛋白水平高于正常細(xì)胞和pCDNA3.1(+)組(P＜0.05)。這表明用脂質(zhì)體能成功地將RAMP1基因轉(zhuǎn)染于A10細(xì)胞并能正常表達(dá)。

Fig.1 Determination of receptor activity modifying protein 1(RAMP1)gene expression by RT-PCR(A)and protein expression by Western blotting(B)in A10 cells.A2 and B2 were the semiquantitative result of A1 and B1，respectively.Lane 1:normal cells;lane 2:pCDNA3.1(+)cells;lane 3:pCDNA3.1(+)-RAMP1 cells.±s，n=3.*P＜0.05，compared with normal cells;#P＜0.05，compared with pCDNA3.1(+)cells.

2.2 高表達(dá)RAMP1對(duì)CGRP抑制AngⅡ誘導(dǎo)的A10細(xì)胞存活的影響

圖2 結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染對(duì)3種細(xì)胞的存活率無(wú)影響。但單獨(dú)用CGRP、AngⅡ處理細(xì)胞或兩者合并則能顯著增加3組細(xì)胞的存活率(P＜0.05)。CGRP處理使pCDNA3.1(+)-RAMP1細(xì)胞存活率明顯高于其他兩組細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，提示高表達(dá)RAMP1能增加CGRP對(duì)靜止期細(xì)胞的增殖活性;AngⅡ能增加3組細(xì)胞的存活率，但組間無(wú)明顯差異，說明 RAMP1高表達(dá)對(duì)AngⅡ引起的細(xì)胞存活率無(wú)影響;高表達(dá)RAMP1用CGRP預(yù)處理細(xì)胞30 min，再加入AngⅡ培養(yǎng)作用24 h，細(xì)胞存活率明顯低于單純AngⅡ處理組(P＜0.05)，說明高表達(dá)RAMP1能增強(qiáng)CGRP抑制AngⅡ誘導(dǎo)的A10細(xì)胞增殖作用。

2.3 高表達(dá)RAMP1對(duì)CRLR表達(dá)的影響

圖3結(jié)果顯示，正常細(xì)胞、pCDNA3.1(+)細(xì)胞和 pCDNA3.1(+)-RAMP1細(xì)胞經(jīng) AngⅡ和(或)CGRP處理24 h后，CRLR mRNA水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3A);無(wú)血清或AngⅡ?qū)?種細(xì)胞的CRLR蛋白表達(dá)無(wú)差異，單獨(dú)使用CGRP處理使RAMP1高表達(dá)組細(xì)胞中CRLR蛋白表達(dá)增加(P＜0.05)，而 RAMP1高表達(dá)組細(xì)胞用 CGRP預(yù)先處理30 min再加入AngⅡ處理24 h后，細(xì)胞CRLR蛋白表達(dá)低于其他兩組(P＜0.05)(圖3B)。

Fig.2 Effect of RAMP1 overexpression on A10 proliferation by MTT.Three kinds of cells were treated with AngⅡ，CGRP or CGRP+AngⅡfor 24 h .±s，n=5.*P＜0.05 ，＊＊P＜0.01，compared with the cells of control group;#P＜0.05，compared with corresponding pCDNA3.1(+)cells with the same treatment;△P＜0.05，compared with the cells of AngⅡtreated group.

Fig.3 Effect of RAMP1 overexpression on expression of CRLR gene(A)and protein(B)in A10 cell by RT-PCR(A)and Western blotting(B).A2 and B2 were semiquantitative result of A1 and B1，respectively.a:normal cells;b:pcDNA3.1(+)transfected cells;c:pcDNA3.1(+)-RAMP1 cells.Lane 1:normal control group;lane 2:CGRP group;lane 3:AngⅡ group;lane 4:CGRP+AngⅡgroup.±s，n=3.*P＜0.05 ，＊＊P＜0.01，compared with normal control group;#P＜0.05 ，compared with pCDNA3.1(+)cells with the same treatment;△P＜0.05，compared with AngⅡ group.

