響應(yīng)面法對出芽短梗霉黑色素提取工藝的研究

汪建明，趙 博，喬長晟

響應(yīng)面法對出芽短梗霉黑色素提取工藝的研究

汪建明1,2，趙 博1，*喬長晟2,3

(1. 食品營養(yǎng)與安全教育部重點實驗室，天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457；2. 天津北洋百川生物技術(shù)有限公司，天津 300457；3. 天津市工業(yè)微生物重點實驗室，工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457)

本研究以出芽短梗霉發(fā)酵液為原料提取黑色素，在單因素實驗基礎(chǔ)上選取實驗因素與水平，用二水平實驗確定影響黑色素色價的主要因素，然后根據(jù)Box-Behnken中心組合實驗設(shè)計原理采用三因素三水平的響應(yīng)面分析法，得到最佳提取工藝為：酸沉時間90 min、乙醇添加量93.17%、乙醇濃度90.42%。在此條件下提取黑色素色價可達44.8 μ/mL。

芽短梗霉；黑色素；響應(yīng)面法；提取

出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)又名出芽茁霉，分類屬于半知菌綱，是一種具有酵母型和菌絲形態(tài)的多形真菌，廣泛存在于植物莖、葉、果實表面及花粉、樹蜜中，耐高滲透壓[1]?？勺鳛閱渭毎鞍?、細胞壁多糖、胞外多糖、果膠酶、色素等的生產(chǎn)菌株，其主要產(chǎn)物是短梗霉多糖，另外在多糖的分泌過程中也常常會伴隨著黑色素的產(chǎn)生。黑色素() 是一類結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣的酚類或吲哚類生物大分子色素的總稱[2]。通常與蛋白質(zhì)、碳水化合物等絡(luò)合形成不同類型的生物大分子物質(zhì)，廣泛分布于動物、植物和微生物中[3]。黑色素又可分為三類：真黑色素、棕黑色素、異黑素，不同種類來源的黑色素在結(jié)構(gòu)上有著細微的差異[4]。Francesco De Angelis等人[5]從一種子囊菌的塊菌中提取異黑素，并用氣相色譜法對其進行了結(jié)構(gòu)研究，根據(jù)氣相色譜數(shù)據(jù)庫搜索結(jié)果，認為該異黑素可能為多酚氧化物。由于該實驗結(jié)果是在堿性還原條件下，在250 ℃測得的結(jié)果，而黑色素在這么高的溫度下極易發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，因此該結(jié)構(gòu)對于異黑素的結(jié)構(gòu)只具有參考價值。Nicolaus等人[6]研究了魷魚黑色素的可能結(jié)構(gòu)為吲哚環(huán)。由于天然黑色素不溶于水及有機溶劑，因此對其化學(xué)結(jié)構(gòu)的研究很困難。目前給出的有關(guān)天然黑色素的結(jié)構(gòu)還不完整，很多還只是一些基于研究結(jié)果的結(jié)構(gòu)推測。

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們對合成食用色素的安全性產(chǎn)生很大質(zhì)疑，合成色素的使用種類和數(shù)量也越來越受到限制。而天然色素以其安全可靠、色澤自然等優(yōu)點受到廣大消費者的歡迎。有些色素因兼有營養(yǎng)和藥理作用，故在食品工業(yè)中得到越來越廣泛的應(yīng)用。響應(yīng)面分析法是通過對響應(yīng)面等值線的分析，尋求最優(yōu)工藝參數(shù)，并用多元二次回歸方程來擬合因素與響應(yīng)值之間函數(shù)關(guān)系的一種統(tǒng)計方法。本研究基于對色素安全性和提取工藝的簡便性考慮，基于響應(yīng)面統(tǒng)計優(yōu)化方法，采用酸沉醇沉提取工藝，旨在提高出芽短梗霉黑色素的品質(zhì)和提取率。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)，北洋百川生物技術(shù)有限公司。

出芽短梗霉黑色素培養(yǎng)基：葡萄糖60 g/L，(NH4)2SO410 g/L，酪氨酸2.5 g/L，KH2PO40.25 g/L，牛肉膏15.08 g/L，ZnSO47 mg/L，MgSO4·7H2O 1.29 mg/L。

培養(yǎng)條件：裝液量18 L，接種量5%（v/v），溶氧20%，初始攪拌轉(zhuǎn)速400~500 r/min，與溶氧聯(lián)動，通風比1.2 vvm，培養(yǎng)溫度25℃，pH 6.0，培養(yǎng)時間3~5 d。

