微波輔助水提梓樹(shù)根皮中抑菌成分的研究

邵金華，黃國(guó)文，劉 恭

湖南科技學(xué)院生化系，湖南永州 425100

梓樹(shù)皮為紫葳科梓屬喬木植物梓樹(shù)(Catalpa ovata G.Don)的皮，又名梓白皮、梓皮、梓木白皮、梓根白皮、土杜促，可入藥，據(jù)《本草綱目》記載，具有清熱、解毒、殺三蟲(chóng)和利尿的功能［1，2］。梓屬植物中主要的化學(xué)成分有環(huán)烯醚萜類成分［3-5］、萘醌類成分［6，7］、苯酚類化合物［8］及一種新的苯乙烯雙糖苷類［9］化合物。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)梓樹(shù)在醫(yī)藥臨床方面的研究報(bào)告很多［10］，而對(duì)其在抗菌作用及抗菌成分方面的報(bào)道卻很少。梓樹(shù)的研究主要集中在梓樹(shù)幼苗的培育，梓樹(shù)果實(shí)，梓樹(shù)花藥及梓樹(shù)葉有效成分的研究上［11］，而對(duì)其根皮在抗菌作用及抗菌成分方面報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)以梓樹(shù)根皮為實(shí)驗(yàn)材料對(duì)其抗菌活性進(jìn)行了系統(tǒng)研究，并對(duì)其結(jié)果進(jìn)行整理。旨在為植物抗菌化合物的開(kāi)發(fā)利用提供一個(gè)新的資源，同時(shí)也為梓屬植物資源的開(kāi)發(fā)利用提供一個(gè)新思路，對(duì)于日益嚴(yán)峻的藥品安全問(wèn)題多劈一條路。

1 材料、試劑及儀器

1.1 材料

梓樹(shù)根皮(采自湖南省永州市祁陽(yáng)縣)

枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)(來(lái)自學(xué)校微生物實(shí)驗(yàn)室)

1.2 試劑

牛肉膏(生化試劑)、蛋白胨(生化試劑)、氯化鈉(分析純)、氫氧化鈉(分析純)、瓊脂(生化試劑)、70%乙醇(分析純)等。

1.3 儀器

XH-MC-1實(shí)驗(yàn)室微波合成儀(北京祥鵠科技發(fā)展有限公司)、01J2003-04型立式壓力蒸汽滅菌器筒(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司)、DZF-6051型真空干燥箱(上海賀德實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)、SW-CJ-2F潔凈工作臺(tái)(蘇州安泰空汽技術(shù)有限公司)、HWS智能型恒溫恒濕培養(yǎng)箱(寧波市科技園區(qū)新江南儀器有限公司)等。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 原料處理

將梓樹(shù)皮用毛刷刷洗干凈，用剪刀將其剪碎，然后放入烘箱中在65℃條件下將其烘干，用植物粉碎機(jī)將其粉碎，最后過(guò)40目篩(一定要把絨毛刷干凈)。

2.2 供試菌株和菌懸液的制備

將枯草芽孢桿菌首先活化，然后轉(zhuǎn)接入制備好的試管斜面上，于37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。用接種環(huán)挑取一環(huán)菌體放入裝有10 mL無(wú)菌水的錐形瓶中，充分搖勻，制成菌懸液，備用。用1 mL無(wú)菌吸管吸取1 mL已充分混勻的枯草芽孢桿菌菌懸液，精確地放0.5 mL至10-1的試管中，此即為10倍稀釋。將多余的菌液放回原菌液中。另取一支1 mL吸管插入10-1試管中來(lái)回吹吸菌懸液三次，進(jìn)一步將菌體分散、混勻，用此吸管吸取10-1菌液1 mL，精確地放0.5 mL至10-2試管中，此即為100倍稀釋。其余依次類推。在每個(gè)倒入培養(yǎng)基的平板中分別加入200 uL已制備好的10-5枯草芽孢桿菌菌懸液，用涂布棒將其均勻涂抹在培養(yǎng)基的平板上，放置一段時(shí)間后備用。

