植物轉錄因子最新研究方法

王傳琦，孔穩(wěn)穩(wěn)，李晶

東北農業(yè)大學 生命科學學院，黑龍江 哈爾濱 150030

轉錄因子（transcription factor，TF）又稱反式作用因子，是直接或間接與基因啟動子區(qū)域中順式作用元件發(fā)生特異性相互作用，并對基因轉錄的起始進行調控的一類蛋白質。轉錄因子一般具有4個功能結構域，即DNA結合區(qū)（DNA-binding domain，DBD）、寡聚化位點區(qū)（oligomerization site，OS）、核定位信號區(qū)（nuclear location signal，NLS）和轉錄調控區(qū)（transcription regulation domain，TRD）。DNA 結合區(qū)是轉錄因子識別并結合于各種順式因子的一段氨基酸序列，可與靶位點專一性結合；寡聚化位點區(qū)是不同轉錄因子間發(fā)生相互作用的功能域；核定位信號可將轉錄因子定位于細胞核內的某些區(qū)域；轉錄調控區(qū)決定著轉錄因子對靶基因的調控特征，可分為轉錄激活域（activation domain，AD）和轉錄抑制域（repression domain，RD），對靶基因的轉錄起激活或抑制作用。

自植物中最早的玉米轉錄因子被報道以來[1]，已發(fā)現植物中存在大量轉錄因子。根據模式植物擬南芥信息資源庫TAIR提供的數據分析，擬南芥基因組中包含27 235個編碼蛋白的基因，其中2000個以上編碼轉錄因子，約占基因總數的5%～10%，明顯高于果蠅（4.7%）和線蟲（3.6%）[2]。轉錄因子的數量和種類繁多，表明了植物轉錄調控的特殊性和復雜性。目前已從高等植物中分離鑒定出數百種轉錄因子，有些轉錄因子參與調控植物細胞和組織的形成，是植物形態(tài)建成的關鍵調節(jié)因子，如bHLH轉錄因子家族[3-4]。大量轉錄因子與植物抗逆性密切相關，可調控植物體感受干旱、高鹽、低溫和病原等信號相關基因的表達，在植物抗逆反應中發(fā)揮重要作用，如bZIP類轉錄因子[5-6]。轉錄因子還可對植物次生代謝產物的合成和分解進行調節(jié)，影響次生代謝產物的合成、分解及時空分布，如MYB轉錄因子家族[7-8]。

由于轉錄因子在植物生長發(fā)育、形態(tài)建成及對外界環(huán)境變化的反應中起重要的作用，在植物基因表達調控研究中轉錄因子一直備受關注。我們結合近年來植物轉錄因子的研究進展，歸納分析了高等植物轉錄因子研究的主要策略和最新的技術方法，可為植物轉錄因子的鑒定、功能分析及靶基因研究提供理論和技術上的參考。

1 生物信息學分析

隨著生物信息學的迅速發(fā)展，各種分子生物學數據庫提供了大量核苷酸和氨基酸序列，對這些序列進行分析和計算，已成為發(fā)現新基因和預測蛋白質結構最快捷有效的方法。常用的大型生物學數據庫NCBI、EBI和DDBJ等都能提供植物轉錄因子的相關數據。另外還有許多轉錄因子的專用數據庫，如 TRANSFAC（http://www.gene-regulation.com/pub/databases.html#transfac）和 PlnTFDB（http://plntfdb.bio.uni-potsdam.de/v3.0/）等。TRANSFAC是關于轉錄因子在基因啟動子上結合位點的數據庫[9]，而PlnTFDB是系統(tǒng)收錄植物轉錄因子的數據庫[10-11]。模式植物通常有自己專屬的轉錄因子數據庫，如擬南芥轉錄因子數據庫RARTF（http://rarge.gsc.riken.jp/rartf/）、AGRIS（http://arabidopsis.med.ohio-state.edu/AtTFDB/）和 DATF（http://datf.cbi.pku.edu.cn/），每個數據庫都有自己的分類方式，并對這些轉錄因子的功能結構和作用位點都進行了詳細的描述[12]。水稻也有自己專門的轉錄因子數據庫DRTF（http://drtf.cbi.pku.edu.cn/）[13]。這些數據庫對植物轉錄因子的研究有重要的指導作用。

