游離三碘甲狀腺原氨酸（FT3）時間分辨熒光免疫分析試劑盒的研制

王毅 何詠婷 馮健明 劉銀河

游離三碘甲狀腺原氨酸（free triiodothyronine，F(xiàn)T3）是由甲狀腺濾泡細(xì)胞合成及分泌的激素，具有促進(jìn)物質(zhì)與能量代謝，促進(jìn)機(jī)體生長和發(fā)育的生物學(xué)活性，是甲狀腺疾病的重要診斷指標(biāo)，對某些非甲狀腺疾病也有輔助診斷價值。

目前，臨床檢測FT3的常用方法有酶聯(lián)免疫分析法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、化學(xué)發(fā)光免疫測定法（chemiluminescence immunoassay，CLIA）和TRFIA。第一代TRFIA以PerkinElmerTM公司產(chǎn)品為代表，檢測FT3采用間接競爭法。即以二抗包被微孔反應(yīng)板，加入三碘甲狀腺原氨酸（triiodothyronine，T3）單克隆抗體的工作液，以DTTA-Eu3+標(biāo)記的FT3-BSA為示蹤物與樣本中的FT3競爭結(jié)合T3單抗，通過增強(qiáng)液的解離增強(qiáng)作用，檢測每孔的熒光值，將其代入標(biāo)準(zhǔn)品制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線中計算出血樣中的FT3含量。該方法需要分步孵育，最終反應(yīng)時間達(dá)130 min或以上，操作較為復(fù)雜。

1 材料與方法

1.1 原料與儀器

抗FT3單克隆抗體及FT3抗原均購于Fitzgerald公司；羧基修飾的T3復(fù)合物購自Biodesign公司；96孔微孔反應(yīng)板（8×12）為深圳金燦華公司的產(chǎn)品；DTTA-Eu3+標(biāo)記原料購自PerkinElmer公司；SephacryTMS-200為GE Healthcare 產(chǎn)品；FT3質(zhì)控血清為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品。時間分辨熒光免疫檢測系統(tǒng)為PerkinElmer 公司的DELFIA?1420。全自動化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)為德國SIEMENS公司的ADVIA Centaur?Systems。650份血清樣本收自深圳市孫逸仙心血管醫(yī)院檢驗科，其中150份異常樣本（根據(jù)中國甲狀腺疾病診治指南確診為甲亢或甲減）和500份正常血清樣本（根據(jù)中國甲狀腺疾病診治指南確診為甲狀腺功能正常），以上樣本均是清晨空腹時使用血清分離膠真空采血管或普通促凝干燥管用靜脈穿刺法采集靜脈血，讓其凝結(jié)，用離心法分離出血清，并置于-20℃保存。

1.2 試劑盒組分制備

1.2.1 固相包被抗原的制備

用50 mmol/L、pH4.2的磷酸鹽緩沖液將包被抗原稀釋至 6 μg/mL，然后 200 μL /孔加入（8×12）微孔反應(yīng)板中，4℃過夜，傾去包被液，加入含有0.5%BSA的封閉液250 μL/孔，37℃下放置2 h后，傾去封閉液，板塊向外離心5 min，真空抽干，封熱塑膜，2～8℃環(huán)境保存。

1.2.2 Eu3+標(biāo)記抗體的制備與純化

將1 mg抗FT3單克隆抗體加入Millipore公司帶有濾膜的離心管（貨號UFC803008，30 KDa）中，10 000 rpm 離心 5～6 min，棄去濾液，往柱中心加入標(biāo)記緩沖液（50 mmol/L Na2CO3pH 9.4），10 000 rpm 離心5～6 min，棄去濾液，重復(fù)上述步驟4次。最后一次將離心管取出，棄掉濾液，將離心柱的濾芯反裝入離心管中，往離心柱中加入200 μL標(biāo)記緩沖液，靜置1 min，9 000 rpm離心 5～6 min收集濾液，即為待標(biāo)記的抗體原料。將0.5 mg的DTTA-Eu3+標(biāo)記原料加入到1 mg標(biāo)記抗體中，混勻后4℃靜置46±2 h進(jìn)行標(biāo)記孵育。標(biāo)記完成后上樣過SephacryTMS-200層析柱（1.6 cm×80 cm）分離純化，用洗脫液（50 mmol/L 的Tris-HCl）洗脫，同時使用自動部分收集器收集流出液（1 mL/管），逐管測量吸光度（A=280 nm），取峰管中的銪標(biāo)記物進(jìn)行混合，以PerkinElmer 公司Eu3+標(biāo)記試劑盒中的Eu3+為標(biāo)準(zhǔn)，測定混合峰管的Eu3+濃度。所得標(biāo)記率（Eu3+mol/IgG mol）為10，蛋白質(zhì)回收率為87%。

