造血干細(xì)胞移植術(shù)后人巨細(xì)胞病毒包膜糖蛋白gB抗原血癥及gB特異性CD8+ T細(xì)胞測(cè)定

劉安兵 黃雅萍 胡建華 梁韓英 楊鎔 王慧琦 陳曉明 范駿

人巨細(xì)胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）是皰疹病毒科β屬的一種機(jī)會(huì)性致病性雙鏈DNA病毒，當(dāng)機(jī)體免疫力低下尤其異基因造血干細(xì)胞移植術(shù)后HCMV的激活增加了威脅生命的多種并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)[1～3]。在異基因造血干細(xì)胞移植術(shù)后，有效的HCMV特異性CD8+T細(xì)胞免疫應(yīng)答能夠長(zhǎng)期避免HCMV激活和疾病的發(fā)生[4]。因此，研究移植術(shù)后HCMV感染狀態(tài)和CD8+T細(xì)胞免疫機(jī)制可能對(duì)控制病毒感染建立理論基礎(chǔ)。

目前病毒即刻早期（immediate-early，IE）和磷蛋白 65（phosphoprotein 65，pp65）抗原的檢測(cè)尤其pp65抗原血癥的檢測(cè)更被認(rèn)為是診斷HCMV活動(dòng)性感染的“標(biāo)準(zhǔn)方法”之一[5～6]。包膜糖蛋白B（glycoprotein B，gB）是由HCMV UL55編碼的最重要包膜抗原之一，檢測(cè)gB抗原可能有助于診斷和監(jiān)測(cè)HCMV感染。gB具有重要的免疫原性，不僅能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體[7]，而且還能誘導(dǎo)特異性CD8+T細(xì)胞免疫，是T細(xì)胞免疫應(yīng)答的重要靶抗原[8～9]。因此，檢測(cè)gB誘導(dǎo)的特異性T細(xì)胞對(duì)闡明HCMV致病機(jī)理具有重要作用。

本研究檢測(cè)了92份異基因造血干細(xì)胞移植術(shù)后病人外周血白細(xì)胞標(biāo)本gB、 IE和pp65抗原，探討了gB抗原檢測(cè)的應(yīng)用價(jià)值；分析了gB特異性CD8+T細(xì)胞在移植術(shù)后控制HCMV感染的免疫應(yīng)答效應(yīng)。

1 方法

1.1 標(biāo)本來源及分組

共收集外周血EDTA抗凝標(biāo)本92份。標(biāo)本來源于異基因造血干細(xì)胞移植術(shù)后本院住院和門診隨訪病人，排除二次移植及術(shù)前檢測(cè)HCMV pp65或IE抗原陽(yáng)性的病人，共64例（男性34例，女性30例），平均年齡29.7±9.9歲（10歲～55歲），術(shù)前原發(fā)病包括髓性白血?。?2例），淋巴細(xì)胞性白血病（16例），骨髓異常增生綜合癥（3例），再生性障礙性貧血（2例）和淋巴瘤（1例）。

根據(jù)病人行移植術(shù)之日至此次檢測(cè)的時(shí)間長(zhǎng)短對(duì)所收集的待測(cè)標(biāo)本進(jìn)行分組：A組（0≤時(shí)間間隔/月≤3），共22份標(biāo)本；B組（3＜時(shí)間間隔/月≤12），共27份標(biāo)本；C組（時(shí)間間隔/月＞12），共43份標(biāo)本。

1.2 外周血白細(xì)胞gB、pp65和IE抗原檢測(cè)

取新鮮EDTA 抗凝血5 mL，分離白細(xì)胞并制作白細(xì)胞涂片[10]。免疫組化二步法檢測(cè)gB、pp65和IE抗原。商品化鼠源性HCMV gB單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Novus公司，HCMV pp65單克隆抗體、IE單克隆抗體和EnVisionTMSystem檢測(cè)試劑盒購(gòu)自丹麥Abcam公司。光學(xué)顯微鏡為日本產(chǎn)OLYMPUS（CHA213）。操作流程參照廠商說明書進(jìn)行。以正常MRC-5細(xì)胞和HCMV Towne株感染的MRC-5細(xì)胞分別為陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照。MRC-5和HCMV標(biāo)準(zhǔn)株Towne株購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）。陽(yáng)性細(xì)胞呈棕黃色或棕褐色，陰性細(xì)胞呈淡藍(lán)色。陽(yáng)性結(jié)果以陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/5×104WBC表示[11]。

