乳腺癌中C-erbB-2的表達(dá)及其與Ki-67的關(guān)系

翟雨佳 閆閃閃

人表皮生長(zhǎng)因子2(C-erbB-2/HER-2/neu)是公認(rèn)的乳腺癌標(biāo)記物，也是指導(dǎo)臨床使用赫賽汀的惟一指標(biāo)，Ki-67是一種在增殖細(xì)胞中表達(dá)的核抗原，是腫瘤增殖活性最重要的檢測(cè)指標(biāo)［1，2］。本文用免疫組化(immunohistochemistry，IHC) 法檢測(cè)95例患者C-erbB-2和Ki-67蛋白的表達(dá)情況，探討乳腺癌中兩種蛋白表達(dá)的相關(guān)性及臨床意義。

1 資料與方法

1．1 一般資料 收集我院2007年11月至2011年臨床病理資料完整的乳腺癌病例95例，患者均為女性;年齡20～88歲，平均年齡53．1歲，中位年齡54歲。術(shù)前未行任何輔助治療(化療、內(nèi)分泌治療、放療)，其中浸潤(rùn)性小葉癌4例，黏液癌7例，浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌84例。

1．2 試劑 鼠抗人C-erbB-2單克隆抗體(即用型)、鼠抗人Ki-67單克隆抗體(即用型)及免疫組化試劑盒均購(gòu)自北京中杉金橋公司。

1．3 免疫組化

1．3．1 操作步驟:采用EnVision法檢測(cè)C-erbB-2，10%中性甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋切片(厚度4 μm)，貼于涂有多聚賴氨酸的玻片上，常規(guī)脫蠟至水，0．3%過氧化氫甲醇溶液滅活內(nèi)源性過氧化物酶，高溫高壓修復(fù)抗原，其余步驟按試劑盒說明操作，用已知陽(yáng)性切片作陽(yáng)性對(duì)照，磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作陰性對(duì)照。

1．3．2 結(jié)果判讀:C-erbB-2蛋白的表達(dá)定位在細(xì)胞膜，無(wú)著色為(－)，任何比例的浸潤(rùn)癌細(xì)胞呈現(xiàn)微弱、不完整的細(xì)胞膜著色為(+)，＞10%的浸潤(rùn)癌細(xì)胞呈現(xiàn)弱至中等強(qiáng)度、完整但不均勻的細(xì)胞膜棕黃著色或≤30%的浸潤(rùn)癌細(xì)胞呈現(xiàn)強(qiáng)且完整的細(xì)胞膜棕褐著色為(++)，＞30%的浸潤(rùn)癌細(xì)胞呈現(xiàn)強(qiáng)的完整的細(xì)胞膜棕褐著色為(+++)［1］;Ki-67陽(yáng)性為胞核著色，≤5%者為(－);陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)6% ～25%者為(+);26% ～50%者為(++);＞50%者為(+++)。

1．4 隨訪調(diào)查 對(duì)95例乳腺癌患者進(jìn)行術(shù)后隨訪調(diào)查，記錄其手術(shù)日期、當(dāng)前身體狀況或死亡日期。

1．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 17．0統(tǒng)計(jì)軟件，C-erbB-2和Ki-67與臨床病理相關(guān)因素相關(guān)性的比較采用χ2檢驗(yàn)，生存曲線用Log-rank檢驗(yàn)，生存分析用COX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 C-erbB-2蛋白在乳腺癌組織中的表達(dá) C-erbB-2蛋白的表達(dá)(－)的35例，(+)的32例，(++)11例，(+++)的17例。見表1，圖1～3。

2．2 Ki-67在乳腺癌組織中的表達(dá) Ki-67蛋白表達(dá)(－)的12例，(+)的20例，(++)的42例，(+++)的21例。見表1、圖4 ～6。

2．3 C-erbB-2、Ki67蛋白表達(dá)與臨床病理因素關(guān)系 C-erbB-2和Ki-67與腫瘤大小及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)，而與年齡、病理分級(jí)和組織學(xué)分類差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0．05)。見表1。

表1 癌組織中C-erbB-2和Ki-67蛋白表達(dá)與臨床病理因素關(guān)系 n=95，例

圖1 C-erbB-2蛋白在乳腺癌組織中+表達(dá)(免疫組化×200)

圖2 C-erbB-2蛋白在乳腺癌組織中++表達(dá)(免疫組化×200)

圖3 C-erbB-2蛋白在乳腺癌組織中+++表達(dá)(免疫組化×400)