1.2.3 參考標(biāo)準(zhǔn)品的制備

用去激素人血清作為標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液將FT3抗原配制成濃度梯度為 0、1.5、4、8、20、70 pmol/L 的一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用國家標(biāo)準(zhǔn)品對配制的校準(zhǔn)品進(jìn)行校準(zhǔn)。以0.5 mL/瓶的規(guī)格進(jìn)行分裝，凍干，并于-20℃干燥環(huán)境中保存。

1.3 操作程序

1.3.1 FT3時間分辨熒光免疫分析試劑盒操作程序

微孔反應(yīng)板按次序加入25 μL /孔的標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣本，再加入用分析緩沖液按1:100倍稀釋的銪標(biāo)記抗體工作液200 μL/孔，室溫下緩慢振蕩（微量振蕩器）60 min。洗板6次（用條式洗板），拍干。向每孔中加入增強(qiáng)液200 μL，于室溫下緩慢振蕩5 min后置于 PerkinElmer公司的DELFIA?1420時間分辨熒光免疫分析檢測儀進(jìn)行檢測，在30 min內(nèi)完成檢測。

1.3.2 全自動化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)操作程序

按照ADVIA Centaur?Systems要求裝載樣本及試劑包，系統(tǒng)自動執(zhí)行檢測程序。

2 結(jié)果

2.1 劑量-反應(yīng)曲線

以PerkinElmer公司的DELFIA?1420時間分辨熒光免疫分析檢測儀測定熒光值與各參考標(biāo)準(zhǔn)品濃度值，用Log-Logit 進(jìn)行數(shù)學(xué)模型擬合，并自動繪制校準(zhǔn)曲線。其劑量-反應(yīng)曲線線性相關(guān)系數(shù)絕對值為0.9973，如圖1所示，表明本試劑盒制備的試劑具有良好的劑量反應(yīng)線性關(guān)系。

2.2 試劑檢測靈敏度及線性范圍

圖1 FT3測定試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線（TRFIA）Figure 1 Standard curve of the FT3 TRFIA kit (TRFIA)

以參考校準(zhǔn)品A點（零校準(zhǔn)品）作為待測樣本做20個復(fù)孔，計算其平均熒光值以及標(biāo)準(zhǔn)差。以A點測定熒光值的平均值減去2個標(biāo)準(zhǔn)差所得的熒光值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計算得出的濃度為其靈敏度。本試劑盒靈敏度為0.7 pmol/L，不高于1.5 pmol/L。按照EP6-A要求進(jìn)行評價，試劑檢測線性范圍為：1.5～70 pmol/L。

2.3 精密度

通過對Bio-Rad公司FT3三個血清質(zhì)控品（Q1、Q2、Q3，其說明書靶值濃度分別為 3.8、6.0、12.5 pmol/L）進(jìn)行10個復(fù)孔測定，分3次試驗，然后根據(jù)數(shù)值計算出變異性。其分析內(nèi)變異系數(shù)小于8.2%、分析間變異系數(shù)均不高于10.5%和其總變異系數(shù)均不高于9.0%，符合試劑盒檢定的要求，見表1。

2.4 特異性（交叉反應(yīng)）

將已知FT3濃度的樣本平分成5等分，其中4等分中分別加入T4、FT4 、rT3 和 rT4純品至表2所示濃度。5份樣本在本試劑盒的復(fù)孔測定濃度及計算的交叉反應(yīng)率，符合試劑盒設(shè)計要求，見表2。

