Beta-adducin（Add2）基因rs3755351多態(tài)性與高血壓遺傳易感的相關(guān)性研究

耿啟彬 李媛媛 李紅 楊學(xué)習(xí)

高血壓（hypertension）是一種以動脈血壓持續(xù)升高為主要表現(xiàn)的慢性疾病，常引起心、腦、腎等重要器官的病變。50年來我國高血壓患病率呈明顯上升趨勢,目前約有2億高血壓患者，每10個成年人中約有2人患高血壓[1]。由于部分高血壓患者并無明顯的臨床癥狀，又被稱為人類健康的“無形殺手”，因此提高對高血壓病的認(rèn)識，早期預(yù)防、及時治療有極其重要的意義。

內(nèi)收蛋白（adducin，ADD）是一種細(xì)胞膜骨架蛋白，由α、β和γ三個亞單位組成異源二聚體。ADD不僅是細(xì)胞膜骨架的主要組成成分，而且還參與細(xì)胞信號傳導(dǎo)及細(xì)胞膜離子轉(zhuǎn)運(yùn)，尤其與多種鈉離子的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)理密切相關(guān)。在高鹽攝入與高血壓之間存在的因果關(guān)系中，ADD是候選基因之一。在Milan高血壓大鼠模型和人類中的平行研究表明ADD可通過增強(qiáng)組成型的腎小管對鈉的重吸收來造成高血 壓[2]。β-adducin共 有 64種 SNP[3]，rs3755351是ADD2基因內(nèi)含子上一個A＞C變異位點(diǎn)。Kato等[4]通過對高血壓的三層次、高密度的關(guān)聯(lián)分析，從80 795個SNP位點(diǎn)中篩選出了9個與高血壓易感有關(guān)的位點(diǎn)，其中rs3755351位點(diǎn)與高血壓的易感有最顯著的相關(guān)性（P= 1.7×10-5）。但目前ADD2 基因多態(tài)性與高血壓遺傳易感性特別是與發(fā)病風(fēng)險的相關(guān)性研究還較少，也缺乏中國人群的研究數(shù)據(jù)。本研究采用病例-對照研究來探討福建和廣東人群ADD2 基因rs3755351位點(diǎn)多態(tài)性與高血壓遺傳易感性的相關(guān)性，以期為高血壓的防控工作提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 研究對象

樣本為200 μL外周血，病例組來自2010年～2012年在福建和廣州市疾病預(yù)防控制中心（CDC）確診的高血壓患者940例，男527例，女413例，平均年齡（60.2±16.2）歲，中位年齡62歲。對照組為同期入院的體檢人員944名，無高血壓遺傳史，男497名，女447名，平均年齡（54.0±18.7）歲，中位年齡59歲。其中廣州CDC病例組443例，男171例，女272例；對照組443例，男185例，女258例。平均年齡（69.2±10.7）歲，中位年齡68歲；福建病例組497例，男356例，女141例。對照組501例，男312例，女189例。平均年齡（46.2±15.6）歲，中位年齡45歲。

1.2 方法

1.2.1 DNA 的提取

用全基因組DNA提取試劑盒（TIANamp Genomic DNA Kit，北京天根生物科技有限公司）提取DNA（按說明書操作），保存于-70 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計(jì)

針對染色體2p13區(qū)ADD2 基因rs3755351位點(diǎn)，采用Sequenom公司的軟件Assay Design 3.1進(jìn)行引物設(shè)計(jì)并由上海英駿生物公司（Invitrogen）合成。其中rs3755351 PCR特異性擴(kuò)增引物為5'-ACGTTGGA TGCACACATTTTGTGTTCAGCG-3'；5'- CGTTGGAT GCTGAGATTATAAGTGGCTCC-3'；單堿基延伸引物為5'-CCCCCAGCGACAGTATCTCTTTA-3'。