2．4 C-erbB-2和Ki-67蛋白表達(dá)的相關(guān)性 C-erbB－2蛋白表達(dá)(－)的Ki-67(+)8例，(++)的20例，(+++)的為4例;C-erbB-2蛋白表達(dá)(+)的 Ki-67(+)7例，(++)的11例，(+++)的為9例;C-erbB-2蛋白表達(dá)(++)的 Ki-67(+)1例，(++)的4例，(+++)的為4例;C-erbB-2蛋白表達(dá)(+++)的Ki-67(+)4例，(++)的7例，(+++)的為4例。2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．01)。見表2。

表2 乳腺癌組織中C-erbB-2和Ki-67蛋白關(guān)系的表達(dá) 例

圖4 Ki-67在乳腺癌組織中+表達(dá)(免疫組化×400)

圖5 Ki-67在乳腺癌組織中++表達(dá)(免疫組化×200)

圖6 Ki-67在乳腺癌組織中+++表達(dá)(免疫組化×400)

2．5 隨訪結(jié)果 95例隨訪結(jié)果:生存時(shí)間中位數(shù)29(5～59)個(gè)月;生存 78例，死亡或失訪 17例。用 Log-rank檢驗(yàn)分析C-erbB-2和Ki-67蛋白表達(dá)的生存曲線表明:陰性者生存曲線高，5年無(wú)瘤生存率明顯高于陽(yáng)性患者者(P＜0．05)。通過Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析，結(jié)果顯示在臨床相關(guān)指標(biāo)中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否和Ki-67、C-erbB-2蛋白是影響無(wú)瘤生存時(shí)間的危險(xiǎn)因素。見表3。

表3 Cox回歸模型篩選的無(wú)瘤生存時(shí)間危險(xiǎn)因素及參數(shù)估計(jì)

3 討論

人表皮生長(zhǎng)因子2(human epidermal growth factor re-ceptor，HER-2/neu)是定位于人染色體17q12-21．3的癌基因，其蛋白(C-erbB-2)主要定位于細(xì)胞膜，是一種具有酪氨酸激酶活性的細(xì)胞膜受體，主要參與細(xì)胞生長(zhǎng)的調(diào)控，促進(jìn)腫瘤增殖及分化，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［2］。本實(shí)驗(yàn)的95例中有28例發(fā)生了C-erbB-2的過表達(dá)(29．5%)，這與之前文獻(xiàn)報(bào)道的(20% ～30%)［3］相一致，進(jìn)一步證明C-erbB-2的表達(dá)在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用。目前，國(guó)內(nèi)外很多學(xué)者對(duì)乳腺癌組織中C-erbB-2的表達(dá)與臨床病理因素的相關(guān)性進(jìn)行了研究，結(jié)果不盡相同［4］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在諸多臨床相關(guān)病理因素中，C-erbB-2與腫瘤大小和是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P＜0．05)。理論認(rèn)為C-erbB-2參與細(xì)胞增殖及凋亡基因的調(diào)控，可以誘導(dǎo)細(xì)胞周蛋白D1表達(dá)增強(qiáng)，促進(jìn)G1/S期進(jìn)程，并且上調(diào)人端粒末端轉(zhuǎn)移酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)，導(dǎo)致細(xì)胞端粒末端轉(zhuǎn)移酶異常活化，使細(xì)胞轉(zhuǎn)化并發(fā)生單克隆增生，形成腫瘤;還可通過Ras/MAPK途徑激活Smad7的啟動(dòng)子使其高表達(dá)，干擾細(xì)胞的凋亡途徑使細(xì)胞永久增殖［5，6］。本實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤相對(duì)大者，Cerb-B-2蛋白的高表達(dá)比率高，進(jìn)一步證實(shí)了C-erbB-2在細(xì)胞增殖和逃避凋亡中的作用，但這一結(jié)果與Azizun等［6］的研究結(jié)論存在差異。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中C-erbB-2與淋巴結(jié)的關(guān)系我們考慮可能是C-erbB-2能夠通過激活血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)啟動(dòng)子增加VEGF在mRNA和蛋白水平的表達(dá)，而VEGF參與血管的生成，這在腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過程中起了非常重要的作用，但這僅僅是從單一方面解釋了這一結(jié)果的可能性，如果闡述詳盡準(zhǔn)確的發(fā)生機(jī)制還需要更深入的研究。同時(shí)對(duì)本實(shí)驗(yàn)預(yù)后數(shù)據(jù)的生存分析表明:C-erbB-2陽(yáng)性表達(dá)的患者無(wú)瘤生存率低于陰性患者，即C-erbB-2過表達(dá)的患者無(wú)瘤生存期短，預(yù)后相對(duì)較差。同時(shí)COX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型顯示:淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否及C-erbB-2蛋白是影響患者無(wú)瘤生存時(shí)間的危險(xiǎn)因素(P＜0．05)。那么綜合實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)各種因素，我們可以得出結(jié)論:C-erbB-2及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移可以做為判斷患者預(yù)后的重要指標(biāo)。