1.1 轉錄因子保守結構域的分析

大多數轉錄因子的序列具有保守性，這些保守結構域（conserved domains，CD）使得用生物信息學方法進行轉錄因子的預測和功能鑒定成為可能。早期研究中常利用已知轉錄因子的核酸序列作為探針，與cDNA文庫進行雜交來篩選轉錄因子，這種方法耗時、費力?，F在可以利用生物信息學來研究一個未知的序列是否屬于轉錄因子。DBD是轉錄因子最主要的保守區(qū)域，其次還有AD或RD。在漫長的進化過程中，這些區(qū)域的氨基酸序列變化都很小，確保了轉錄因子功能的準確行使。可見保守區(qū)是確定一種蛋白質是否是轉錄因子并鑒定其功能和類型的關鍵。通常一個轉錄因子含有1個DBD和1個AD或RD。只含有1個DBD的轉錄因子一般具有轉錄抑制活性，如CPC和TRY[14]。也有些轉錄因子含有2個DBD，如RAV1家族成員，同時含有AP2-ERF和B3等2個DBD[15]。目前已有很多轉錄因子保守結構域數據庫及分析軟件，比較常用的如歐洲生物信息研究院（EBI）提供的 InterProScan（http://www.ebi.ac.uk/Tools/interProScan/）[16]。如果是在一系列蛋白質中尋找已知或未知的轉錄因子CD，則可利用MEME數 據 庫 （http://meme.sdsc.edu/meme/intro.html）[17]。SALAD（http://salad.dna.affrc.go.jp/salad/en/）是 專 門針對植物蛋白質建立的數據庫，包含了MEME中的CD數據，同時提供了各種分析軟件和工具。除了CD以外，在其他區(qū)域具有較高同源性的轉錄因子功能上冗余的可能性也相對較大，因此可利用NCBI數據庫的BLAST對多個轉錄因子的CD及其他序列進行同源性分析，以便更準確地預測這些轉錄因子的功能。

1.2 轉錄因子亞細胞定位的分析

轉錄因子只有在細胞核中才能發(fā)揮其功能，所以對候選轉錄因子進行生物信息學的亞細胞定位分析十分重要。某些轉錄因子的核定位信號肽可使其定位于細胞核內。根據氨基酸序列可以分析和預測蛋白質的亞細胞定位。SUBALL數據庫（http://www.plantenergy.uwa.edu.au/suba2/）[18]可 提 供 大 量 蛋 白 質定位的實驗數據，并通過10種不同的計算程序來計算和預測蛋白質的亞細胞定位。還有一些其他的計算軟件如 TargetP（http://www.cbs.dtu.dk/services/Tar?getP/）[19]、SubLoc（http://bioinfo.tsinghua.edu.cn/Sub?Loc/）[20]和 WoLF PSORT（http://wolfpsort.org/）[21]等 。這些數據庫和軟件給植物轉錄因子亞細胞定位研究提供了極大的便利，但有時不同計算方法可能會得出不同的預測結果，最終的結論還必須通過實驗來驗證。

1.3 轉錄因子的表達及調控

轉錄因子對下游靶基因的表達起調控作用，而轉錄因子基因自身的表達也可能受到其他調節(jié)因子的調控。和其他基因一樣，轉錄因子基因的編碼區(qū)上游含有各種順式調控元件來接受調控因子的作用。這些順式作用元件的相關數據可通過AGRIS ATCISDB（http://arabidopsis.med.ohio-state.edu/Atcis?DB）和 PLACE（http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/）獲得。

microRNA（miRNA）是影響轉錄因子基因表達的重要因素，它是一種長18～24 nt的非編碼小RNA，可以在轉錄及轉錄后水平對基因的表達進行調節(jié)。研究表明，擬南芥已知miRNA的候選靶基因中35%編碼轉錄因子，這些miRNA在擬南芥生長發(fā)育和形態(tài)建成中起至關重要的作用[22]。除了miRNA外，其他形式的小RNA也參與轉錄因子的調控。擬南芥的ASRP數據庫（http://asrp.cgrb.oregonstate.edu/）提供包括siRNA、ta-siRNA及miRNA在內的所有小RNA信息，是研究轉錄因子自身表達調控的有力工具。

許多轉錄因子并不能獨自行使功能，它們需要與其他蛋白形成復合體或被激酶磷酸化激活，如MADS家族[18]和MYB家族[23]通常會形成蛋白質復合體。EBI（http://www.ebi.ac.uk/）提供了大量經過實驗驗證或計算機預測的蛋白質-蛋白質相互作用的數據。模式植物擬南芥蛋白質間相互作用的信息還可從 TAIR（http://www.arabidopsis.org/）和 AtPID（http://www.megabionet.org/atpid/webfile/）等數據庫中獲得。