表2 試劑盒特異性測定Table 2 Determination of specificity of the kit

2.5 測量準(zhǔn)確度-回收實驗

將FT3樣本分成每份1 mL的3等分，向其中2份分別加入11 pmol/L和35.2 pmol/L的FT3標(biāo)準(zhǔn)液各0.1 mL至理論濃度分別為4.7 pmol/L、6.9 pmol/L，作為回收樣本；向另一份樣本加入0.1 mL無FT3的溶劑，作為本底樣本。3份樣本在本試劑盒的復(fù)孔測定濃度及計算的回收率，實驗結(jié)果符合試劑盒設(shè)計要求，見表3。

2.6 穩(wěn)定性

取自制同一批次的3盒試劑分別做以下處理，即運(yùn)輸7天、加速降解以及標(biāo)準(zhǔn)品的反復(fù)凍融，從實驗結(jié)果觀察，參考標(biāo)準(zhǔn)品的各點熒光值無明顯變化，且本底熒光值無明顯升高或降低。表明試劑盒參考標(biāo)準(zhǔn)曲線無明顯漂移，滿足試劑盒穩(wěn)定性要求。

2.7 正常值參考范圍

取已確診為甲狀腺功能正常的500份正常人血清樣本，其中男性214例（年齡17～63歲），女性286例（年齡15～69歲）。用本試劑盒檢測，統(tǒng)計得出500份正常人血清的均值（x）為4.85 pmol/L，標(biāo)準(zhǔn)差（s）為0.825，根據(jù)正常范圍確定標(biāo)準(zhǔn)為x±2s，統(tǒng)計確定正常參考范圍為：3.2～6.5 pmol/L。各實驗室在使用該試劑盒進(jìn)行FT3濃度測定時，應(yīng)根據(jù)各地區(qū)標(biāo)本的差異設(shè)定自己的參考值范圍。

表1 精密度測定Table 1 Determination of precision

表3 試劑盒回收率測定Table 3 Determination of recovery rates of the kit

2.8 與化學(xué)發(fā)光免疫測定法的比較

應(yīng)用自制TRFIA試劑盒與SIEMENS公司的試劑盒對臨床血清樣本的FT3濃度進(jìn)行檢測，比較2種試劑盒的檢測性能，見表4、5與圖2。

圖2 自制試劑盒與西門子試劑盒血樣測試相關(guān)回歸分析（相關(guān)系數(shù)r=0.992，P＜0.05）Figure 2 Analysis of correlation between home-made and SIEMES FT3 kit (correlation coefficient r=0.992, P＜0.05)

3 討論

T3是一種控制代謝活動的重要的激素。大約80%的T3與甲狀腺結(jié)合球蛋白（TBG）結(jié)合，其余與甲狀腺素結(jié)合前體蛋白或血清蛋白結(jié)合。約0.3%的T3以游離形式存在。研究表明，只有FT3，才能起到代謝控制活性。T3是評價甲狀腺功能的重要臨床指標(biāo)，對甲亢、甲低（尤其是甲亢）等甲狀腺疾病的診斷和療效監(jiān)測有重要的臨床意義。

Potlukova等[1]對橋本甲狀腺炎（Hashimoto's thyroiditis，HT）的研究發(fā)現(xiàn)，該病患者血清C1q抗體水平與FT3、FT4呈負(fù)相關(guān)，與TSH呈正相關(guān)。

Graves病是一種自身免疫性甲狀腺功能紊亂疾病，為在遺傳易感人群中免疫調(diào)節(jié)缺陷所致，從而導(dǎo)致甲狀腺刺激性的抗體產(chǎn)生。在美國，1.3%的人群為甲亢（臨床的為0.5%，亞臨床的為0.7%）[2]。妊娠婦女中，Graves病甲亢的發(fā)生率為0.5%～2%，妊娠之前接受治療或者妊娠期間正在接受治療Graves病甲亢的懷孕婦女占1%[3]。即使治療會使甲狀腺功能恢復(fù)正常，但還是應(yīng)該對Graves病甲亢患者持續(xù)監(jiān)測甲狀腺功能[4]。Graves等T3型甲亢的診斷中，F(xiàn)T3的測定具有重要意義，其診斷標(biāo)準(zhǔn)為T4、FT4正常或偏低，而T3、FT3升高。