濃鹽酸國藥集團化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉天津市贏達稀貴化學(xué)試劑廠；無水乙醇國藥集團化學(xué)試劑有限公司；蒸餾水。

TDA-8002 水浴鍋天津中環(huán)科技開發(fā)公司；UV-2401PC 紫外可見分光光度計日本島津（SHIMADZU）公司；PHSJ-4A 數(shù)顯pH計上海雷磁儀器廠；DH-204 電熱恒溫干燥箱天津市中環(huán)實驗電爐有限公司制造；RE3000 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上海亞榮生化儀器廠；ZR-4000 超聲波清洗器蘇州富怡達超聲波有限公司；SHZ-CB 循環(huán)水式多用真空泵上海羌強儀器設(shè)備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 黑色素紫外光譜掃描

1.2.1.1 黑色素吸收光譜的測定

將黑色素樣品溶于NaOH溶液中，并以NaOH溶液作參比液，用紫外-可見分光光度計于190~600 nm處進行光譜掃描，測定黑色素的最大吸收峰值。

1.2.2 黑色素提取預(yù)實驗

1.2.2.1 酸沉醇沉和堿溶酸沉法的比較

（1）酸沉醇沉：取100 mL發(fā)酵液，用HCl（5 mol/L）調(diào)pH至2.0，充分震蕩，靜置一段時間，在攪拌的條件加入等體積無水乙醇使其充分沉淀，利用600目的濾布過濾棄上清，得黑色粗提物于50℃真空干燥至恒重。

（2）堿溶酸沉法：取發(fā)酵液100 mL，加入同等體積的NaOH（1 mol/L）溶液，充分震蕩，50℃浸提6 h后3000 r/min離心10 min，收集所有上清，用HCl調(diào)pH至2~3左右，靜置24 h，使其充分沉淀，然后在10000 r/min離心20 min，棄上清，得黑色素粗提物于80 ℃真空干燥至恒重[7]。

1.2.2.2 不同有機溶劑對醇沉效果的影響

取100 mL發(fā)酵液，用HCl（5mol/L）調(diào)pH至2.0，充分震蕩，靜置一段時間，在攪拌的條件加入體積分數(shù)分別為10%（v/v）、20%（v/v）、30%（v/v）、40%（v/v）、50%（v/v）、60%（v/v）、70%（v/v）、80%（v/v）、90%（v/v）、100%（v/v）、150%（v/v）、200%（v/v）的不同有機溶劑，觀察實驗現(xiàn)象。

1.2.3 出芽短梗霉黑色素提取單因素實驗方法

1.2.3.1 不同發(fā)酵液濃縮比對黑色素得率的影響

分別取利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，在150 r/min，60 ℃條件下，經(jīng)濃縮比分別為0 %（v/v）、10%（v/v）、20%（v/v）、30%（v/v）、40%（v/v）、50%（v/v）的發(fā)酵液100 mL，用HCl（5 mol/L）調(diào)pH至2.0，充分震蕩，靜置30 min，在攪拌的條件加入等體積無水乙醇使其充分沉淀，利用600目的濾布過濾棄上清，得黑色粗提物于50 ℃真空干燥至恒重，測定黑色素的色價及得率一進行評價。

1.2.3.2 酸沉pH對黑色素得率的影響

取發(fā)酵液100 mL，用HCl(5 mol/L)調(diào)pH分別為1、2、3、4、5，充分震蕩，靜置30 min，在攪拌的條件加入等體積無水乙醇使其充分沉淀，利用600目的濾布過濾棄上清，得黑色粗提物于50 ℃真空干燥至恒重，測定黑色素的色價及得率一進行評價。

1.2.3.3 酸沉時間對黑色素提取的影響

取發(fā)酵液100 mL，用HCl（5 mol/L）調(diào)pH至2.0，充分震蕩，分別靜置時間0、30、60、90、120 min在攪拌的條件加入等體積無水乙醇使其充分沉淀，利用600目的濾布過濾棄上清，得黑色粗提物于50 ℃真空干燥至恒重，測定黑色素的色價及得率一進行評價。