2.3 抑菌活性的測(cè)定方法

用打孔機(jī)將濾紙圓片打成4 mm的圓片，在烘箱中經(jīng)高壓滅菌后，將其放在提取溶液中和空白對(duì)照的水中浸泡30 min，瀝去多余的試液，將濾紙片用無(wú)菌鑷子夾取，放入涂好菌液的培養(yǎng)基平板上。每皿成“+”形對(duì)稱放置4張圓片，平行做三組，剩余一組為對(duì)照組。置于37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后，用游標(biāo)卡尺測(cè)量培養(yǎng)基中抑菌圈的直徑(除去濾紙片的直徑)。

2.4 單因素試驗(yàn)

用電子天平精確稱取梓樹(shù)皮2 g，若干份，分別在不同微波功率、料液比、微波提取時(shí)間、微波提取溫度條件下提取，收集濾液，過(guò)濾。用干熱滅菌過(guò)的濾紙片蘸取提取液和空白液，瀝干后將其放入涂有枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)基平板上，在培養(yǎng)箱中37℃下培養(yǎng)48 h后，測(cè)定抑菌圈的大小，以抑菌圈的直徑大小為指標(biāo)來(lái)研究該因素對(duì)抑菌化合物提取的影響。

2.5 正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，以等量的提取劑(水)為空白對(duì)照，以微波功率、料液比、微波提取時(shí)間、溫度為因素進(jìn)行L9(34)正交實(shí)驗(yàn)，根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定最佳工藝。

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素實(shí)驗(yàn)

3.1.1 微波功率對(duì)抑菌化合物的影響

在提取時(shí)間為9 min、料液比為1∶20、溫度為50℃時(shí)，微波功率對(duì)抑菌化合物提取的影響如圖1所示。從圖1可以看出:微波功率在100～300 W之間，隨著功率的增加，抑菌圈的直徑明顯增大，而微波在300～500 W之間，抑菌圈直徑的大小隨著功率的增大反而減小。可見(jiàn)并不是微波功率越高對(duì)抑菌化合物的提取越好，由此可得微波功率在300 W時(shí)，對(duì)梓樹(shù)皮中抑菌化合物的提取最好.

圖1 微波功率對(duì)抑菌化合物提取的影響Fig.1 The effect of microwave power on extraction of antibacterial compounds

3.1.2 料液比對(duì)抑菌化合物提取的影響

在提取時(shí)間為9 min、微波功率為300 W、溫度為50℃時(shí)，料液比對(duì)抑菌化合物提取的影響如圖2所示。從圖2可以看出，料液比在1∶10～1∶15之間，隨著料液比的增大，抑菌圈的直徑增大，而在1∶15～1∶30之間，抑菌圈直徑的大小隨著料液比的增大反而明顯減小。一般來(lái)說(shuō)，料液比越大，即溶劑用量越大，抑菌化合物得率也隨之增大，試驗(yàn)結(jié)果顯示當(dāng)溶劑用量達(dá)到一定值后，得率降低，此時(shí)提取物質(zhì)已基本提取完全。且過(guò)大的料液比會(huì)造成溶劑和能源的浪費(fèi)，因此從降低成本等綜合考慮，單因素試驗(yàn)確定料液比為1∶15(g/mL)比較合理。

圖2 料液比對(duì)抑菌化合物提取的影響Fig.2 The effect of extraction time on extraction of antibacterial compounds

3.1.3 提取時(shí)間對(duì)抑菌化合物提取的影響

在料液比為1∶15、微波功率為300 W、溫度為50℃時(shí)，提取時(shí)間對(duì)抑菌化合物提取的影響如圖3所示。從圖3可以看出，隨著微波時(shí)間的增加，抑菌化合物抑菌圈顯著提高.微波時(shí)間為9 min時(shí)得率達(dá)到最大，隨后抑菌化合物抑菌圈不斷下降(圖3)。因此.最佳微波處理時(shí)間為9 min.原因可能是由于被微波輻射極性分子在電磁場(chǎng)中快速轉(zhuǎn)向，產(chǎn)生相互摩擦，引起胞內(nèi)溫度迅速升高，快速高溫使內(nèi)部壓力超過(guò)細(xì)胞空間膨脹能力，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器被破壞，加快促進(jìn)抑菌化合物的擴(kuò)散和滲透.但微波的強(qiáng)熱效應(yīng)長(zhǎng)時(shí)問(wèn)作用后，導(dǎo)致抑菌化合物發(fā)生分解。