Kim等[5]的研究結(jié)果顯示，在亞臨床甲狀腺功能減退癥患者及甲狀腺功能正常人群中，游離甲狀腺激素與胰島素抵抗相關(guān)，多項研究表明甲狀腺功能減退癥、亞臨床甲狀腺功能減退癥及甲狀腺功能正常人群甲狀腺激素降低胰島素敏感性，增加胰島素抵抗[6～7]，而胰島素抵抗可導(dǎo)致血糖升高。另外，有研究證實糖尿病患者甲狀腺疾病的發(fā)生率顯著增高[8]。

甲狀腺激素對腎臟的生長發(fā)育起促進(jìn)作用，同時影響腎臟代謝與清除，因此腎臟病變也會導(dǎo)致甲狀腺素的顯著變化[9]，F(xiàn)T3的測定對于一些腎臟疾病起一定的輔助診斷作用。

此外，有研究表明危重患者血清T3、FT3、T4下降幅度與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)[10]。

在許多臨床條件下，如妊娠、病毒性肝炎、遺傳性TBG增多癥、低蛋白血癥、遺傳性TBG缺乏癥和多種藥物（如激素、糖皮質(zhì)激素、生長激素等）刺激時，載體蛋白的濃度會發(fā)生變化，因此即使當(dāng)甲狀腺功能正常時，總T3的濃度也會隨著載體蛋白濃度的改變而發(fā)生變化[11]。然而FT3濃度不受載體蛋白濃度的影響，因此檢測FT3能更客觀、更真實地反映機(jī)體代謝狀況。

表4 自制試劑盒與SIEMENS化學(xué)發(fā)光試劑盒的性能比較Table 4 Performance comparison of home-made and SIEMENS CLIA kit

表5 自制試劑盒與西門子化學(xué)發(fā)光試劑盒的檢測效能比較Table 5 Power of test comparison of home-made and SIEMENS CLIA kit

TRFIA是繼放射免疫、酶免疫、熒光免疫、化學(xué)發(fā)光免疫測定之后的新一代標(biāo)記免疫測定技術(shù)，具有靈敏度高、快速、靈活、試劑無放射性污染的特點。本文所研制的FT3測定試劑盒采用了直接競爭法，即T3抗體與示蹤物耦聯(lián)，包被T3大分子結(jié)合物，與樣本中的FT3競爭結(jié)合DTTA-Eu3+標(biāo)記的T3單克隆抗體，相比第一代TRFIA減少了抗體的加入過程，使測定過程變得簡便快捷；較放射免疫分析法試劑和酶聯(lián)免疫試劑，該試劑標(biāo)記物沒有衰變期和酶的不穩(wěn)定性，其貨架期一般可達(dá)到1至1.5年，使運(yùn)輸和貯存更為方便；與國際知名品牌化學(xué)發(fā)光試劑盒的性能比較顯示：靈敏度、批內(nèi)精密度相仿；自制試劑盒檢測線性范圍為1.5～70 pmol/L，接近SIEMENS試劑盒的2～80 pmol/L；兩者對樣品的檢測效能呈顯著相關(guān)性，YTRFIA=1.0404X化學(xué)發(fā)光-0.1467，r= 0.992，P＜0.05；有文獻(xiàn)報道，在檢測甲狀腺功能血清學(xué)項目（TSH、FT3、FT4）上TRFIA完全能夠替代放射免疫分析法，還具有精密度及靈敏度高,抗干擾能力強(qiáng),可報告范圍寬等優(yōu)點。TRFIA與CLIA在FT3檢測上的靈敏性、準(zhǔn)確性基本相當(dāng)，在臨床上可互為補(bǔ)充。相比進(jìn)口昂貴的FT3試劑和設(shè)備，試劑盒和時間分辨免疫分析系統(tǒng)均能實現(xiàn)國產(chǎn)化，價格比進(jìn)口CLIA FT3測定試劑盒低2～3倍，且采用板式微孔反應(yīng)板，反應(yīng)時間為1小時，批檢樣本數(shù)量50份以上就能比CLIA或電化學(xué)發(fā)光法更節(jié)約時間成本，更適合我國國情發(fā)展需要。

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