SmartAmp快速檢測(cè)技術(shù)及其應(yīng)用

戚麗華，張傳福，史云，胡曉豐，宋宏彬，劉雪林

軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 疾病預(yù)防控制所，北京 100071

SmartAmp(smart amplification process)技術(shù)是日本學(xué)者M(jìn)itani等于2007年首先報(bào)道的一種新的DNA等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)。根據(jù)目標(biāo)序列設(shè)計(jì)5條引物，在Aac DNA聚合酶的作用下實(shí)現(xiàn)自循環(huán)鏈置換反應(yīng)，并通過引物上結(jié)合的雜交敏感的熒光染料實(shí)現(xiàn)對(duì)擴(kuò)增過程的監(jiān)測(cè)[1]。和其他檢測(cè)方法相比，Smart?Amp技術(shù)具有快速、精確、靈敏、特異、背景低、成本低等優(yōu)點(diǎn)[2]，目前在基因多態(tài)性分析、感染性疾病診斷，以及食品、環(huán)境中病原體快速檢測(cè)等方面已有初步應(yīng)用，并顯示了很好的應(yīng)用前景。

1 SmartAmp技術(shù)原理

SmartAmp技術(shù)的基本原理，即獲取目標(biāo)序列后在等溫條件下對(duì)其反復(fù)進(jìn)行擴(kuò)增，并通過熒光實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，以檢測(cè)目標(biāo)序列的存在。根據(jù)目標(biāo)序列保守區(qū)域設(shè)計(jì) turnback primer(TP)、forward primer(FP)、boost primer(BP)、outer primer 1(OP1)、outer primer 2(OP2)等共5條引物[3]。TP由退火序列和一段能夠與目標(biāo)序列互補(bǔ)的核苷酸序列構(gòu)成，F(xiàn)P帶有一個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)，它們的退火位點(diǎn)分別位于目標(biāo)序列的兩端，可分別從兩端與互補(bǔ)的2條DNA單鏈退火，向?qū)?cè)延伸。OP1和OP2的退火位點(diǎn)分別位于TP和FP外側(cè)，向中間退火延伸的同時(shí)將TP和FP延伸得到的雙鏈剝離。帶有TP或FP的單鏈被置換下來后又可作為模板，繼續(xù)上述過程，如此可形成2種關(guān)鍵的單鏈中間產(chǎn)物，這2種中間產(chǎn)物繼而分別以TP和FP的特殊結(jié)構(gòu)為起點(diǎn)，進(jìn)行自身引導(dǎo)的DNA合成。這樣循環(huán)往復(fù)，在Aac DNA聚合酶的作用下引起自循環(huán)鏈置換反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)序列的大量擴(kuò)增[4]。在此過程中，其中一條引物上結(jié)合一種雜交敏感的熒光引物，一旦與互補(bǔ)序列退火雜交，即可發(fā)出一定強(qiáng)度的熒光，由實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀監(jiān)測(cè)。隨著擴(kuò)增反應(yīng)的進(jìn)行，熒光強(qiáng)度增大，當(dāng)超過檢測(cè)最低閾值時(shí)即可確定擴(kuò)增反應(yīng)的實(shí)現(xiàn)，也即目標(biāo)序列的存在[1]。整個(gè)過程在60℃恒溫條件下30～40 min即可完成[3]。

2 SmartAmp技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)

SmartAmp技術(shù)具有獨(dú)特的錯(cuò)配抑制技術(shù)，能夠識(shí)別單個(gè)核苷酸的差異。首先，反應(yīng)使用了5條不對(duì)稱引物，當(dāng)DNA鏈與任何一條引物不匹配時(shí)，就會(huì)阻止后續(xù)的擴(kuò)增反應(yīng)。另外反應(yīng)體系中還加入了錯(cuò)配結(jié)合蛋白Taq MutS，如果引物出現(xiàn)單個(gè)堿基的錯(cuò)配，Taq MutS即結(jié)合到錯(cuò)配區(qū)域，使擴(kuò)增反應(yīng)停止[5]，不再有熒光產(chǎn)生。SmartAmp的這一特點(diǎn)使得它能夠檢測(cè)出單個(gè)核苷酸的差異，從而成為單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)的有力方法。這也是與其他等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，如環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增、鏈置換擴(kuò)增、核酸序列擴(kuò)增、轉(zhuǎn)錄酶擴(kuò)增、滾環(huán)擴(kuò)增、解鏈酶擴(kuò)增等相比，SmartAmp最為明顯的優(yōu)點(diǎn)。在病原微生物的檢測(cè)方面，SmartAmp也能夠降低其他污染的影響。

