螺旋藻優(yōu)良藻株的選育

吳曉娟，鐘華，劉海燕，顧繼銳，羅國(guó)強(qiáng)

(通威股份有限公司，四川 成都，610041)

螺旋藻是一種多細(xì)胞的絲狀藍(lán)藻，屬藍(lán)藻門、藍(lán)藻綱、顫藻目、顫藻科、螺旋藻屬［1］。螺旋藻的蛋白質(zhì)含量高達(dá)60% ～70%，氨基酸種類齊全，其中8 種營(yíng)養(yǎng)必需氨基酸組成平衡，除蛋氨酸含量略低外，其他氨基酸的含量均超過了FAO 推薦的標(biāo)準(zhǔn)［2］。此外，螺旋藻還含有豐富的維生素、生物色素、微量元素、不飽和脂肪酸等物質(zhì)［2］，具有極高的營(yíng)養(yǎng)和保健價(jià)值。因此，螺旋藻在醫(yī)藥保健、食品、飼料添加、水產(chǎn)養(yǎng)殖、化妝品、精細(xì)化工、廢水處理等方面得到廣泛的應(yīng)用。

目前螺旋藻已進(jìn)入大規(guī)模養(yǎng)殖和開發(fā)利用階段，養(yǎng)殖基地主要分布在中國(guó)、墨西哥、美國(guó)、泰國(guó)、日本、以色列等國(guó)家和地區(qū)。我國(guó)有螺旋藻養(yǎng)殖基地60 余家，養(yǎng)殖面積約7 500 000 m2，年產(chǎn)量約為9 600 t，年產(chǎn)值估計(jì)超過40 億元［3］。

但螺旋藻生產(chǎn)中仍存在著藻種混雜退化、生長(zhǎng)慢、單位面積產(chǎn)量低、質(zhì)量不穩(wěn)定、加工程度低和產(chǎn)后的廢水難于處理等問題，嚴(yán)重阻礙螺旋藻產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。在相同的培養(yǎng)條件下，不同的螺旋藻藻株的生長(zhǎng)速度和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的含量都會(huì)有差異［4－6］。目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者采用馴化、自然選擇、物理或化學(xué)誘變、基因工程等方法已篩選出一些新品系。譚桂英等［4］通過逐級(jí)稀釋法，獲得了不同形態(tài)大小的鈍頂螺旋藻藻絲體6 株，其中S6 具有個(gè)體大，易上浮，生長(zhǎng)速度快(生長(zhǎng)率0.2137)，蛋白質(zhì)含量高(69.1%)，經(jīng)海水馴化，能在海水中良好生長(zhǎng)等特點(diǎn)。殷春濤等［5］等將5 個(gè)鈍頂螺旋藻品系進(jìn)行單種分離和擴(kuò)大培養(yǎng)，篩選出1 株耐高溫且溫度適應(yīng)范圍廣(9 ～45 ℃)、蛋白質(zhì)(63.37%)和不飽和脂肪酸含量高的優(yōu)良螺藻品系。宋玉鳳等［6］通過富集和稀釋平板分離出9 株螺旋藻，篩選出1 株生長(zhǎng)較快、藻體粗壯的螺旋藻藻種(SP06)，在最佳條件下培養(yǎng)8 d 每升養(yǎng)殖水可收獲濕藻46 ～48 g。因此，在螺旋藻工業(yè)化生產(chǎn)中，篩選高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的螺旋藻藻種是當(dāng)前提高螺旋藻產(chǎn)業(yè)發(fā)展的一個(gè)重大課題，也是提高產(chǎn)量和改善產(chǎn)品質(zhì)量的基礎(chǔ)。

本研究考察了不同來源的5 株螺旋藻藻株在生長(zhǎng)速率、光能利用率、上浮性、色素、蛋白質(zhì)以及藻藍(lán)蛋白含量等的差異，以蛋白質(zhì)含量和生長(zhǎng)速率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用綜合評(píng)分法，篩選較為理想的螺旋藻藻株，以期獲得可供開發(fā)利用的螺旋藻株系，并提供篩選方法。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 藻種