1.2.3 SNP分型

利用MassARRAY?SNP分型技術(shù)對ADD2基因rs3755351位點(diǎn)進(jìn)行基因分型。具體步驟如下：（1）PCR 擴(kuò)增rs3755351位點(diǎn)所在的DNA片段：將提取純化后的基因組DNA樣品定量稀釋，按設(shè)計(jì)順序加1μL DNA 樣品于384孔板上，然后添加4μL PCR擴(kuò)增體系，使反應(yīng)物的終濃度為1 U的Taq聚合酶，10 ng基因組DNA，各0.1μmol/L的PCR引物，500μmol/L dNTP。PCR 反應(yīng)條件：95℃ 2 min，95℃30 s，56℃ 30 s，72℃ 60 s 進(jìn)行 45 個循環(huán)，72℃ 5 min。（2）蝦堿性磷酸酶（Shrimp alkaline phosphatase，SAP）反應(yīng)：添加0.5 U的SAP去除未反應(yīng)完的dNTP，反應(yīng)條件為37℃ 40 min，85℃ 5 min。（3）單堿基延伸反應(yīng)：向SAP反應(yīng)體系再加0.11μmol/L延伸引物，500μmol/L ddNTP，0.5 U 的 Thermosequenase DNA聚合酶。為了保持DNA聚合酶的活性，反應(yīng)條件為94℃ 2 min，40 個循環(huán)的 94℃ 5 s，（52℃ 5 s, 80℃ 5 s）× 5個循環(huán)，72℃ ×3 min。（4）脫鹽，質(zhì)譜分析：反應(yīng)產(chǎn)物用樹脂脫鹽后經(jīng)自動點(diǎn)樣儀點(diǎn)樣于SpectroCHIP（Sequenom）芯片，點(diǎn)制后的芯片用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（SpectroREADER，Sequenom）檢測，根據(jù)單堿基延伸的等位基因相對分子的量的不同進(jìn)行基因分型。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用Haploview 4.1軟件進(jìn)行哈代-溫伯格平衡（Hardy-Weinberg equilibrium，HWE）檢驗(yàn)。應(yīng)用χ2檢驗(yàn)分析病例組和對照組中基因型的分布差異，用比值比（OR）及95% CI表示相對危險度。所有的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均為雙側(cè)概率檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α= 0.05。

2 結(jié)果

2.1 ADD2 基因rs3755351位點(diǎn)3種基因型的特征質(zhì)譜圖及其分布

ADD2基因位于染色體2p13區(qū)域，rs3755351 是ADD2基因內(nèi)含子上一個A＞C變異位點(diǎn)。在本研究人群中，rs3755351存在AA、AC、CC三種基因型，其特征圖譜如圖1。

ADD2基因rs3755351位點(diǎn)在對照組中AA、AC、CC三種基因型分布頻率分別為14%、47%和39%。其中等位基因A和C的分布頻率分別為37%和63%；在高血壓病例組AA、AC、CC三種基因型的分布頻率分別為13%、50%和37%，其中等位基因A和C的分布頻率分別為38%和62%。兩組之間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=1.730，P=0.421；χ2=0.118，P=0.731），見表 1。

2.2 ADD2 基因rs3755351位點(diǎn)多態(tài)性與福建、廣東高血壓易感性的相關(guān)性

采用非條件Logistic回歸分析，校正性別、年齡影響，評價rs3755351多態(tài)性與高血壓遺傳易感性的相關(guān)性。在隱性模型中，rs3755351位點(diǎn)AA和AC-CC基因型在福建高血壓病例組中分布頻率為10.5%、89.5%，與對照組（14.2%、85.8%）相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與rs3755351 AC或CC基因型相比，攜帶AA基因型的個體能顯著降低患高血壓的發(fā)病危險（OR=0.65，95%CI：0.43～0.99，P=0.044），見表 2。Add2 基因的rs3755351多態(tài)位點(diǎn)AA、AC和CC基因型在廣東高血壓人群中的分布頻率為15.1%、53.0%和31.8%，與對照組（12.4%、52.4%和35.2%）相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＞0.05，見表 3。

圖1 ADD2 基因rs3755351位點(diǎn)的基因型特征質(zhì)譜圖Figure 1 of the AA, AC and CC polymorphism of rs3755351 in ADD2

表1 高血壓組與對照組ADD2基因rs3755351位點(diǎn)多態(tài)性分布Table 1 Distribution of rs3755351 polymorphism in hypertension and control groups