SmartAmp技術(shù)不需要核酸純化，在檢測(cè)過程中使用的Aac DNA聚合酶具有很強(qiáng)的抑制細(xì)胞污染物影響的能力，只需要一個(gè)簡單的熱處理使DNA和蛋白質(zhì)變性(如血樣，98℃ 3 min)，即可直接分析臨床樣品。而PCR所用的Taq DNA聚合酶，極易因樣品不純而受到抑制，必須進(jìn)行DNA純化[1]。2009年，Victor等還提出使用一種SmartAmp等溫裂解緩沖液(SmartAmp isothermal lysis buffer，SIL-B)，它能夠在60℃下溶解血細(xì)胞，使DNA變性，這樣就可以實(shí)現(xiàn)完全的等溫?cái)U(kuò)增[6]。

SmartAmp技術(shù)具有較低的背景。在其等溫?cái)U(kuò)增過程中使用的雜交敏感的熒光引物，相當(dāng)于一種序列特異性染料，一旦與互補(bǔ)序列雜交，引物上的熒光即向?qū)崟r(shí)PCR儀提供信號(hào)[1]。它在低背景下顯示了很高的信號(hào)強(qiáng)度，大大提高了反應(yīng)的信噪比。檢測(cè)的特異性和靈敏度也隨之增強(qiáng)[7]。

SmartAmp技術(shù)與傳統(tǒng)的檢測(cè)基因多態(tài)性的方法，如DNA芯片、限制性片段長度多態(tài)性PCR(PCR-RFLP)、等位基因特異性多 PCR(AS-PCR)、Se?quenom、TaqMan探針、Invader等相比，具有簡單、快速、成本低、靈敏度高等明顯優(yōu)勢(shì)。它的出現(xiàn)，使得臨床上檢測(cè)基因多態(tài)性，而后制定個(gè)體化治療方案、給出相應(yīng)生活方式建議這一發(fā)展趨勢(shì)更加現(xiàn)實(shí)可行[5]，能夠極大地促進(jìn)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展。

SmartAmp同樣可以用來檢測(cè)臨床樣本、食物、環(huán)境中的病原體[3,8]。目前常用的病原體檢測(cè)方法有培養(yǎng)法、噬菌體法、電化學(xué)方法、基因芯片、免疫學(xué)方法、PCR及同樣為等溫?cái)U(kuò)增的LAMP等，與這些方法相比，SmartAmp技術(shù)具有快速、簡單、成本低等明顯優(yōu)勢(shì)。各種方法的詳細(xì)比較見表1。

SmartAmp還可通過一步法對(duì)RNA進(jìn)行擴(kuò)增，稱為RT-SmartAmp，由Kawai等設(shè)計(jì)并應(yīng)用于2009年大流行的甲型流感H1N1病毒的快速檢測(cè)中[3]。只需在反應(yīng)體系中加入禽骨髓細(xì)胞瘤病毒(AMV)反轉(zhuǎn)錄酶，即可將RNA反轉(zhuǎn)錄和DNA擴(kuò)增合為一步。

另外，在臨床上還可以通過一種連接了電荷耦合相機(jī)的數(shù)字過程進(jìn)行檢測(cè)，使用96孔板或384孔板及自動(dòng)化分裝單元能夠顯著增加處理量[7]，這樣可極大地提高檢測(cè)效率，進(jìn)一步降低檢測(cè)成本。

3 SmartAmp技術(shù)的應(yīng)用

SmartAmp作為一種新的DNA等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，由于其具有簡單、快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高[1,3,5]的特點(diǎn)，目前已在感染性疾病診斷、基因快速篩查、個(gè)體化用藥等方面得到日益廣泛的應(yīng)用。

3.1 感染性疾病診斷

SmartAmp技術(shù)能夠用于細(xì)菌、病毒等病原體的快速檢測(cè)。依據(jù)其具有識(shí)別出單個(gè)核苷酸差異的能力，不同型別的菌毒株和耐藥的變異菌毒株也都能同時(shí)被快速檢測(cè)出來[6]。日本學(xué)者Kawai等在2009年將一步法RT-SmartAmp技術(shù)運(yùn)用到當(dāng)年大流行的甲型流感H1N1病毒的檢測(cè)中[3]，并與廣泛使用的流感快速診斷試驗(yàn)進(jìn)行了比較，顯示SmartAmp方法在疾病早期即能檢出病毒，可同時(shí)區(qū)分2009年甲流毒株H1N1和季節(jié)性H1N1毒株，并且靈敏度高，有較好的特異性，是用于臨床H1N1流感病毒快速檢測(cè)的有效手段。