1.2.3.4 酸沉溫度對黑色素得率的影響

取發(fā)酵液100 mL，用HCl（5 mol/L）調(diào)pH至2~3左右，充分震蕩，分別在0 ℃、20 ℃、40 ℃、60 ℃、80 ℃、100 ℃的恒溫水浴中靜置30 min，在攪拌的條件加入等體積無水乙醇使其充分沉淀，利用600目的濾布過濾棄上清，得黑色粗提物于50 ℃真空干燥至恒重，測定黑色素的色價及得率一進行評價。

1.2.3.5 乙醇添加量對黑色素得率的影響

取發(fā)酵液100 mL，用HCl（5 mol/L）調(diào)pH至2~3左右，充分震蕩，靜置30 min，在攪拌的條件向其中加入20、40、60、80、100、120、140、160、180、200 mL的無水乙醇醇沉使其充分沉淀，利用600目的濾布過濾棄上清，得黑色粗提物于50 ℃真空干燥至恒重，測定黑色素的色價及得率一進行評價。

1.2.3.6 不同乙醇濃度對黑色素得率的影響

取發(fā)酵液100 mL，用HCl（5 mol/L）調(diào)pH至2~3左右，充分震蕩，靜置30 min，在攪拌的條件加入等體積濃度分別為20%（v/v）、40%（v/v）、60%（v/v）、80%（v/v）、100%（v/v）的乙醇使其充分沉淀，利用600目的濾布過濾棄上清，得黑色粗提物于50 ℃真空干燥至恒重，測定黑色素的色價及得率一進行評價。

1.2.4 最佳提取工藝的確定

以酸沉時間、乙醇添加量和乙醇濃度3個重要因素為自變量進行Box-behnken試驗設(shè)計，各因素水平及編碼值如表1。

利用軟件Design expert8.0 軟件分析各因素對出芽短梗霉黑色素提取得率的影響，找出最佳條件。

表1 響應(yīng)面試驗設(shè)計各因素及水平

1.2.5 色價的測定方法

發(fā)酵液的預(yù)處理：發(fā)酵液5000 r/min離心10 min除去菌體，提取方法為取100 mL發(fā)酵液，用5 mol/L HCl調(diào)pH至2~3左右，充分振蕩，靜置一段時間，在攪拌的條件加入等體積無水乙醇使其充分沉淀，利用600目的濾布過濾棄上清，得黑色粗提物于50℃真空干燥至恒重。

黑色素的色價：參照國標GB6718-86，精確稱取出芽短梗霉黑色素樣品0.1 g(精確到0.002 g)，加入少量pH 10.0的氨水-氯化銨緩沖溶液使色素溶解，全部移入100 mL容量瓶中，加入緩沖溶液定容至刻度，振搖30 min，從中吸取10 mL色素液，移入另外一個100 mL容量瓶，用同樣的緩沖溶液定容，搖勻，在540處測定其吸光值，色價計算公式如下[8-13]：

E1cm1%=A×r/W

式中：A為吸光值；W為樣品的質(zhì)量（g）; r為測定吸光值時所吸取樣品的稀釋倍數(shù)。

1.2.6 黑色素得率的計算

發(fā)酵液5000 r/min離心10 min除去菌體，提取方法為取100 mL發(fā)酵液，用5 mol/L HCl調(diào)pH至2.0，充分振蕩，靜置一段時間，在攪拌的條件加入等體積無水乙醇使其充分沉淀，利用600目的濾布過濾棄上清，得黑色粗提物于50 ℃真空干燥至恒重得黑色素粗提品M1[14]。出芽短梗霉黑色素得率計算公式如下：

得率（%）=M1/M×100

式中：M1：黑色素粗品的質(zhì)量；M：黑色素發(fā)酵液的總質(zhì)量。

1.2.7 統(tǒng)計分析

每個處理獨立重復(fù)3次，文中數(shù)據(jù)為3次重復(fù)平均值+-標準差（S.D.）。顯著水平< 0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑色素紫外光譜掃描