螺旋藻:所用螺旋藻藻株為S1、S2、S3、S4、S5。其中S1、S5 分離自山東威海的極大螺旋藻，S2 為汕頭大學(xué)所贈(zèng)的鈍頂螺旋藻，S3 為引自中國(guó)科學(xué)院武漢水生生物研究所的極大螺旋藻，S4 為引自中國(guó)科學(xué)院武漢水生生物研究所的鈍頂螺旋藻。

1.2 培養(yǎng)基

培養(yǎng)基為Zarrouk 配方［7］。

1.3 培養(yǎng)方法

將處于對(duì)數(shù)期的不同螺旋藻藻株接種到Zarrouk培養(yǎng)液中，以500 mL 的錐形瓶培養(yǎng)300 mL 螺旋藻液，在光照培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，調(diào)整接種密度OD5600.1，溫度30 ℃，光照強(qiáng)度7 000 Lx，光照周期L∶D=12 h∶12 h，每天搖動(dòng)培養(yǎng)瓶4 次。

1.4 細(xì)胞濃度以及生物量的測(cè)定

取定量的藻液過濾到已知干重的濾膜上，用蒸餾水沖洗掉藻體上附著的鹽分，放入烘箱中經(jīng)80 ℃烘干24 h，放在干燥皿中冷卻至少20 min 后，經(jīng)電子天平稱重并減掉濾紙重量后，即得到藻細(xì)胞的生物量［8］。以新鮮培養(yǎng)基為空白，將藻液混勻后測(cè)定其560 nm 波長(zhǎng)下的吸光度OD560，即得到藻細(xì)胞的濃度。

1.5 光能利用率

根據(jù)能量守恒定律確定藻細(xì)胞的能量轉(zhuǎn)換關(guān)系確定光能利用率Ψ 的計(jì)算［9］:

其中，Pb:單位體積增加干重;Hbiomass:藻細(xì)胞燃燒熱值;Fvol:單位體積接收的光能(球狀PAR 輻射測(cè)量?jī)x測(cè)定光量子后計(jì)算)。

1.6 藻細(xì)胞蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

采用考馬斯亮藍(lán)法［10］。取一定量的藻液過濾，無菌水沖洗后進(jìn)行冷凍干燥。精確稱取一定量的螺旋藻冷凍干燥粉，加1 mL 水用研缽進(jìn)行研磨，然后置－20 ℃冰箱中冷凍后30 ℃解凍，然后再研磨，如此3次(直至顯微鏡下觀察全部細(xì)胞破碎為止)，最后定容至20 mL，離心(5 500 r/min，10 min)，取上清液。取樣品提取液0.1 mL 放入具塞試管中，加入0.9 mL蒸餾水稀釋10 倍，再加入5 mL 考馬斯亮藍(lán)G －250試劑，充分混合，放置5 min 后用1 cm 光徑比色杯在595 nm 下比色，記錄OD595，并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測(cè)樣品提取液中蛋白質(zhì)的含量。

1.7 藻膽蛋白的測(cè)定

精確稱取一定量的螺旋藻冷凍干燥粉，加入1 mL 磷酸緩沖液(含0.2 mol/L NaCl，pH 6.7)，用研缽進(jìn)行研磨，然后置－20 ℃冰箱中冷凍后30 ℃解凍，然后再研磨，如此3 次(直至顯微鏡下觀察全部細(xì)胞破碎為止)，最后定容至20 mL，離心(5 500 r/min，10 min)，取上清夜測(cè)定其吸收光譜，根據(jù)公式計(jì)算藻藍(lán)蛋白PC、別藻藍(lán)蛋白APC 含量，螺旋藻藻膽蛋白PBP 含量為藻藍(lán)蛋白PC、別藻藍(lán)蛋白APC 之和，然后再換算成單位質(zhì)量藻粉的含量。

1.8 藻絲浮性

為了估算不同藻株藻絲的浮性，每個(gè)處理取8 ～10 mL 藻液倒進(jìn)透明的試管中，混合均勻后在室內(nèi)條件下靜置1 h。然后測(cè)定上下半部的吸光度(以水柱中線為準(zhǔn)，位于以上的為上部，否則認(rèn)為位于下部)，分別記為DU 和DL，而藻絲的浮性(flotation activity，F(xiàn)A)則根據(jù)下式計(jì)算［13］:

1.9 色素

取一定量的藻液過濾，加入純甲醇溶液置于4℃的低溫條件下過夜，離心(4 000 r/min，10 min)，取上清液，用分光光度計(jì)測(cè)定特定波長(zhǎng)的吸光度值，根據(jù)公式計(jì)算葉綠素a(chl a)含量、類胡蘿卜素(Car)含量，然后再換算成單位質(zhì)量藻粉的色素含量。

1.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

用單因素方差分析(one-way ANOVA)和多重比較中的T-test 對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以0.05 和0.01為差異顯著水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 5 株螺旋藻的生長(zhǎng)特性

各藻株均經(jīng)過3 d 的延滯期后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在培養(yǎng)的9 d 內(nèi)，各藻株一直在快速地生長(zhǎng);各螺旋藻藻株S1、S2、S3、S4、S5，其吸光度值OD560從開始的0.1 分別上升至1.52、1.20、1.68、1.54、1.52，其中以S3 的吸光度值最高(圖1)。螺旋藻藻株S3 和S5 的生長(zhǎng)速率最高，為0.11 g/(L·d)，其次為S1，達(dá)到0.087 g/(L·d)(表1)，其中S3、S5 的生長(zhǎng)速率分別為S1、S2、S4 的1.22、1.57、1.38 倍，各組間差異極其顯著(One － way ANOVA，P＜0.01)。吸光度值OD560、生長(zhǎng)速率的高低反應(yīng)了藻的生長(zhǎng)繁殖快慢。從生長(zhǎng)特性看，螺旋藻藻株S3、S5 的生長(zhǎng)最快，具有生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。

圖1 5 株螺旋藻藻株的生長(zhǎng)曲線Fig.1 The growth curve of 5 Spirulina strains

表1 5 株螺旋藻藻株的生長(zhǎng)和蛋白質(zhì)含量Table 1 The growth rate and protein content of 5 Spirulina strains

2.2 5 株螺旋藻的光能利用率

就光合自養(yǎng)生物而言，限制其生長(zhǎng)量的最終的因素是光能利用率［16］。因此，光能利用率是衡量微藻生長(zhǎng)能力的一個(gè)重要指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)中，各螺旋藻藻株S1、S2、S3、S4、S5，9 d 平均的光能利用率分別為1.51%、1.26%、1.91%、1.32%、1.94% (圖2)。其中S3、S5 光能利用率最高。這說明在這5 株螺旋藻中，螺旋藻S3、S5 可以更為有效的利用光能，降低工業(yè)化生產(chǎn)過程中的能耗成本。

圖2 5 株螺旋藻藻株的光能利用率Fig.2 The light use efficiency of 5 Spirulina strains

2.3 5 株螺旋藻的蛋白質(zhì)含量

螺旋藻在食品、飼料添加等方面已得到廣泛的應(yīng)用，主要是由于螺旋藻的蛋白質(zhì)含量高達(dá)60% ～70%［2］，而食用螺旋藻粉要求蛋白質(zhì)含量高于55%［17］，因此螺旋藻的蛋白質(zhì)含量是評(píng)價(jià)其產(chǎn)品質(zhì)量的最重要的參數(shù)之一。5 株螺旋藻的蛋白質(zhì)含量比較見表1。由表1 可知，5 株螺旋藻的蛋白質(zhì)含量均高于55%，其中螺旋藻藻株S2 在5 株螺旋藻藻種的含量最高，S4 次之，其他3 株無顯著差異。

2.4 5 株螺旋藻藻膽蛋白含量的比較

藻膽蛋白(PBP)是強(qiáng)熒光的色素－蛋白絡(luò)合物，是螺旋藻中重要的捕光色素蛋白，既可作為天然色素，也可以用作制造熒光探針的原料，還具有一些獨(dú)特的藥用價(jià)值。因此，螺旋藻中藻膽蛋白含量是衡量螺旋藻藻株性能的優(yōu)良指標(biāo)。螺旋藻藻膽蛋白主要為藻藍(lán)蛋白和別藻藍(lán)蛋白。各螺旋藻藻株S1、S2、S3、S4、S5 的藻藍(lán)蛋白(PC)含量分別為3.13%、2.94%、2.81%、3.37%、2.99%，別藻藍(lán)蛋白(APC)含量分別為3.08%、5.69%、5.28%、4.59%、4.77%(圖3)。藻藍(lán)蛋白、別藻藍(lán)蛋白含量最高的分別為S4、S2。S3 的藻藍(lán)蛋白含量最低，但其別藻藍(lán)蛋白含量較高。而藻膽蛋白含量最高的是S2，其次為S3。