表2 ADD2 基因rs3755351位點(diǎn)在福建人群中多態(tài)性分布及與高血壓易感性的相關(guān)性Table 2 Frequency of rs3755351 in ADD2 genotype and risk of hypertension in Fujian population

表3 ADD2 基因rs3755351位點(diǎn)在廣東人群中多態(tài)性分布及與高血壓易感性的相關(guān)性Table 3 Frequency of rs3755351 in ADD2 genotype and risk of hypertension in Guangdong population

3 討論

ADD2基因在染色體2p13上跨越了100 kb的區(qū)域，有17個外顯子組成[5]。ADD2在腦、胎兒肝臟和腎臟中表達(dá)量最高[6]，是當(dāng)環(huán)境強(qiáng)化時穩(wěn)定組裝新的突觸和提高記憶力所必須的[7]。ADD2還是糖原合成酶激酶3（GSK3）的底物，β-adducin的磷酸化（通過GSK3途徑）能有效地促進(jìn)軸突在神經(jīng)元中的生長[8]。β-adducin蛋白的突變能導(dǎo)致腎動脈肌張力的損傷[9]，還能通過調(diào)整特定的足突細(xì)胞蛋白表達(dá)參與腎小球病變的發(fā)展[10]。β-adducin缺失的小鼠表現(xiàn)為行為、運(yùn)動協(xié)調(diào)和學(xué)習(xí)能力的喪失，伴隨著α-adducin和γ-adducin蛋白表達(dá)水平和（或）磷酸化水平的改變，同時伴有海馬體的長時程增強(qiáng)和抑制的損害[11]。Currie等[12]首先報(bào)道了ADD2基因的多態(tài)性和Ⅰ型糖尿病、糖尿病腎病的遺傳易感性的相關(guān)性。

個體化是高血壓治療的趨勢之一[1]，高血壓候選基因變異可能影響血壓水平對特定的降壓藥物治療的反應(yīng)，遺傳變異的測量可能有助于確定高血壓患者亞組中誰將會從特定的降壓藥物治療中獲得最大受益[13]。Ferrari等[14]發(fā)現(xiàn)一種新的降血壓藥物rostafuroxin能夠拮抗與adducin和ouabain基因有關(guān)的高血壓。Lanzani等也證實(shí)adducin和ouabain相關(guān)基因的變異能夠預(yù)測抗高血壓藥物rostafuroxin的臨床效果[15,16]。利尿劑在預(yù)防心肌梗死和腦卒中超過其他抗高血壓藥物療法產(chǎn)生的類似降低血壓的選擇性優(yōu)勢，被認(rèn)為可能支持旨在優(yōu)化新的降壓藥物用于預(yù)防高血壓相關(guān)器官損害的新戰(zhàn)略[8]。然而，Kimura等[17]在半隔離的非裔巴西人群中通過對97個家庭的652例參與者分析ADD2（rs3755351）等7個基因位點(diǎn)的變異對原發(fā)性高血壓的影響，沒有發(fā)現(xiàn)所研究的單獨(dú)變異與收縮壓、舒張壓或者和原發(fā)性高血壓有關(guān)，僅發(fā)現(xiàn)有限的證據(jù)證明這些基因變異的多基因座效應(yīng)對血壓水平有影響，這些研究結(jié)果尚需要進(jìn)一步的證實(shí)。

本研究采用病例-對照研究方法，通過對940例高血壓患者和944名正常對照的ADD2基因rs3755351位點(diǎn)的基因分型發(fā)現(xiàn)，ADD2 基因rs3755351多態(tài)性位點(diǎn)與福建地區(qū)人群高血壓的遺傳易感性相關(guān)。與rs3755351 AC或CC基因型相比，攜帶AA基因型的個體能顯著降低患高血壓的發(fā)病危險。在廣東人群中未發(fā)現(xiàn)rs3755351多態(tài)位點(diǎn)與高血壓的遺傳易感性相關(guān)。由于本研究僅局限于福建、廣東地區(qū)人群，而SNP 位點(diǎn)的多態(tài)性在種族和地域上往往有較大的差異。因此，ADD2 基因rs3755351位點(diǎn)與高血壓易感性的相關(guān)性尚需在中國其他人群中加以驗(yàn)證。

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