根據(jù)1.2.1中描述的方法，用紫外可見分光光度計在190~600 nm處對黑色素溶液進行光譜掃描，得到黑色素的吸收光譜，結(jié)果如圖1所示。

圖1 黑色素光譜圖

由圖1可以看出，黑色素在紫外光區(qū)有強烈的吸收峰且隨著波長的增加吸光度逐漸降低，黑色素的特征吸收峰為200 nm。寧華等[15]從酪氨酸基因工程菌提取的黑色素紫外掃描顯示無特征峰，段曉紅等[16]人從嗜麥芽假單胞菌AT18所產(chǎn)黑色素的紫外吸收峰顯示在210 nm處有一特征吸收峰，但是相同的一點是都能吸收所有波長下的光線，在紫外和可見光區(qū)域里吸收值都隨波長的增大而逐漸降低。由合成黑色素的光吸收特性可知，黑色素具有光譜光吸收特征，是因為分子結(jié)構(gòu)的高度共軛效應(yīng)造成的。色素顯黑色主要是其吸收多數(shù)可見光的結(jié)果。參考大量的文獻[17-20]，選擇540 nm的波長測定黑色素的吸收值。

2.2 黑色素提取預(yù)實驗

2.2.1 酸沉醇沉和堿溶酸沉法的比較

利用文獻中提到的堿溶酸沉的方法發(fā)酵液提取黑色素的產(chǎn)量達到了2.2 g/L。而利用酸沉醇沉的方法，固體物質(zhì)析出之后溶液的顏色變?yōu)闊o色狀態(tài)，表明黑色素完全析出且黑色素的得率為2.66%，樣品易于收集，便于后續(xù)的穩(wěn)定性研究和精制工作。

2.2.2 不同有機溶劑對醇沉效果的影響

根據(jù)1.2.2.2的實驗方法，對出芽短梗霉黑色素進行提取。實驗結(jié)果表明，黑色素在乙醇和甲醇溶液中均能沉淀析出，而在丙酮溶液中無法沉淀析出，考慮到乙醇溶液醇沉效果上清液為澄清透明的液體，而在甲醇溶液中上清液為淺黃色，綜上所述，選取乙醇溶液為醇沉的最佳試劑。

2.3 黑色素提取工藝單因素確定

2.3.1 不同發(fā)酵液濃縮比對黑色素得率的影響

根據(jù)1.2.3.1的實驗方法，對出芽短梗霉黑色素進行提取，實驗結(jié)果如圖2所示。

圖2 發(fā)酵液濃縮比對黑色素提取的影響

由圖2可知，隨著濃縮比的逐漸增加其色價值逐漸增加，由于濃縮的比例逐漸增大，單位體積黑色素發(fā)酵液中色素的含量逐漸增大，其色價值明顯高于不濃縮的發(fā)酵液的色價值。由于在使用分光光度法測色素吸光度過程中，濃度過大或過小的樣品，誤差很大。理論上推算，相對誤差最小的部分在透度為36.8%處（或吸光度為0.4343處），故通常認為測定值在吸光度0.20~0.80范圍內(nèi)（透光度為20%~65%）誤差較小，超出此范圍，相對誤差均會增大[21]?？紤]到試驗的方便可靠性，綜上所述，選取原始發(fā)酵液來進行后續(xù)優(yōu)化試驗。

2.3.2 酸沉pH對黑色素得率的影響

根據(jù)1.2.3.2的實驗方法，對出芽短梗霉黑色素進行提取，實驗結(jié)果如圖3所示。

圖3 pH對黑色素提取的影響

由圖3可知，隨著pH逐漸升高獲得黑色素得率及色價值先增高在pH 2后其色價和得率逐漸降低。因此，選取酸沉pH 2來進行后續(xù)優(yōu)化試驗。

2.3.3 酸沉時間對黑色素提取的影響

根據(jù)1.2.3.3的實驗方法，對出芽短梗霉黑色素進行提取，實驗結(jié)果如圖4所示。

圖4 時間對黑色素提取的影響

由圖4可知，黑色素在靜置30~60 min時，隨著靜置時間的增加黑色素的色價值逐漸增大，后隨著靜置時間的增加其色價值逐漸降低，在靜置時間為60 min時其色價值最高因此。選取酸沉時間60 min來進行后續(xù)優(yōu)化試驗。

2.3.4 酸沉溫度對黑色素得率的影響

根據(jù)1.2.3.4的實驗方法，對出芽短梗霉黑色素進行提取，實驗結(jié)果如圖5所示。

圖5 溫度對黑色素提取的影響

由圖5可知，隨著溫度的增加黑色素的色價值逐漸增大，溫度80℃時其色價值最大，后隨著溫度的增加逐漸降低。因此，選取溫度80℃為來進行后續(xù)優(yōu)化試驗。