1.3 gB抗原T細(xì)胞表位篩選及MHC-肽五聚體合成

根據(jù)gB蛋白（登錄號(hào)：M60929）氨基酸序列，應(yīng)用SYFPEITHI算法[12]和高通量的REVEALTM主要組織相容性抗原-肽結(jié)合力測(cè)定[13]預(yù)測(cè)、篩選出7條潛在的HLA-A*1101限制性的gB九肽。氨基酸序列如下：P1，VTITTARSK；P2，ISWDIQDEK；P3，MTATFLSKK；P4，GTVFVAYHR；P5，VTINQTSVK；P6，KVLRDMNVK；P7，TSYNQTYEK。然后合成HLA-A*1101-gB九肽五聚體（ProImmune公司）。

選取異基因造血干細(xì)胞移植受者16例，術(shù)后100天采集外周全血標(biāo)本16份，F(xiàn)icoll密度梯度離心法分離出16份PBMCs，F(xiàn)icoll液購(gòu)自天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司，分別用合成的7種五聚體進(jìn)行染色，每種五聚體染色一次，進(jìn)行MHC-肽五聚體實(shí)驗(yàn)。

1.4 MHC-肽五聚體實(shí)驗(yàn)

五聚體染色根據(jù)試劑說明書進(jìn)行。1×106個(gè)外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）加入2μL的五聚體孵育10 min，用2 mL洗液洗滌兩次，之后加入8μL的FluoroTag-藻紅蛋白（PE）和1μL異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的CD8單克隆抗體（ProImmune公司）于4℃避光孵育20 min。2 mL洗液洗滌兩次后Beckman Coulter流式細(xì)胞儀（FC500 MPL，F(xiàn)ullerton，CA）進(jìn)行分析，至少分析100 000個(gè)細(xì)胞。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析?？乖瓩z測(cè)陽(yáng)性率比較采用配對(duì)四格表資料McNemar檢驗(yàn)、相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析；組內(nèi)陽(yáng)性率比較采用配對(duì)四格表資料Fisher確切概率法；組間陽(yáng)性率比較采用四格表資料校正χ2檢驗(yàn)；gB332-340五聚體+CD8+T細(xì)胞頻率與gB抗原血癥的相關(guān)性分析使用Pearson相關(guān)分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 gB、IE和pp65抗原檢測(cè)

外周血白細(xì)胞樣本中HCMV gB抗原檢測(cè)陽(yáng)性細(xì)胞棕褐色染色明顯，邊界清晰，區(qū)別于淡藍(lán)色的陰性細(xì)胞，見圖1所示。92份標(biāo)本的gB抗原、IE抗原和pp65抗原檢測(cè)陽(yáng)性率分別為82.6%（76/92）、92.4%（85/92）和90.2%（83/92），兩兩比較：gB抗原和IE抗原陽(yáng)性率差異有顯著性（P=0.035）；gB抗原和pp65抗原陽(yáng)性率差異無顯著意義（P=0.065）；pp65抗原和IE抗原陽(yáng)性率差異無顯著意義（P=0.727）。三者抗原檢測(cè)結(jié)果兩兩之間均呈正相關(guān)（rgB&IE=0.827，P=0.000 ；rgB&pp65=0.877，P=0.000 ；rIE&pp65=0.912，P=0.000）。

圖 1 酶免疫組化pp65抗原血癥檢測(cè)Figure 1 Detection of pp65 antigenaemia in a leucocytic sample by enzyme immunohistochemistry

2.2 組內(nèi)及組間gB、IE和pp65抗原檢測(cè)比較

A、B、C三組組內(nèi)gB、IE和pp65抗原檢測(cè)陽(yáng)性率分別為：（1）A 組：86.4%（19/22）、90.9%（20/22）和 90.9%（20/22）；（2）B 組：88.9%（24/27）、100%（27/27）和 92.6%（25/27）；（3）C 組：76.7%（33/43）、88.4%（38/43）和88.4%（38/43）。其中C組gB抗原和IE抗原之間（P=0.005）、gB抗原和pp65抗原之間陽(yáng)性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.005）；A組內(nèi)gB抗原和IE抗原之間（P=1.000）、gB抗原和pp65抗原之間（P=1.000）陽(yáng)性率差異無顯著意義；B組內(nèi)gB抗原和IE抗原之間（P=0.236）、gB抗原和pp65抗原之間（P=1.000）陽(yáng)性率差異無顯著意義。在C組中，gB陰性而IE或pp65陽(yáng)性的標(biāo)本，其IE或pp65陽(yáng)性值處于一個(gè)較低的范圍（1～6/5×104WBC）。