2.4 高表達(dá)RAMP1對(duì)CRLR在細(xì)胞膜上分布的影響

免疫熒光檢測(cè)RAMP1和CRLR的膜分布結(jié)果(圖4)顯示，使用無(wú)血清或CGRP后，正常細(xì)胞和pCDNA3.1(+)細(xì)胞中的兩種蛋白主要分布于胞核周圍的胞漿區(qū)域(圖4A，B:a1～a3，b1～b3)，而高表達(dá)RAMP1組細(xì)胞中RAMP1與CRLR在膜上分布增加(圖4A，B:c1～c3);單獨(dú)使用AngⅡ或聯(lián)合使用CGRP和AngⅡ處理的3種細(xì)胞，其RAMP1和CRLR在膜上都有分布(圖4C，D)，且高表達(dá)組細(xì)胞中RAMP1與CRLR在膜上分布(圖4C，D:c1～c3)多于正常細(xì)胞和空載體轉(zhuǎn)染組細(xì)胞，說明細(xì)胞高表達(dá)RAMP1能促進(jìn)CRLR向膜轉(zhuǎn)移。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，高表達(dá) RAMP1能增強(qiáng)CGRP抑制AngⅡ誘導(dǎo)的A10細(xì)胞增殖作用，其作用可能是通過增加CRLR的膜分布從而增強(qiáng)CGRP敏感性來實(shí)現(xiàn)。從本實(shí)驗(yàn)可以看出，靜止期細(xì)胞無(wú)論是否高表達(dá)RAMP1，細(xì)胞的存活率均無(wú)改變，但給予CGRP和(或)AngⅡ均能促使細(xì)胞增殖(存活率增加)，AngⅡ?qū)ξ崔D(zhuǎn)染的正常細(xì)胞、pCDNA3.1(+)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞或 pCDNA3.1(+)-RAMP1細(xì)胞的增殖作用最強(qiáng)，但3種細(xì)胞增殖率無(wú)差異;而在CGRP處理組細(xì)胞，高表達(dá)RAMP1組細(xì)胞的存活率卻顯著高于未轉(zhuǎn)染組和空載體組，這說明高表達(dá)RAMP1能增加對(duì)CGRP的應(yīng)答作用。

Fig.4 Distribution of RAMP1 and CRLR on normal A10 cell membrane(a1 －a3)，pCDNA3.1(+)transfected cells(b1 －b3)and pCDNA3.1(+)-RAMP1 cells(c1 －c3).A:normal control group;B:CGRP treated group;C:AngⅡtreated group;D:CGRP+AngⅡtreated group.

目前已明確CGRP受體活化是由RAMP1和CRLR介導(dǎo)的。CRLR主要以3種形式存在:即50 ku，66 ku和110 ku。但是，本實(shí)驗(yàn)只檢測(cè)到了CRLR的66 ku和50 ku形式，而并沒有檢測(cè)到110 ku的二聚體形式。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，無(wú)論是在正常細(xì)胞、pCDNA3.1(+)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞或 pCDNA3.1(+)-RAMP1細(xì)胞，無(wú)論有無(wú)CGRP和(或)AngⅡ處理，各組細(xì)胞的中CRLR mRNA水平?jīng)]有變化，但是經(jīng)CGRP和(或)AngⅡ處理的3種細(xì)胞CRLR(66 ku)的蛋白表達(dá)水平與未經(jīng)CGRP或AngⅡ處理的細(xì)胞卻顯著增加，說明CGRP或AngⅡ能增加細(xì)胞CRLR的表達(dá)。但是CRLR蛋白之間的變化并不是因?yàn)楦弑磉_(dá)RAMP1所引起的，而可能是由于CGRP或AngⅡ引起細(xì)胞增殖導(dǎo)致的，這一推測(cè)已在其他研究中得到證實(shí)[7]。本實(shí)驗(yàn)室前期結(jié)果也表明，RAMP1高表達(dá)可延長(zhǎng)CGRP和AngⅡ誘導(dǎo)的VSMC的倍增時(shí)間[8]。對(duì)上述現(xiàn)象的解釋，Cueille等[9]認(rèn)為可能與CRLR基因啟動(dòng)子序列中的一個(gè)反式作用元件低氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxiainducible factor-1 alpha，HIF-1α)表達(dá)增加有關(guān)，認(rèn)為HIF-1α表達(dá)增加加強(qiáng)了CRLR的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)，進(jìn)而使CRLR蛋白表達(dá)水平升高，CRLR的啟動(dòng)子序列中除了包含HIF-1α的順式作用元件外，還有Sp-1、Pit-1和糖皮質(zhì)激素結(jié)合位點(diǎn)[10]。所以猜想該實(shí)驗(yàn)結(jié)果很有可能是CGRP或AngⅡ增加了CRLR啟動(dòng)子序列中某個(gè)調(diào)節(jié)元件的表達(dá)，從而加強(qiáng)了CRLR的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)，使CRLR蛋白表達(dá)水平升高。另外，在本實(shí)驗(yàn)中需要說明的是，在聯(lián)合使用CGRP和AngⅡ后，RAMP1高表達(dá)細(xì)胞的CRLR(66 ku)蛋白表達(dá)水平低于未轉(zhuǎn)染的正常細(xì)胞和空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞;而單獨(dú)使用CGRP處理后，高表達(dá)RAMP1細(xì)胞的CRLR(66 ku)蛋白表達(dá)水平高于未轉(zhuǎn)染組和空載體組;這表明在靜止期細(xì)胞，CGRP能通過增加CRLR的表達(dá)增加細(xì)胞的生存率，而在CGRP預(yù)處理細(xì)胞能抑制細(xì)胞的增殖，使單位體積細(xì)胞的數(shù)量減少，從而高表達(dá) RAMP1細(xì)胞的CRLR(66 ku)蛋白總體水平降低，但這并不能說明單個(gè)細(xì)胞CRLR的表達(dá)降低。