表1 病原體不同檢測(cè)方法比較

3.2 快速基因篩查

我們知道肥胖、心臟疾病、慢性炎性疾病等與患者的基因多態(tài)性有關(guān)，SmartAmp技術(shù)可以分析這些基因標(biāo)志，臨床的起始材料可以是血樣、口腔拭子或指甲屑等。一旦知道了基因標(biāo)志，SmartAmp技術(shù)就是一種非常簡單、準(zhǔn)確度高、成本低的快速基因篩查方法[8]。目前將SmartAmp技術(shù)應(yīng)用到此方面的研究相對(duì)較多[19-22]，如2009年Toyoda等用此方法分析發(fā)現(xiàn)了ABCC11基因野生型538G的等位基因538G＞A和耳垢類型、腋臭、肺癌風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)[19]；2011年，Azuma等利用此方法對(duì)人CYP2A6基因進(jìn)行了分型，這種基因的多態(tài)性被認(rèn)為是日本男性吸煙者發(fā)生煙草相關(guān)肺癌的決定性因素[22]。

3.3 指導(dǎo)個(gè)體化用藥

患者的遺傳學(xué)特征可決定機(jī)體對(duì)于藥物和臨床治療的反應(yīng)。檢測(cè)患者疾病相關(guān)基因的多態(tài)性，而后據(jù)此制定個(gè)體化治療方案，是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展方向[6]。然而，目前多數(shù)檢測(cè)技術(shù)因?yàn)榉治鏊俣嚷?、成本高而在臨床應(yīng)用上處在瓶頸期。SmartAmp作為一種廉價(jià)快速的技術(shù)，對(duì)此領(lǐng)域起到了極大的推動(dòng)作用[23-24]。例如，2009年Mitani等用此方法分析了CYP2C9*2、CYP2C9*3和VKORC1-1639G＞A基因的攜帶情況，這3種基因的多態(tài)性對(duì)華法林(一種廣泛使用的抗凝血藥)的藥代動(dòng)力學(xué)有重要影響，對(duì)它們進(jìn)行分析有助于指導(dǎo)調(diào)整臨床用藥劑量[5]。2010年，Okada等對(duì)血樣進(jìn)行了谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶M1、T1的分型，為臨床上評(píng)估與此相關(guān)的藥物誘發(fā)肝臟毒性的易感性提供了幫助[25]。又如，ABCC4基因中攜帶2269G＞A等位基因的患者使用含硫代嘌呤藥物容易誘發(fā)造血系統(tǒng)毒性，攜帶此等位基因的患者須相應(yīng)地減少此類藥物的使用。2011年Aw等用此方法檢測(cè)了279名日本患者該等位基因的攜帶情況，指導(dǎo)了臨床用藥[23]。以上這些研究均證實(shí)了SmartAmp技術(shù)用來分析基因多態(tài)性的有效性。2008年Tatsumi等用SmartAmp技術(shù)檢測(cè)了原癌基因第12個(gè)密碼子的變異，以快速檢測(cè)胰腺癌的微小轉(zhuǎn)移灶，檢測(cè)在60 min內(nèi)完成，據(jù)此指導(dǎo)化療，能夠在很大程度上改善預(yù)后[26]。

4 SmartAmp技術(shù)的發(fā)展前景

SmartAmp作為一種新的DNA等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，自2007年開發(fā)以來，已在個(gè)體化治療、快速基因篩查、感染性疾病診斷等領(lǐng)域中顯現(xiàn)出了其實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，并證明了其具有操作簡便、用時(shí)少、成本低、靈敏度高、特異性強(qiáng)、能夠抑制背景影響等優(yōu)勢(shì)。而在食物、環(huán)境中病原體檢測(cè)方面，雖然尚未見相關(guān)研究報(bào)道，但SmartAmp方法的原理同樣適用，再加上其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，使得它在這一領(lǐng)域也呈現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。隨著相應(yīng)試劑盒的開發(fā)，SmartAmp技術(shù)有望成為一種簡易快速的常規(guī)檢測(cè)手段，具有廣闊的市場(chǎng)潛力。

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