橄欖葉提取物對實(shí)驗(yàn)性兔關(guān)節(jié)軟骨損傷的修復(fù)作用

宮德正，耿成燕，姜麗平，王麗輝，吉村寬辛，仲來福

(大連醫(yī)科大學(xué)1.機(jī)能學(xué)實(shí)驗(yàn)室，2.中日合作醫(yī)藥科學(xué)研究所，3.病理學(xué)教研室，遼寧大連 116044，4.Eisai Food ＆ Chemical Co.，Ltd.，Nihonbashi，Chuo-ku，Tokyo103-0027，Japan)

齊敦果(Olea earopaea)屬木科(oleaceae)，常綠闊葉喬木，又名洋橄欖或油橄欖。歐洲原產(chǎn)，我國引種，多栽培于長江以南。橄欖葉提取物(olive leaves extract，OLE)是從橄欖葉中提取的天然酚類物質(zhì)，具有非常強(qiáng)的抗氧化[1]和抗動脈粥樣硬化[2]作用，并可預(yù)防癌癥[3]。據(jù)報(bào)道，橄欖葉具有降血壓和抗微生物等作用[4]。有文獻(xiàn)報(bào)道，榨橄欖時所產(chǎn)生的橄欖汁能明顯降低脂多糖處理BALB/c小鼠血清腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factorα，TNF-α)水平，也能明顯降低脂多糖處理人單核細(xì)胞THP-1細(xì)胞TNF-α的分泌，認(rèn)為橄欖汁可能是一種治療炎癥的有效成分，如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和骨關(guān)節(jié)炎[5]。OLE是否對關(guān)節(jié)軟骨損傷有修復(fù)作用目前國內(nèi)外尚無文獻(xiàn)報(bào)道。本研究通過對兔左后膝關(guān)節(jié)軟骨手工鉆洞制備兔關(guān)節(jié)軟骨損傷模型，觀察OLE對關(guān)節(jié)軟骨損傷的修復(fù)作用。

1 材料與方法

1.1 藥物和主要試劑

OLE由日本Eisai食品與化學(xué)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)時用水溶解。其主要組成包括22%羥基酪醇，4%多酚，67%糖類，2%脂質(zhì)，4%強(qiáng)熱殘留物和1%水。番紅O和阿爾辛藍(lán)購自Sigma公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物和分組

12只健康新西蘭白兔，16周齡，體質(zhì)量2.00～2.55 kg，由大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，動物許可證號:SCXK(遼)2002-0002。用前檢疫1周，單籠飼養(yǎng)，隨機(jī)分為模型對照組和OLE治療組，每組6只，雌雄各半。將OLE用蒸餾水溶解，OLE治療組按照成年兔每天120 ml·kg－1飲水量自由飲水足量給予 OLE 500 mg·kg－1，連續(xù) 21 d;模型對照組給予等體積蒸餾水。動物室溫度保持在23～25℃，相對濕度50%～60%，每天 12 h光照。

1.3 動物模型制備

靜脈給予戊巴比妥鈉40 mg·kg－1給兔實(shí)施麻醉，在兔左后膝關(guān)節(jié)處剪毛，用0.05%氯己定和75%乙醇消毒。在靠近膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)面，從股骨向脛骨結(jié)節(jié)方向做一個垂直的皮膚切口。切開關(guān)節(jié)囊，通過人工脫臼的方法，把髕骨推向前側(cè)面，充分暴露膝關(guān)節(jié)的軟骨。用手鉆在關(guān)節(jié)軟骨上打直徑3 mm、深4 mm的3個洞。1個在滑車嵴中間，另2個在股骨末梢的滑車槽上。然后用生理鹽水沖洗傷口和關(guān)節(jié)囊。關(guān)節(jié)囊用人工可吸收(3-0)縫合線縫合，同時皮下組織和皮膚用尼龍線(3-0)縫合。手術(shù)后1周內(nèi)用聚維酮碘(聚乙烯吡咯烷酮碘)對傷口消毒，每天1次;用鹽酸土霉素10 mg·kg－1肌內(nèi)注射抗感染，每天2次。