A、B、C三組組間gB、IE和pp65抗原檢測(cè)陽(yáng)性率比較：同種抗原檢測(cè)陽(yáng)性率組間差異均無顯著性，即三種抗原在移植術(shù)后不同時(shí)期內(nèi)的陽(yáng)性率保持穩(wěn)定。

2.3 gB表位篩選和gB特異性CD8+ T細(xì)胞測(cè)定

選取16例異基因造血干細(xì)胞移植HLA-A*1101受者于移植后100天采集外周全血標(biāo)本16份，分離出16份PBMCs，分別用合成的7種不同五聚體進(jìn)行染色，每種五聚體染色一次，各種五聚體+CD8+T細(xì)胞的均值如下：P1，0.14%；P2，0.23%；P3，0.18%；P4，0.16%；P5，0.15%；P6，0.16%；P7，0.15%。各種五聚體測(cè)定對(duì)應(yīng)的染色陽(yáng)性的細(xì)胞進(jìn)行兩兩比較，結(jié)果顯示P2（gB332-340）對(duì)應(yīng)的五聚體+CD8+T細(xì)胞與其它九肽對(duì)應(yīng)的五聚體+CD8+T細(xì)胞相比具有顯著性差異（P＜0.05）。圖2為1例異基因造血干細(xì)胞移植患者術(shù)后100天流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血gB332-340特異性的CD8+T細(xì)胞的結(jié)果。gB九肽（ISWDIQDEK）可能是HLA-A*1101限制性的相對(duì)優(yōu)勢(shì)抗原肽。分析發(fā)現(xiàn)，gB332-340特異性的CD8+T細(xì)胞的頻率與外周血gB抗原血癥的發(fā)生呈負(fù)相關(guān)（r=-0.6721；P=0.0043）。

圖 2 流式細(xì)胞術(shù)外周血gB332-340特異性的CD8+ T細(xì)胞檢測(cè)Figure 2 Detection of gB332-340-specific CD8+ T cells in a peripheral blood sample by flow cytometry

3 討論

人巨細(xì)胞病毒是異基因造血干細(xì)胞移植術(shù)后感染的常見病原體，盡管目前常規(guī)采取術(shù)前預(yù)防性抗病毒治療，HCMV仍然是導(dǎo)致患者術(shù)后感染和死亡的重要原因之一[14]。gB是HCMV最重要的包膜糖蛋白之一，參與病毒穿入宿主細(xì)胞、細(xì)胞間傳播[15]以及感染細(xì)胞間融合[16]過程。鑒于gB蛋白在HCMV感染中的重要作用，檢測(cè)gB抗原可能有助于診斷和監(jiān)測(cè)HCMV感染。

在與pp65和IE抗原檢測(cè)的比較中發(fā)現(xiàn)，gB抗原與pp65和IE抗原均呈正相關(guān)（rgB&IE=0.827 ；rgB&pp65=0.877 ；rIE&pp65=0.912），其陽(yáng)性率（82.6%）和pp65抗原陽(yáng)性率（90.2%）的差異無顯著意義（P=0.065），但比IE抗原陽(yáng)性率（92.4%）低（P=0.035）。HCMV的復(fù)制周期可以分為三個(gè)階段：即刻早期、早期和晚期[17]。蛋白IE、pp65和gB分別在復(fù)制周期的即刻早期、晚期和晚期合成[17～19]；而在一個(gè)病毒復(fù)制周期中，gB的合成完成更晚于pp65；gB是組成病毒包膜結(jié)構(gòu)的蛋白之一，膜蛋白合成成熟意味著病毒即將完成裝配。這似乎可以解釋gB抗原檢測(cè)陽(yáng)性率低于IE抗原檢測(cè)陽(yáng)性率，而與pp65抗原檢測(cè)陽(yáng)性率無差異。我們?nèi)孕枰獢U(kuò)大樣本含量得以證實(shí)這一結(jié)果。在對(duì)待測(cè)樣本的檢測(cè)中，大部分的標(biāo)本可同時(shí)檢測(cè)到三種抗原，表明在病毒復(fù)制周期中蛋白質(zhì)的合成不是完全獨(dú)立的過程，而是一個(gè)有序并重疊關(guān)聯(lián)的過程。