2.3.5 乙醇添加量對黑色素得率的影響

根據(jù)1.2.3.5的實驗方法，對出芽短梗霉黑色素進行提取，實驗結(jié)果如圖6所示。

圖6 乙醇添加量對黑色素提取的影響

由圖6可知，隨著乙醇添加量的增加黑色素色價值逐漸增大，乙醇添加量為80%時其色價值最大，后隨著乙醇的繼續(xù)添加色價值逐漸降低。因此，選取乙醇添加量為80%來進行后續(xù)優(yōu)化試驗。

2.3.6 不同乙醇濃度對黑色素得率的影響

根據(jù)1.2.3.6的實驗方法，對出芽短梗霉黑色素進行提取，實驗結(jié)果如圖7所示。

圖7 乙醇濃度對黑色素提取的影響

由圖7可知，隨著乙醇濃度的增加黑色素的色價值逐漸增大，當乙醇濃度在60% 時色價值最大，乙醇濃度繼續(xù)增加色價值逐漸減小。黑色素在乙醇濃度為40%時其黑色素得率最高為2.4% 色價值為22.6，乙醇濃度為60%時其色價值最高為38.6，但黑色素得率最低為1.21%。這可能是當乙醇體積分數(shù)較低時使大量水溶性雜質(zhì)如多糖、蛋白質(zhì)、淀粉等成分溶出，使得提取液變得粘稠，并對黑色素產(chǎn)生吸附作用，不利于黑色素的快速擴散溶出[22]。因此，選取乙醇濃度60%來進行后續(xù)優(yōu)化試驗。

2.4 重要影響因素的篩選

Plackett-Burman 設(shè)計法是一種2水平的試驗設(shè)計方法，可以從眾多的考察因素中，以最少實驗次數(shù)估計出可信度大于95%的因素作為主效應(yīng)。根據(jù)前期試驗結(jié)果，實驗選取的因素共有6個，每個因素取2個水平，按照文獻中Plackett-Burman試驗的方法設(shè)計各因素和水平，見表2所示。

表2 Plackett-Burman試驗設(shè)計各因素與水平

2.4.1 響應(yīng)值及方差分析結(jié)果

根據(jù)實驗序號，取100 mL黑色素發(fā)酵液進行提取，得到的提取液在540 nm處測吸光值，結(jié)果如表3和表4所示。

表3 Plackett-Burman試驗設(shè)計及響應(yīng)值

表4 Plackett-Burman試驗設(shè)計各因素水平及方差分析

二水平試驗各因素的方差分析表如表7所示，從F值得大小可以看出，上面6因素按照顯著性排列是B > C > D > F > E > A，且B、C、D這3個因素的F值的置信度均在90%以上，而E、A的置信度低于90%，選擇3個主要因素作進一步的回應(yīng)面分析，選擇B、C、D這3個因素作響應(yīng)面分析，以確定這些因素所對應(yīng)的最優(yōu)水平[24]。

2.5 黑色素提取工藝優(yōu)化

2.5.1 最佳提取工藝的確定

以酸沉時間、乙醇添加量和乙醇濃度3個重要因素為自變量進行Box-behnken試驗設(shè)計，各因素水平及編碼值如表1，試驗結(jié)果見表5。

利用軟件Design expert8.0 對Box-Behnken試驗結(jié)果進行回歸擬合得到二價回歸方程式為：

表5 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

以X1、X2、X3分別表示酸沉時間、乙醇添加量、乙醇濃度，以Y表示響應(yīng)值（色價）。實驗數(shù)據(jù)經(jīng)Design Expert 7.0軟件進行二次回歸分析，得到回歸方程：

=50.96+0.831+1.682+0.653-0.5312-0.3313+0.2823-4.1712-3.8722-7.4232

2.5.2 回歸方程各項的方差分析結(jié)果

通過進行方差分析來驗證模型及各參數(shù)的顯著度見表6。

表6 響應(yīng)面方差分析

從方差分析可看出，模型Pr＞F小于0.05，表明該模型是顯著的。同時模型中的參數(shù)X1、X2、X1X1、X2X2、X3X3都是顯著的（Pr＞F小于0.05）。模型失擬項(Lack of Fit)表示模型預(yù)測值與實際值不擬合的概率[23]。表3中模型失擬項Pr＞F為0.6855＞0.05。因此，模型失擬項不顯著，說明模型中不需要引入更高次數(shù)的項，模型選擇合適；模型的相關(guān)系數(shù)R2為0.9904，大于0.9，模型擬合程度很好；同時，變異系數(shù)(CV)值為1.78，說明模型方程能夠很好的反映真實的實驗值。所以，可以用該模型來分析響應(yīng)值的變化。經(jīng)回歸分析得出因素酸沉時間X1和乙醇添加量X2、酸沉時間X1和乙醇濃度X2、乙醇添加量X和乙醇濃度X對響應(yīng)值色價交互作用影響顯著。根據(jù)回歸方程繪制響應(yīng)面直觀圖。