Ki-67是反映細(xì)胞增殖指數(shù)的指標(biāo)，由Gerdes等［7］于1991年作為非組蛋白的核蛋白鑒定出來，抗原表達(dá)在細(xì)胞核，在靜息細(xì)胞缺乏而腫瘤增殖細(xì)胞的各期均有表達(dá)［8］，是檢測(cè)腫瘤細(xì)胞增殖活性最為可靠的指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)中83例Ki-67有不同程度的增殖，增殖指數(shù)同患者腫瘤大小及是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，腫瘤大者和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，其Ki-67增殖指數(shù)高，而在不同的病理分級(jí)及組織學(xué)分類中其增殖表達(dá)沒有規(guī)律性，統(tǒng)計(jì)學(xué)顯示無(wú)差異，這同李寶江等［9，10］研究結(jié)果相同。對(duì)患者預(yù)后的生存分析及無(wú)瘤生存時(shí)間的危險(xiǎn)因素統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示:Ki-67是影響患者無(wú)瘤生存時(shí)間的危險(xiǎn)因素，其增殖指數(shù)高患者的生存時(shí)間短。同樣這一結(jié)果同C-erbB-2的表達(dá)結(jié)果呈正相關(guān)，即C-erbB-2表達(dá)越強(qiáng)，Ki-67增殖指數(shù)越高，且患者的預(yù)后差，術(shù)后生存時(shí)間短，這同Trihia等［11］研究結(jié)果一致。

1《乳腺癌HER-2檢測(cè)指南2009版》編寫組．乳腺癌HER-2檢測(cè)指南(2009 版)．中華病理學(xué)雜志，2009，38:836-840．

2 Molina R，Jo J，F(xiàn)ilella X，et al．Mucin-1ike carcinoma associated antigen(MCA)in tissue and serum of patients with breast cancer:Clinical applications in prognosis and disease monitoring．Cancer Res，1994，32:89-95．

3 Lah T，Cercek M，Kos J，et al．Epidermal growth factor receptor(EGFR)，Her-2/Neu and cathepsins D．B and L as possible prognostic factors in breast carcinoma．Br Cancer Res Treat，1996，41:249-254．

4 Goueli BS，Janknecht R．Upregulation of the catalytic telomerase subunit by the transcription factor ER81 and oncogenic HER2/Neu，Ras，or Raf．Mol Cell Biol，2004，24:25-35．

5 Dowdy SC，Mariani A，Janknecht R．HER2/neu and TAKl-mediated up-regulation of the transforming growth factor beta-inhibitor Smad7 via the ETS protein ER81．J Biol Chem，2003，278:44377-44384．

6 Azizun N，Bhurgri Y，Raza F，et al．Comparison of ER．PR and HER-2/neu(C-crbB-2)reactivity pattern with histologic grade，tumor size and lymph node status in breast cancer．Asia Pac J Caner Prev，2008，9:553-556．

7 Gerdes J，Lj L，Schlueter C，et al．Immunobiochemical and molecular bio-logic characterization of the cell proliferation-associated nuclear antigen that is defined by monoclonal antibody Ki-67．Am J Pathol，1991，138:867-873．

8 Umuticoechea A，Smith IE，Dowsett M，et al．Proliferation marker Ki-67 in early breast cancer．Cancer，2005，23:72122-7220．

9 李寶江，朱志華，王軍業(yè)，等．Ki-67，P53，VEGF和C-erbB-2在乳腺癌組織中表達(dá)的相關(guān)性研究及其臨床意義．癌癥，2004，23:1176-1179．

10 Bhatavdeker JM，Patel DD，Shah NG，et al．Prognostic significance of mmunohislochemically localized binmarkers in stageⅡand stageⅢbreast cancer:a multivariate analysis．Ann Surge Oncol，2000，7:305．

11 Trihia H，Murray S，Price K，et al．Ki-67 expression in breast carcinoma:Its association with grading systems，clinical paraneters，and other prognostic factors-a surrogate marker．Cancer，2003，97:1321-1331．