為了比較移植術(shù)后不同時(shí)期三種病毒抗原的檢測(cè)情況，我們將待測(cè)樣本分組并排除二次移植及術(shù)前pp65或IE抗原陽(yáng)性等因素：A組（移植術(shù)后3個(gè)月內(nèi)）、B組（移植術(shù)后3個(gè)月至1年）和C組（移植術(shù)后1年以上）。三種抗原檢測(cè)陽(yáng)性率在移植術(shù)后1年內(nèi)差異無顯著性，這提示在移植術(shù)后短期或中期的HCMV檢測(cè)中，類似于IE和pp65，gB有潛在的早期診斷價(jià)值。值得注意的是，由于gB合成成熟預(yù)示著病毒的裝配完成，及在病毒穿入和細(xì)胞間傳播中的重要作用[20～21]，gB抗原陽(yáng)性可能是一個(gè)提示病毒感染能力的指標(biāo)。在異基因造血干細(xì)胞移植術(shù)后3個(gè)月內(nèi)，HCMV感染與急性移植物抗宿主病及急性排斥反應(yīng)的發(fā)生相關(guān)[22]，嚴(yán)重的HCMV病可能導(dǎo)致移植失敗甚至死亡；相應(yīng)地，病毒檢測(cè)應(yīng)首先滿足早期診斷的需要以便臨床預(yù)先干預(yù)和治療，此時(shí)選擇病毒復(fù)制早期的抗原（如IE抗原）更具預(yù)防意義。對(duì)于移植術(shù)后長(zhǎng)期隨訪的病人來說，控制慢性排斥反應(yīng)和維持機(jī)體各器官功能的平衡穩(wěn)定相對(duì)更為重要[23]，同時(shí)，抗病毒需要提高機(jī)體免疫功能而可能導(dǎo)致排斥的發(fā)生[24]；相應(yīng)地，病毒檢測(cè)應(yīng)首先滿足確定診斷的需要以防抗病毒藥物加重臟器負(fù)擔(dān)。因此，此時(shí)應(yīng)選擇病毒復(fù)制晚期的抗原（如gB抗原）以減少病毒感染的假陽(yáng)性診斷。在此次研究中，移植術(shù)后1年以上的標(biāo)本，其gB抗原陽(yáng)性率低于IE和pp65抗原陽(yáng)性率（P=0.005）；并且，在gB陰性而IE或pp65陽(yáng)性的標(biāo)本中，IE或pp65陽(yáng)性值處于一個(gè)較低的范圍（1～6/5×104WBC）。這些提示，gB抗原血癥檢測(cè)是在監(jiān)測(cè)移植術(shù)后長(zhǎng)期隨訪病人HCMV感染中對(duì)IE和pp65抗原血癥檢測(cè)方法的一種補(bǔ)充。

我們應(yīng)用基于流式細(xì)胞術(shù)的五聚體技術(shù)成功篩選出HLA-A*1101限制性的gB相對(duì)優(yōu)勢(shì)抗原九肽gB332-340，認(rèn)為gB是CD8+T細(xì)胞免疫應(yīng)答的靶抗原。另外發(fā)現(xiàn)gB332-340特異性的CD8+T細(xì)胞的頻率與外周血gB抗原血癥的發(fā)生呈負(fù)相關(guān)（r=-0.6721；P=0.0043），或許gB332-340特異性的CD8+T細(xì)胞在控制HCMV感染中起到重要作用。我們下一步將深入探討gB332-340特異性的CD8+T細(xì)胞的功能（如細(xì)胞毒性分析、細(xì)胞因子分泌等）。這些工作將為HCMV致病機(jī)理的闡述和T細(xì)胞過繼免疫治療打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

[1] Boeckh M, Leisenring W, Riddell S R, et al. Late cytomegalovirus disease and mortality in recipients of allogeneic hematopoietic stem cell transplants: importance of viral load and T-cell immunity[J]. Blood, 2003, 101(2): 407-414.

[2] Zhang X, Huang Y P, Gao H N, et al. Quantification of cytomegalovirus glycoprotein Bn DNA in hematopoietic stem cell transplant recipients by real-time PCR[J]. PLoS One, 2012, 7(12): e51224.

[3] Baldanti F, Lilleri D, Gerna G. Monitoring human cytomegalovirus infection in transplant recipients[J]. J Clin Virol, 2008, 41(3): 237-241.

[4] Quinnan G V Jr, Kirmani N, Rook A H, et al. Cytotoxic t cells in cytomegalovirus infection: HLA-restricted T-lymphocyte and non-T-lymphocyte cytotoxic responses correlate with recovery from cytomegalovirus infection in bone-marrow-transplant recipients[J]. N Engl J Med, 1982,307(1): 7-13.

[5] Baldanti F, Revello M G, Percivalle E, et al. Use of the human cytomegalovirus (HCMV) antigenemia assay for diagnosis and monitoring of HCMV infections and detection of antiviral drug resistance in the immunocompromised[J]. J Clin Virol, 1998, 11(1): 51-60.