1.4 兔軟骨損傷部位的肉眼觀察

實(shí)驗(yàn)期間，每天觀察兔腹瀉和飲食情況及皮毛顏色，每周測體質(zhì)量1次。手術(shù)后3周，iv給予戊巴比妥鈉80 mg·kg－1，實(shí)施安樂死。打開膝關(guān)節(jié)后，用單盲法肉眼觀察3個損傷部位(洞)軟骨的愈合情況。手術(shù)洞愈合的程度進(jìn)行如下評分:愈合＜50%，計(jì)為0分，50%～60%計(jì)為1分，60%～80%愈合計(jì)為2分，80%～100%愈合計(jì)為3分，然后計(jì)算總評分[6]。同時觀察關(guān)節(jié)囊里滑液量和混濁度。當(dāng)關(guān)節(jié)滑液有以細(xì)胞為內(nèi)容物增加時進(jìn)行涂片染色和瓊脂培養(yǎng)。

1.5 兔關(guān)節(jié)軟骨組織病理學(xué)檢查

兔安樂死后，取手術(shù)側(cè)膝關(guān)節(jié)用10%甲醛固定，固定后切片，厚5 mm，用5%醋酸振搖1 d脫鈣，脫鈣后用中性5%硫化鈉浸泡1 d，然后進(jìn)行石蠟包埋，切片，厚5 μm。HE染色進(jìn)行組織學(xué)檢查。用單盲法光鏡下觀察3個損傷部位(洞)軟骨的再生情況。手術(shù)洞軟骨再生的程度進(jìn)行如下評分:無軟骨缺失(損傷部位全部由再生軟骨填充)計(jì)為0分;局限性缺失計(jì)為1～2分;較大范圍軟骨缺失計(jì)為3分;全面的軟骨缺失計(jì)為4分，然后計(jì)算總評分[7]。

1.6 兔關(guān)節(jié)軟骨蛋白聚糖(proteoglycan，PG)和糖胺聚糖(glycosaminoglycan，GAG)合成的測定

同1.5方法取手術(shù)側(cè)膝關(guān)節(jié)，制備石蠟切片，用番紅O和阿爾辛藍(lán)染色。番紅O染色所形成的紅色代表PG，阿爾辛藍(lán)染色所形成的藍(lán)色代表GAG[8]。把用番紅O和阿爾辛藍(lán)染色關(guān)節(jié)軟骨損傷部位和正常無損傷部位的圖片通過彩色數(shù)碼相機(jī)輸入電腦并通過Image-pro plus 4.5(Media Cybernetics)把影像數(shù)字化。隨機(jī)選取6個區(qū)域，通過影像處理技術(shù)計(jì)算每個區(qū)域番紅O染色形成的紅色平均光密度和阿爾辛藍(lán)染色形成的藍(lán)色平均光密度，分別代表關(guān)節(jié)軟骨 PG和GAG的合成量[8]。

1.7 兔股二頭肌和股內(nèi)側(cè)大收肌肌肉質(zhì)量比率的測定

兔安樂死后，分別取出手術(shù)側(cè)和無手術(shù)側(cè)股二頭肌和股內(nèi)側(cè)的大收肌，稱重。肌肉質(zhì)量的比率(%)=手術(shù)側(cè)肌肉質(zhì)量/無手術(shù)側(cè)肌肉質(zhì)量 ×100%。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 橄欖葉提取物對兔身體狀況的影響

兩組兔在實(shí)驗(yàn)期間體質(zhì)量無差異(表1)，飲食正常，皮毛光亮，無腹瀉。兩組兔手術(shù)側(cè)膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)囊內(nèi)滑液清亮，滑液量無差異。表明OLE無毒性作用，兔無感染。

Tab.1 Effect of olive leaves extract(OLE)on body mass of rabbits with experimental cartilage injuries