2 瞬間轉化分析

轉錄因子可通過激活或抑制實現對下游靶基因轉錄的調控，利用瞬間轉化技術可對轉錄因子的調控特性進行分析[24]。具體方法是構建2種植物表達載體（圖1），一種是效應載體，可高水平表達待研究轉錄因子和一個外源DBD的融合基因，外源DBD可以采用來源于酵母的GAL4DB。另一種是報告載體，有2種不同情況：一種是用于檢測轉錄因子是否具有激活活性的報告載體A（active），載體包含一個特異性啟動子和一個報告基因，該啟動子須含有可以與效應載體中的DBD特異性結合的順式作用元件。當效應載體和報告載體同時轉入植物細胞后，效應載體中的DBD與報告載體中啟動子特異性結合，如果報告基因表達量增加，則說明該轉錄因子具有激活活性。另一種是用于檢測轉錄因子是否具有抑制活性的報告載體R（repress），載體須含有一個組成型強啟動子如花椰菜花葉病毒（CaMV）35S啟動子和一段與效應載體中的DBD特異性結合的順式作用元件及報告基因。將其與效應載體同時轉入植物細胞后，如果報告基因表達量降低，則說明該轉錄因子具有抑制活性。報告基因可以采用綠色熒光蛋白（GFP）、β-葡萄糖苷酸酶（GUS）或螢光素酶（LUC）等基因。瞬間轉化可采用基因槍法、電轉化法、PGE處理法及農桿菌介導法，在幾小時或幾天后可觀察到報告基因的表達情況[25-26]。其中，農桿菌介導的煙草葉片瞬間轉化經濟、便捷、高效。

另外，瞬間轉化分析也可用于驗證轉錄因子與靶基因啟動子之間的識別特性。在待測靶基因的啟動子序列下游加上報告基因，和轉錄因子一起轉入植物組織，觀察報告基因的表達，如果報告基因的表達發(fā)生預期改變，則可確定兩者之間存在特異性的識別。

3 突變體表型分析

鑒定轉錄因子生理功能最直接的方法是觀察轉錄因子基因表達發(fā)生改變時植物的表型。通常利用基因過量表達和基因功能缺失突變體，觀察植物外部形態(tài)、生理代謝和對某些特殊外界環(huán)境的反應是否發(fā)生改變，分析該轉錄因子的功能。

3.1 基因功能增加表型分析

基因功能增加可采用超表達法，即在目的轉錄因子基因前加入一個組成型強啟動子如CaMV 35S啟動子，使轉錄因子大量表達；如果待研究轉錄因子具有轉錄激活活性，則還可將其與一個外源的轉錄激活域相融合，如來自皰疹病毒的VP16-AD，使其激活活性增強，從而促進下游基因的大量表達，相當于將轉錄因子基因過量表達。2006年，Ichikawa等在模式植物擬南芥中建立了基因過量表達的高通量分析系統(tǒng)FOX-hunting system（Full-length cDNA Over-eXpressing gene hunting system）[27]。 FOX-hunting system首先創(chuàng)建待研究植物全長cDNA文庫，將均一化的全長cDNA在擬南芥中過量表達，篩選具有顯著表型變化的轉基因植株，再通過基因組PCR分離鑒定引起表型變化的基因，進一步確定其功能[27-29]。擬南芥的FOX轉基因株系目前可通過RIKEN Plant Science Center獲得（http://pfgweb.psc.riken.jp/index.html）。Fujita等在研究大量轉錄因子時采用小規(guī)模的FOX-hunting system方法，將43種逆境誘導的轉錄因子全長cDNA混合轉入擬南芥，在篩選到的耐鹽株系中鑒定出轉錄因子AtbZIP60的逆境信號轉導功能[30]。

圖1 轉錄因子調控活性的鑒定

35S啟動子驅動的某些對植物早期生長發(fā)育起重要作用的轉錄因子會引起致死效應，這種情況下可采用基因誘導表達法，即將植物轉錄因子基因置于誘導型啟動子下游，如酒精誘導啟動子[31]，目的基因只有在酒精誘導處理的條件下才會表達，正常條件下不對植物生長發(fā)育造成影響。也可將轉錄因子與激素受體系統(tǒng)相融合。如將植物轉錄因子與糖皮質激素受體（glucocorticoid receptor，GR）或雌激素受體（estrogen，ER）相融合[32-33]，無配體結合時轉錄因子活性受到抑制，施與此類激素后，轉錄因子活性得以恢復。