圖8 酸沉時間與乙醇添加量對色價影響的響應(yīng)面圖及等高線圖

由圖8可以看出，隨著X1（酸沉時間）與X2（乙醇添加量）的增加，對響應(yīng)值的影響都呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢。等高線圖形比較圓，說明其交互作用不顯著，從二者各自方向的變化疏密程度來看，也可以得出對響應(yīng)值色價值的影響也不顯著的結(jié)論。

圖9 酸沉時間與乙醇濃度對色價影響的響應(yīng)面圖及等高線圖

由圖9所示，隨著X1（酸沉時間）與X3（乙醇濃度）的增加，對色價值的影響都呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢；等高線因素X與X交互作用的等高線中，因素X1從實驗編碼從–1到0變化過程相對于編碼0到1密集，說明X在編碼–1到范圍，響應(yīng)值升高較快。

圖10 乙醇添加量與乙醇濃度對色價影響的響應(yīng)面圖及等高線圖

由圖10可知，隨著X2（乙醇添加量）與X3（乙醇濃度）的增加，對響應(yīng)值的影響都呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢；其相應(yīng)的等高圖中，沿X2軸向等高線變化密集，而3軸向等高線的變化相對稀疏，故因素X2對響應(yīng)值峰值的影響較X的影響大。同時因素X3從實驗編碼–1到0的過程中變化較編碼0到1密集，說明在X3編碼0到1范圍，響應(yīng)值升高較快。

整體模型回歸方程也是極顯著，相關(guān)系數(shù)R= 99.04%，說明響應(yīng)值的變化有96.81%來源于所選變量，即酸沉時間、乙醇添加量和乙醇濃度。

經(jīng)計算后可知，理論最佳酸沉醇沉提取工藝為:酸沉時間90 min、乙醇添加量93.17%、乙醇濃度90.42%。在此條件下，提取的黑色素色價理論值為44.88 μ/mL。

3 結(jié)論

本試驗首先通過單因素實驗確定發(fā)酵液濃縮比、酸沉pH、溫度、時間、醇沉乙醇添加量、乙醇濃度在提取黑色素時色價的最高和最低值，然后通過二水平實驗得出酸沉時間、乙醇添加量、乙醇濃度三個因素是對黑色素色價影響比較顯著的因素，最后通過響應(yīng)面實驗得到響應(yīng)面分析曲線，得到出芽短梗霉黑色素提取的最佳條件為：酸沉時間90 min、乙醇添加量93.17%、乙醇濃度90.42%。

[1] Catley B J. Microbial polysaccharides and polysaccharides[M]. Salt Lake: Academic Press, 1979: 69-84.

[2] Riley P A. Melanin [J]. The International Journal of Biochemistry ＆ Cell Biology,1997，29(11): 1235-1239.

[3] Butler M J, Day A W. Fungal melanin: a review[J].Canadian Journal of Microbiology，1998，44: 1115-1136.

[4] Nicolaus R A. Chemistry of Natural Products[M]. Pairs:Harmann, 1968: 68-91.

[5] Francesco D A, Antonio A, Fabio M. Partial Structures of Truffle Melanins[J]. Phytochemistry, 1996, 43(5): 1103-1106.

[6] Nicolaus R A, Piatelli M, Fattoruuso E. On some natural melanins[J]. Tetrahedron, 1964, 20: 1163-1172.

[7] 王長海. 短梗霉黑色素的分離提取及其結(jié)構(gòu)分析[D].大連:大連理工大學(xué),2007..

[8] 張涌權(quán). 紅曲色素色價和色調(diào)分析方法探討[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 1985 (6): 34-38.

[9] 茹可也木，沙木提，鄭慧文，等. 山城紫苕天然色素的提取和分離[J]. 西南師范大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2003, 28 (4) : 590-593.

[10] Quan Q Z, Dang R Y, Li T S. Adsorbing and separating radish red pigment by X-5 Resin[J]. Acta Botanica Boreal-Occidentalia Sinica, 2001, 21(6) : 1218-1222.