2.2 橄欖葉提取物對兔軟骨損傷愈合的影響

人工制備兔左膝關(guān)節(jié)軟骨損傷，肉眼觀察結(jié)果表明，手術(shù)3周后，OLE治療組3個洞的愈合評分和總評分均明顯高于模型對照組(P＜0.05)(表2)，表明OLE能促進(jìn)損傷關(guān)節(jié)軟骨的愈合。

2.3 橄欖葉提取物對兔軟骨損傷后軟骨再生的影響

組織病理學(xué)檢查結(jié)果表明，模型對照組軟骨損傷部位缺乏新生軟骨，并有毛細(xì)血管增生和纖維原細(xì)胞增殖，在大部分部位無新生的軟骨組織(圖1A)。OLE治療組損傷部位成熟軟骨組織和連接組織混合再生，或大量成熟的軟骨組織在損傷部位再生，再生的軟骨組織周圍被增殖的纖維軟骨細(xì)胞所環(huán)繞(圖1B)。在3個損傷部位(洞)均隨機(jī)選取6個區(qū)域并對軟骨損傷后軟骨再生情況進(jìn)行組織學(xué)評分，模型對照組為 17.3±3.0，OLE 治療組為8.7±0.6，OLE治療組明顯低于模型對照組(P＜0.05)，表明OLE具有促進(jìn)軟骨損傷后軟骨組織再生的作用。

Tab.2 Effect of OLE on healing degree of holes at operated sites of rabbits with experimental cartilage injuries

Fig.1 Effect of OLE on cartilage regeneration of rabbits with experimental cartilage injuries(HE ×200).See Tab.1 for rabbit treatment.A:model control;B:OLE 50 mg·kg －1.Arrows show regenerated cartilage tissue.

2.4 橄欖葉提取物對兔軟骨損傷后軟骨基質(zhì)PG和GAG合成的影響

由圖2A，B和表3可見，OLE治療組軟骨損傷部位(黑色箭頭所指)番紅O染色的平均光密度比模型對照組高(P＜0.05);正常軟骨無損傷部位(綠色箭頭所指)番紅O染色的平均光密度與模型對照組比較無明顯變化。表明OLE能促進(jìn)軟骨損傷修復(fù)部位軟骨基質(zhì)中PG的合成。

由圖2C，D和表3可見，OLE治療組軟骨損傷部位(黃色箭頭所指)和正常軟骨無損傷部位(粉色箭頭所指)阿爾辛藍(lán)染色的平均光密度與模型對照組比較無顯著性差異。

Fig.2 Effect of OLE on cartilage matrix formation of rabbits with experimental cartilage injuries(×200).See Tab.1 for rabbit treatment.Green arrow:safranin O staining of normal cartilage area for PG;black arrow:safranin O staining of restored area for PG;yellow arrow:alcian blue staining of restored area for GAG;pink arrow:alcian blue staining of normal cartilage area for GAG.A and C:model group;B and D:OLE 50 mg·kg －1.A and B:safranin O staining;C and D:Alcian blue staining.

2.5 橄欖葉提取物對軟骨損傷后兔肌肉質(zhì)量比率的影響

由表4可見，OLE治療組股內(nèi)側(cè)大收肌質(zhì)量比率與模型對照組比較無明顯變化;股二頭肌質(zhì)量比率較模型對照組升高(P＜0.05)，提示OLE具有抗炎鎮(zhèn)痛作用，可維持膝關(guān)節(jié)運(yùn)動功能，防止肌肉廢用性萎縮。

Tab.3 Effect of OLE on proteoglycan(PG)and glycosaminoglycan(GAG)synthesis in cartilage matrix formation of rabbits with experimental cartilage injuries

Tab.4 Effect of OLE on mass of lateral great and biceps femoris muscle of rabbits with experimental cartilage injuries

3 討論

本研究結(jié)果表明，通過自由飲水給予兔OLE 500 mg·kg－1，連續(xù)21 d，能明顯促進(jìn)實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)軟骨損傷的修復(fù)。實(shí)驗(yàn)期間飲食情況正常，皮毛光亮，無腹瀉，兩組兔體質(zhì)量無差異。表明該劑量對兔無毒副作用，該結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致[9]。