[6] Boeckh M, Bowden R A, Gooley T, et al. Successful modification of a pp65 antigenemia-based early treatment strategy for prevention of cytomegalovirus disease in allogeneic marrow transplant recipients[J]. Blood, 1999,93(5): 1781-1782.

[7] Navarro D, Lennette E, Tugizov S, et al. Humoral immune response to functional regions of human cytomegalovirus glycoprotein B[J]. J Med Virol, 1997, 52(4): 451-459.

[8] Berencsi K, Rando R F, deTaisne C, et al. Murine cytotoxic T cell response specific for human cytomegalovirus glycoprotein B (gB) induced by adenovirus and vaccinia virus recombinants expressing gB[J]. J Gen Virol, 1993, 74(Pt 11): 2507-2512.

[9] Hopkins J I, Fiander A N, Evans A S, et al. Cytotoxic T cell immunity to human cytomegalovirus glycoprotein B[J]. J Med Virol, 1996, 49(2): 124-131.

[10] 洪良慶, 鄭克立, 朱蘭英, 等. 白細(xì)胞中巨細(xì)胞病毒抗原檢測(cè)及在腎移植的臨床應(yīng)用[J]. 中華醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志, 1998,21(1): 33-35.

[11] Zhang X, Fan J, Yang M F, et al. Monitoring of human cytomegalovirus infection in bone marrow and liver transplant recipients by antigenaemia assay and enzymelinked immunosorbent assay[J]. J Int Med Res, 2009, 37(1):31-36.

[12] Rammensee H, Bachmann J, Emmerich N P, et al.SYFPEITHI: database for MHC ligands and peptide motifs[J]. Immunogenetics, 1999, 50(3-4): 213-219.

[13] Westrop S J, Grageda N, Imami N. Novel approach to recognition of predicted HIV-1 Gag B3501-restricted CD8 T-cell epitopes by HLA-B3501(+) patients: confirmation by quantitative ELISpot analyses and characterisation using multimers[J]. J Immunol Methods, 2009, 341(1-2): 76-85.

[14] Gratama J W, Cornelissen J J. Diagnostic potential of tetramer-based monitoring of cytomegalovirus-specific CD8+T lymphocytes in allogeneic stem cell transplantation[J]. Clin Immunol, 2003, 106(1): 29-35.

[15] Isaacson M K, Compton T. Human cytomegalovirus glycoprotein B is required for virus entry and cell-to-cell spread but not for virion attachment, assembly, or egress[J]. J Virol, 2009, 83(8): 3891-3903.

[16] Navarro D, Paz P, Tugizov S, et al. Glycoprotein B of human cytomegalovirus promotes virion penetration into cells,transmission of infection from cell to cell, and fusion of infected cells[J]. Virology, 1993, 197(1): 143-158.

[17] Fan J, Ma W H, Yang M F, et al. Real-time fluorescent quantitative PCR assay for measuring cytomegalovirus DNA load in patients after haematopoietic stem cell transplantation[J]. Chin Med J(Engl), 2006, 119(10): 871-874.

[18] Chiou S H, Yang Y P, Lin J C, et al. The immediate early 2 protein of human cytomegalovirus (HCMV) mediates the apoptotic control in HCMV retinitis through up-regulation of the cellular FLICE-inhibitory protein expression[J]. J Immunol, 2006, 177(9): 6199-6206.

[19] Britt W J, Mach M. Human cytomegalovirus glycoproteins[J]. Intervirology, 1996, 39(5-6): 401-412.

[20] Sarcinella L, Mazzulli T, Willey B, et al. Cytomegalovirus glycoprotein B genotype does not correlate with outcomes in liver transplant patients[J]. J Clin Virol, 2002, 24(1-2):99-105.

[21] Coaquette A, Bourgeois A, Dirand C, et al. Mixed cytomegalovirus glycoprotein B genotypes in immunocompromised patients[J]. Clin Infect Dis, 2004,39(2): 155-161.

[22] Baldanti F, Lilleri D, Gerna G. Human cytomegalovirus load measurement and its applications for pre-emptive therapy in patients undergoing hematopoietic stem cell transplantation[J]. Hematol Oncol, 2008, 26(3): 123-130.

[23] Caillard S, Moulin B. Transplant patient monitoring[J]. Rev Prat, 2007, 57(3): 299-308.

[24] Waldman W J, Knight D A, Lurain N S, et al. Novel mechanism of inhibition of cytomegalovirus by the experimental immunosuppressive agent leflunomide[J].Transplantation, 1999, 68(6): 814-825.