圖3 5 株螺旋藻藻株的藻膽蛋白含量Fig.3 The phycobiliprotein content of 5 Spirulina strains

2.5 5 株螺旋藻藻絲浮性的比較

藻絲浮性對(duì)藻絲調(diào)節(jié)其在水體中的位置非常重要，并且在其養(yǎng)殖采收過程中也扮演著重要的角色［18］。靜置前，各種螺旋藻的藻絲均勻分布于藻液中，而靜置1h 后，可看到有較多的藻絲互相纏繞，呈絮狀聚集于藻液的上層及液面。各螺旋藻藻株S1、S2、S3、S4、S5 的藻絲浮性分別為67.32%、70.69%、86.82%、64.17%、74.86%(圖4)。S3 的藻絲浮性分別是的1.29、1.23、1.35、1.16 倍，具有極其顯著的差異(T-test，P＜0.01)?？梢?，在采收過程中S3 將更具有優(yōu)勢(shì)。

圖4 5 株螺旋藻藻株的藻絲浮性Fig.4 The flotation activity of 5 Spirulina strains

2.6 5 株螺旋藻色素含量的比較

螺旋藻細(xì)胞中的色素能作為食品、飼料和化妝品等的色素添加劑，可以使觀賞魚的體色鮮艷。因此，螺旋藻細(xì)胞中的色素積累是衡量螺旋藻藻株品質(zhì)優(yōu)劣的重要指標(biāo)，而且食用螺旋藻粉要求類胡蘿卜素(Car)含量高于2 mg/g［17］。各螺旋藻藻株S1、S2、S3、S4、S5 的葉綠素a(chl a)含量分別為25.67、22.69、26.85、29.60、19.02 mg/g，類胡蘿卜素(Car)含量高于3.67 mg/g，均超過食用螺旋藻粉的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)要求(圖5)。其中葉綠素a(chl a)、類胡蘿卜素(Car)含量最高的分別為S4、S2，而S3 的葉綠素a(chl a)、類胡蘿卜素(Car)含量均較高。

圖5 5 株螺旋藻藻株的色素含量Fig.5 The pigments content of 5 Spirulina strains

2.7 綜合評(píng)價(jià)

綜合評(píng)分法是當(dāng)評(píng)價(jià)指標(biāo)無法用統(tǒng)一的量綱進(jìn)行定量分析時(shí)使用的一種分析方法。評(píng)分時(shí)以各指標(biāo)的最大值為參照將數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化，再給每個(gè)指標(biāo)一個(gè)權(quán)重，權(quán)重的大小根據(jù)各指標(biāo)在總體中的貢獻(xiàn)比重給定。參照胡海燕等［19］的綜合評(píng)價(jià)方法，以螺旋藻的蛋白質(zhì)含量和生長(zhǎng)速率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，權(quán)重系數(shù)分別設(shè)為0.6 和0.4，綜合評(píng)分M=0.6 ×蛋白質(zhì)含量×100/蛋白質(zhì)含量最大值+0.4 ×生長(zhǎng)速率×100/生長(zhǎng)速率最大值。

由表1 的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，螺旋藻S3 的生長(zhǎng)速率、蛋白質(zhì)產(chǎn)率和綜合評(píng)分最高，分別為0.11 g/(L·d)、0.064 g/(L·d)、89.33。因此，螺旋藻S3可以作為工業(yè)化培養(yǎng)的藻株。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過比較各螺旋藻株的主要生長(zhǎng)性能和品質(zhì)(生長(zhǎng)、光能利用率、蛋白質(zhì)、藻藍(lán)蛋白、別藻藍(lán)蛋白、藻絲浮性、色素)，并采用綜合評(píng)分法，從5 株螺旋藻中篩選出1 株優(yōu)質(zhì)藻株S3。此藻株主要具有以下特點(diǎn):

(1)生長(zhǎng)速度快。體現(xiàn)在其OD560吸光度值、生長(zhǎng)速率、光能利用率均最高。

(2)蛋白質(zhì)、藻膽蛋白含量較高。干重的增長(zhǎng)速率和蛋白質(zhì)含量的綜合評(píng)分最高。

(3)上浮性好。由于藻絲螺旋形，互相纏繞，呈絮狀漂浮在水面，較易采收。

(4)色素含量較高。

［1］ 胡鴻鈞，魏印心. 中國(guó)淡水藻類－ 系統(tǒng)、分類及生態(tài)［M］． 北京:科學(xué)出版社，2006:142 －143.