[11] Harborne J B. Spectral methods of characterizing anthocyanins[J]. J Biochem, 1958, 70:22.

[12] 陸國權(quán), 吳小蓉. 黑豆皮色素的提取及其理化性質(zhì)研究[J]. 中國糧油學(xué)報, 1997 (6) : 53-58.

[13] 鐘麗玉, 胡秋林. 黑米色素分子結(jié)構(gòu)分析[J]. 無錫輕工大學(xué)學(xué)報, 1996 (1) : 33-38.

[14] 張名位,孫玲.黑米、黑大豆、黑芝麻中天然色素性質(zhì)的比較研究[J]. 中國糧油學(xué)報, 1998 (2) : 7-9.

[15] Sava V M, Galkin B N, Hong M Y, et al. A novel melanin-like pigment derived from black tea leaves with Immuno-stimulating activity [J]. Food Research International, 2001,34(4):337-343.

[16] 寧華,王戈林,沈萍．酪氨酸酶基因工程菌所產(chǎn)黑色素的性質(zhì)研究[J].湖北教育學(xué)院學(xué)報：自然科學(xué)版，1999(5):63-66．

[17] 段曉紅,毛欲,彭珍榮.固定化細胞生產(chǎn)黑色素的研究[J].武漢大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，1997，43(2):249-253．

[18] 吳鳴聲，雷海峰.毛發(fā)中黑色素的提取、利用及其結(jié)構(gòu)探討[J].日用化學(xué)工業(yè)，1997(4):51-53.

[19] 程玉峰，胡國順.從黑芝麻中提取黑色素的研究[J].江西化工，1998(4) :19-20.

[20] 楊安鋼. 生物化學(xué)與分子生物學(xué)實驗技術(shù)[M]. 北京 : 高等教育出版社, 2001.

[21] Muroya S, tanabe R, nakajima I C K. Molecular characteristics and site specific distribution of the pigment of the silky fowl [J]. J. Vet Med Sci,2000,62(4): 391-395.

[22] Babntakays V G, V VS. The nature of melanin pigments of several micro-and macroanycetes[J]. Applied Biochemistry and Microbiology,2002,38(3):247-251.

[23] Riley P A. Melanin [J]. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology,1997, 29(11): 1235-1239.

EXTRACTION TECHNOLOGY OF THE MELANIN FROMUSING RESPONSE SURFACE METHOD

WANG Jian-ming1,2, ZHAO Bo1,*QIAO Chang-sheng2,3

(1. Key Laboratory of Food Nutrition and Safety, Ministry of Education, College of Food Engineering and Biotechnology, Tianjin University of Science & Technology, Tianjin 300457, China; 2. Tianjin Peiyang Biotrans Biological Technology Company, Tianjin 300457, China; 3. Tianjin Key Laboratory of Industry Microbiology, Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology, Ministry of Education, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China)

The extraction of melanin fromfermented liquid was studied in this paper. On the basis of single factor experiments, the main factors that influence the valeur of melanin were determined by two-level experiment, and then the optimum conditions for the extraction of the melanin fromfermented liquid were obtained through a three-variable, three-level Box－Benhnken center－united experiment design and response surface methodology. The results showed that the optimum conditions were as follows: acid sinking time 90 min, ethanol add volume 93.17 % and ethanol concentration90.42 %. Under such conditions, the maximal valeur of melanin was up to 44.8 μ/mL.

; melanin; response surface methodology; extraction

TQ920.6

A

10.3969/j.issn.1674-8085.2013.04.005

1674-8085(2013)04-0019-09

2013-04-01；

2013-05-09

天津市2011年科技支撐計劃重點基金項目(11ZCKFNC01800);天津市東麗區(qū)2010年科委項目“傳統(tǒng)調(diào)味品非熱力抑菌技術(shù)的集成與示范”

汪建明(1972-)，女，新疆庫爾勒人，教授，碩士，博士生導(dǎo)師(E-mail:Wangjianming@tust.edu.cn);

趙 博(1987-)，女，天津人，碩士生，主要從事食品加工技術(shù)和新產(chǎn)品研發(fā)(E-mail:404614141@qq.com).

*喬長晟(1969-)，男，吉林人，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事生物高分子及食品生物技術(shù)方向研究(E-mail: qiaochangsheng@tust.edu.cn);