基因功能增加表型分析已在鑒定基因功能上得到廣泛應用，但它也有一定的局限性。很多轉錄因子是以蛋白復合體的形式行使功能的，只過量表達其中一個蛋白質，植物不會產生明顯的表型變化。另外，轉錄因子的過量表達并不總是引起下游基因的變化，因為有些基因的表達是轉錄因子和其他因素共同作用的結果。

3.2 基因功能缺失表型分析

與基因功能增加相比，基因功能缺失的表型能更好地體現基因的生理功能?；蚬δ苋笔蛔凅w通?？赏ㄟ^插入法和反義RNA抑制法獲得。插入法是在目的基因中插入DNA片段，使其無法正常表達，包括轉座子插入法、T-DNA插入法和同源重組插入法。最常見的是T-DNA插入法，目前擬南芥人工突變體中有很多是通過該法獲得的，這些突變體可通過擬南芥生物學資源中心（Arabidopsis Biologi?cal Resource Center，ABRC）或歐洲擬南芥種質中心（European Arabidopsis Stock Centre，NASC）查詢并購買。T-DNA插入的局限性是基因編碼區(qū)序列太短時，T-DNA插入的幾率較小，插入非編碼區(qū)或內含子區(qū)域時不一定會引起基因表達的完全缺失，只是使基因表達水平降低。反義RNA或RNA干擾（RNAi）技術是指將基因全部或部分的反向序列轉入植物，所表達的RNA與目的mRNA相配對形成雙鏈mRNA，從而導致mRNA的降解或抑制翻譯。

人工 miRNA（artificial microRNA，amiRNA）是近年興起的特異性引發(fā)基因沉默的有效方法[34-35]，可用于抑制一個或幾個相關基因的表達。與傳統(tǒng)的RNAi相比，amiRNA來源于一個短的莖環(huán)結構，只產生一個單一的小RNA，能更加精準地抑制靶基因的表達。目前已有軟件Web MicroRNA designer（http://weigelword.org）可用于amiRNA序列的設計[34]。

利用基因缺失來研究轉錄因子功能的最大挑戰(zhàn)是，某些同一家族的轉錄因子因具有相似的DNA結合域，可調控相同的下游基因的表達，產生功能的冗余，單一基因的敲除很難產生明顯表型。嵌合抑制基因沉默技術（chimeric repressor gene-silencing technology，CRES-T）[36]可解決這一難題。CRES-T是在轉錄因子基因上融合一個經過修飾的抑制結構域，并使其過量表達。這個嵌合的轉錄因子結合到靶基因啟動子上可以有效地抑制基因的轉錄，并且使結合到該啟動子上的其他轉錄因子的激活作用失效，這相當于敲除了結合到同一啟動子區(qū)域的所有轉錄因子，得到明顯表型的幾率大大增加。當然，對于抑制基因表達的植物轉錄因子，CRES-T技術是不適用的，抑制結構域的嵌合對于具有抑制作用的轉錄因子實際上起到了基因功能增加的效果。

4 調控網絡和組學分析

轉錄因子行使生理功能的過程十分復雜，涉及到所調控的靶基因、相關下游基因及與其他轉錄因子的相互作用。轉錄調控網絡的建立和組學研究的應用，能使轉錄因子研究更加深入和系統(tǒng)。

4.1 調控網絡分析

在轉錄因子及其靶基因和相關的下游基因之間建立相互聯系的網絡系統(tǒng)，能更全面清楚地了解轉錄因子的功能。傳統(tǒng)的遺傳學方法通過基因過表達或缺失突變體的異常表型來分析轉錄因子的功能，能夠使這些異常表型得以全部或部分恢復的基因就是與該轉錄因子密切相關的下游基因。如擬南芥FUL基因編碼MADS-box轉錄因子，ful突變體會表現出充滿種子的短角果性狀，如果將這個突變體中的 INDEHISCENT（IND）、SHATTERPROOF1（SHP1）和SHP2基因敲除，突變體的異常表型會在很大程度上得以修復。該修復現象表明ful突變體中IND、SHP1和SHP2基因的表達量升高，說明IND、SHP1和SHP2基因是FUL轉錄因子調控的下游基因，且FUL對三者的表達具有抑制調控作用[37]。