本實(shí)驗(yàn)的免疫熒光結(jié)果顯示，在無(wú)血清和CGRP處理因素的條件下，未轉(zhuǎn)染組和空載體組細(xì)胞中的RAMP1和CRLR大多分布于胞核周圍的胞漿區(qū)域，而高表達(dá)組中的這兩個(gè)蛋白在膜上的分布增加;單獨(dú)使用AngⅡ或聯(lián)合使用CGRP的3種細(xì)胞，其兩種蛋白都趨向于膜上分布，尤其在高表達(dá)組中，這種趨勢(shì)更加明顯。這一結(jié)果表明高表達(dá)RAMP1增強(qiáng)CGRP的抗增殖作用可能是通過增加CRLR膜分布，從而增強(qiáng)CGRP受體對(duì)CGRP的敏感性起作用。

RAMP1促進(jìn)CRLR的膜分布的機(jī)制還不完全清楚。已證實(shí)，血管平滑肌細(xì)胞中存在CRLR和3種 RAMP[11]，即 RAMP1，RAMP2 和 RAMP3，3 種亞型之間與CRLR結(jié)合存在競(jìng)爭(zhēng)。所以當(dāng)RAMP1表達(dá)增加時(shí)，可能增加了RAMP1與CRLR結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)力，加強(qiáng)了對(duì)CGRP的應(yīng)答作用。除此之外，Héroux等[12]用雙分子熒光互補(bǔ)和化學(xué)發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移等技術(shù)證實(shí):RAMP1和CRLR都能形成同源二聚體存在與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。但是，只有當(dāng)一分子的RAMP1與CRLR的同源二聚體形成異源三聚體時(shí)，才能被轉(zhuǎn)運(yùn)至胞膜上。另外，RAMP1也存在同源二聚體形式，其功能不清。推測(cè)RAMP1·RAMP1在調(diào)節(jié)功能型CGRP受體形成方面起重要作用;其次，RAMP1同源二聚體主要分布于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分泌蛋白，如VIP36和ERGIC-53，能以同源二聚體的形式轉(zhuǎn)運(yùn)其他蛋白，RAMP1與這些分泌蛋白有著相同的膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)[13－14]，提示同源二聚體RAMP1可能與轉(zhuǎn)運(yùn)CRLR到細(xì)胞膜有關(guān)。總之，弄清RAMP1調(diào)節(jié)CGRP受體活化機(jī)制對(duì)發(fā)現(xiàn)心血管藥物的作用靶點(diǎn)有重要意義。

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