［2］ 陳峰，姜悅. 微藻生物技術(shù)［M］． 北京:中國(guó)輕工業(yè)出版社，1999:106 －111.

［3］ 張學(xué)成，薛命雄. 我國(guó)螺旋藻產(chǎn)業(yè)的現(xiàn)狀和發(fā)展?jié)摿Γ跩］． 生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)，2012，2(3):47 －53.

［4］ 譚桂英，周百成．鈍頂螺旋藻優(yōu)良品系S6 的生長(zhǎng)特性及光合特性的研究［J］．海洋學(xué)報(bào)(中文版)，1993，15(3):89 －93.

［5］ 殷春濤，龔小敏，胡鴻鈞，等．適合于咸寧基地生產(chǎn)的螺旋藻品系的選育研究［J］． 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，1998，9(2):222 －224.

［6］ 宋玉鳳，馬光庭，韓宇. 螺旋藻的分離篩選及培養(yǎng)條件的選擇［J］． 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2009，28(2):335－338.

［7］ Zarrouk. Contribution a letude d’une cyanophycee，Influence de divers factours physiques. et chimiques sur la croissance et la phytosynthese doSpirulina maxima［M］．Paris:University of Paris，1966.

［8］ Gao Kun－sun，Ma Zeng－ling. Photosynthesis and growth ofArthrospira(Spirulina)platensis(Cyanophyta)in response to solar UV radiation，with special reference to its minor variant［J］． Environmental and Experimental Botany，2008，63(1 －3):123 －129.

［9］ Hall D O，Cién Fernández F G，anizares Guerrero E，et al. Outdoor helical tubular photobioreactors for microalgal production:Modeling of fluid－dynamics and mass transfer and assessment of biomass productivity［J］． Biotechnology Bioengineering，2003，82(1):62 －73.

［10］ 王孝平，邢樹禮. 考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白含量的研究［J］． 天津化工，2009，23(3):40 －41.

［11］ Siegelman H W，Chapman D J，Cole W J. The bile pigments of plants［J］． Biochemical Society Symposium，1968，28:107 －120.

［12］ Bennet A，Bogard L. Complementary chromatic adaptation in a filamentous blue－green alga［J］． Journal of Cell Biology，1973，58(2):419 －435.

［13］ Ma Zeng－ling，Gao Kun －sun. Photosynthetically active and UV radiation act in an antagonistic way in regulating buoyancy ofArthrospira(Spirulina)platensis(cyanobacterium)［J］． Environmental and Experimental Botany，2009，66(2):265 －269.

［14］ Porra R J. The chequered history of the development and use of simultaneous equations determination of chlorophylls a and b［J］． Photosynthesis Research，2002，73(1－3):149 －156.

［15］ Parsons T R，Strickland J D H. Discussion of spectrophotometric determination of marine plant pigments，with revised equation for ascertaining chlorophylls and carotenoids［J］． Journal of Marine Research，1963，21(3):155－163.

［16］ 李師翁，李虎乾，張建軍. 小球藻大規(guī)模培養(yǎng)研究的進(jìn)展［J］． 植物學(xué)通報(bào)，1998，15(4):45 －50.

［17］ GB/T16919 －1997. 食用螺旋藻粉.

［18］ Kim S G，Choi A，Ahn C Y，et al. Harvesting ofSpirulina platensisby cellular flotation and growth stage determination［J］． Letters in Applied Microbiology，2005，40(3):190 －194.

［19］ 胡海燕，張靜，徐晶，等. 螺旋藻培養(yǎng)液中碳、氮、磷的優(yōu)化及其效應(yīng)評(píng)價(jià)［J］． 食品科技，2012，37(1):29 －33.