酵母單雜交是一種高通量鑒定轉錄因子與靶基因之間關系的方法。根據轉錄因子與順式作用元件結合調控報告基因表達的原理，以一系列待研究的啟動子中的順式作用元件為誘餌，篩選含有轉錄因子的cDNA文庫[38]。傳統(tǒng)酵母單雜交方法耗時費力，且從啟動子序列中確定順式作用元件十分復雜。Deplancke等對此法進行了改良，以啟動子中500 bp區(qū)域替代順式作用元件為誘餌，篩選只包含轉錄因子的cDNA文庫，效率大大提高[39]。如擬南芥中CCA1 HIKING EXPEDITION/TCP21可直接調控CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED 1（CCA1）的表達就是通過該方法鑒定出來的[40]。這種改良的酵母單雜交方法在轉錄因子調控網絡研究中潛力巨大。

染色體免疫沉淀（chromatin immunoprecipita?tion，ChIP）是研究體內蛋白質與DNA相互作用的有效方法，可用于轉錄因子靶基因的篩選。ChIP是在活細胞狀態(tài)下用甲醛固定蛋白質-DNA復合物，然后用酶切或超聲波把染色體分離并打碎為一定大小的片段，利用特異性的抗體結合染色體片段上轉錄因子，沉淀蛋白質-DNA復合物，通過水解釋放復合體中DNA，得到目的DNA片段的序列信息。ChIP與基因芯片相結合的ChIP-chip技術應用范圍更加廣泛，可用于轉錄因子靶基因的高通量篩選。將ChIP獲得的DNA序列與基因芯片雜交，可實現基因組范圍內的靶基因啟動子的篩選，如果有可能獲得專門應用于ChIP-Chip技術中的啟動子芯片，則篩選的效率更高[41-42]。

此外，還有一種嵌合轉錄因子技術也可用于靶基因的鑒定。在轉錄因子上融合一個激活域，如VP16-AD和一個誘導受體，如GR或ER，將融合基因轉入植物，用相應的誘導激素處理轉基因植株，轉錄因子便會表現活性，促進靶基因的表達，同時與靶基因密切相關的下游基因的表達也會發(fā)生變化。用基因芯片技術對比分析激素處理前后基因轉錄水平，可以鑒定出靶基因和相關的下游基因，但這種情況下無法將靶基因和相關的下游基因區(qū)分開來。如果用誘導激素和環(huán)己酰亞胺（cycloheximide，CHX，一種蛋白質合成抑制劑）同時處理，則轉錄因子被激活，促進靶基因的表達，由于CHX的作用，新的蛋白質無法合成，新形成的靶基因mRNA無法翻譯成蛋白質，由其引起的相關下游基因的表達不會受到影響[43]。用基因芯片技術對比分析處理前后基因的轉錄水平，即可獲得轉錄因子直接作用的靶基因的相關信息。

對模式植物擬南芥來說，還可以通過查詢相關數據庫，如 AGRIS（Arabidopsis Gene Regulatory In?formation Server，http://arabidopsis.med.ohio-state.edu/）了解基因轉錄調控的相關信息。AGRIS數據庫包含擬南芥轉錄因子數據庫（AtTFDB）、擬南芥順式作用元件數據庫（AtcisDB）和擬南芥調控網絡數據庫（AtRegNet）。其中AtTFDB和AtcisDB主要提供轉錄因子及其啟動子的相關信息，而AtRegNet能分析轉錄因子與其靶基因的調控關系，并可繪制網絡圖譜。此外，AtRegNet還開發(fā)了ReIN（Regulatory Networks Interaction Module）工具軟件（http://arabi?dopsis.med.ohio-state.edu/REIN），這個軟件可將上述3個數據庫的資料加以整合，并可根據用戶的要求計算并建立擴展的基因調控網絡[44]。

4.2 組學分析

組學研究內容龐大，包括基因組學、轉錄組學、蛋白組學、代謝組學和表型組學等。在植物中，轉錄水平的調控對基因表達起重要作用，有些轉錄因子是多種重要生理活動的關鍵調控因子，其基因突變會引起靶基因以外的調控網絡中大量基因的改變。通過轉錄組、蛋白質組、代謝組及表型組的研究，可更全面地揭示轉錄因子的生理功能。進一步將CRES-T、ChIP、基因芯片等技術應用于組學研究，為轉錄因子功能分析提供了新的途徑。

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