肉眼觀察結(jié)果表明，OLE治療組軟骨損傷部位的愈合比模型對照組更為顯著。組織學(xué)檢查結(jié)果表明，OLE治療組在軟骨損傷部位不僅有大量再生的成熟軟骨組織，而且再生的軟骨組織周圍環(huán)繞大量增殖的未分化的軟骨胚胎細(xì)胞。模型對照組在軟骨損傷部位幾乎看不見再生的軟骨，僅有大量再生的纖維組織。表明OLE具有促進(jìn)軟骨損傷修復(fù)的作用。

正常關(guān)節(jié)軟骨由軟骨基質(zhì)和鑲嵌在軟骨基質(zhì)陷窩內(nèi)的軟骨細(xì)胞組成，軟骨細(xì)胞只占1%，軟骨基質(zhì)占99%。軟骨的基質(zhì)由膠原纖維、PG和水構(gòu)成，其中膠原纖維占20%～25%，PG占5%～10%，水占70%～75%。PG主要由GAG和蛋白組成，PG鑲嵌于膠原纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中，形成了水合性極強(qiáng)的黏稠膠體，使軟骨堅(jiān)硬而富有彈性[10]。隨著年齡的增長或者軟骨遭到破壞時，軟骨細(xì)胞不能有效合成PG，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)損傷和骨性關(guān)節(jié)炎[11]。為了探討OLE對關(guān)節(jié)軟骨損傷修復(fù)的可能機(jī)制，本研究應(yīng)用番紅O染色在軟骨組織切片上對PG進(jìn)行半定量分析，以反映軟骨基質(zhì)的變化，發(fā)現(xiàn)OLE治療組關(guān)節(jié)軟骨損傷修復(fù)部位軟骨基質(zhì)中PG與模型對照組比較明顯增加，正常無軟骨損傷部位軟骨基質(zhì)中PG與模型對照組比較無明顯變化。表明OLE能明顯促進(jìn)軟骨損傷修復(fù)部位軟骨基質(zhì)中PG的合成。用阿爾辛藍(lán)染色結(jié)果表明，OLE治療組軟骨損傷修復(fù)部位GAG合成與模型對照組比較無明顯變化，可能與GAG參與PG的合成有關(guān)。

本研究集體已研究報(bào)道，OLE具有抗炎和鎮(zhèn)痛作用，其作用機(jī)制可能與抑制TNF-α和白細(xì)胞介素1 mRNA的表達(dá)有關(guān)[12]。本研究結(jié)果表明，OLE可預(yù)防肌肉萎縮，考慮與其抗炎鎮(zhèn)痛作用和增加PG合成有關(guān)。股內(nèi)側(cè)大收肌和股二頭肌與肢體運(yùn)動相關(guān)。大收肌司職膝關(guān)節(jié)的伸展運(yùn)動，膝關(guān)節(jié)伸展為了減輕疼痛。股二頭肌司職膝關(guān)節(jié)彎曲運(yùn)動。當(dāng)膝關(guān)節(jié)彎曲時，髕骨強(qiáng)烈壓在關(guān)節(jié)滑車上，可引起劇烈疼痛導(dǎo)致股二頭肌廢用性萎縮，關(guān)節(jié)軟骨損傷恢復(fù)被延遲。OLE可能具有抗炎鎮(zhèn)痛作用，避免因膝關(guān)節(jié)彎曲引起劇痛導(dǎo)致股二頭肌廢用性萎縮，間接促進(jìn)軟骨損傷的修復(fù)。

綜上所述，OLE能夠促進(jìn)人工關(guān)節(jié)軟骨損傷的修復(fù)并增加關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)中PG的合成。OLE對關(guān)節(jié)軟骨損傷和骨性關(guān)節(jié)炎等疾病可能具有預(yù)防和治療作用。

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