圖3 提取時(shí)間對(duì)抑菌化合物提取的影響Fig.3 The effect of extraction time on extraction of antibacterial compounds

3.1.4 溫度對(duì)抑菌化合物提取的影響

在料液比為1∶15、微波功率為300 W、提取時(shí)間為9 min時(shí)，溫度對(duì)抑菌化合物提取的影響如圖4所示。從圖4可以看出，溫度在30～40℃之間，隨著溫度的升高，抑菌圈的直徑增大，繼續(xù)升高溫度，抑菌圈直徑的大小隨著提取溫度的升高反而減小。因?yàn)?，溫度的升高，降低了提取液的黏度，增大了擴(kuò)散系數(shù)，增大抑菌化合物溶解度，提高了提取率。溫度為40℃時(shí)抑菌化合物抑菌圈達(dá)到最大，繼續(xù)升高溫度，提取率反而下降。

圖4 浸提溫度對(duì)抑菌化合物提取的影響Fig.4 The effect of temperature on extraction of antibacterial compounds

3.2 正交實(shí)驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，對(duì)微波功率、微波萃取時(shí)間、提取溫度和料液比4個(gè)因素進(jìn)行了L9(34)正交試驗(yàn)，每個(gè)試驗(yàn)做3次重復(fù)。其因素水平見(jiàn)表1，正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析見(jiàn)表3。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels

表2 L9(34)正交試驗(yàn)Table 2 Orthogonal test L9(34)

7 400 6 1∶20 40 12.1 8 400 9 1∶10 50 13.4 9 400 12 1∶15 30 14.5 K1 13.17 11.97 13.73 12.87 K2 14.03 13.27 13.53 14.07 K3 13.33 15.30 13.27 13.60極差R 0.86 3.33 0.46 1.20主次順序 B＞D＞A＞C優(yōu)水平 A2 B3 C1 D2優(yōu)組合 A2B3C1D2

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

由表2中的極差分析可知，影響梓樹(shù)皮中抑菌化合物提取主次順序?yàn)?B＞D＞A＞C，最優(yōu)組合為:A2B3C1D2，即微波萃取時(shí)間＞提取溫度＞微波功率＞料液比。此順序同方差分析的結(jié)果一致(見(jiàn)表3)。從方差分析的結(jié)果可以看出，微波提取時(shí)間對(duì)抑菌化合物提取有及極顯著的影響，提取溫度對(duì)抑菌化合物的提取有顯著影響，料液比和微波功率對(duì)抑菌化合物的提取影響不顯著。由此得出，提取梓樹(shù)皮中抑菌化合物的最佳工藝條件為:微波功率300 W，提取時(shí)間12 min，料液比1∶10，溫度40℃。由于正交表中沒(méi)有此組合，因此采用此提取條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。

3.3 最佳條件的驗(yàn)證試驗(yàn)

按照上述最佳工藝條件A2B3C1D2制備三份供試液，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果測(cè)得梓樹(shù)皮中抑菌化合物的平均抑菌直徑為17.22 mm，由此證明該方法穩(wěn)定可行。

4 結(jié)論

微波輔助提取梓樹(shù)根皮中活性物質(zhì)的正交試驗(yàn)中，4個(gè)影響因素的主次順序?yàn)?微波萃取時(shí)間＞提取溫度＞微波功率＞料液比。

通過(guò)正交試驗(yàn)得到最佳的提取工藝條件為:微波功率300 W，提取時(shí)間12 min，料液比1∶10，溫度40℃;采用此條件試驗(yàn)，抑菌化合物的抑菌直徑可達(dá)17.22 mm。

微波輔助提取法具有簡(jiǎn)單、省時(shí)、產(chǎn)率高的優(yōu)點(diǎn)，為梓樹(shù)根皮的深入開(kāi)發(fā)利用提供了新的技術(shù)途徑。

1 Chinese Academy of Sciences，F(xiàn)lora of China Editorial Committee.69th Flora of China.Beijing:Science Press，1997.

2 Wang QZ，Liang JY.Azusa real benzo bark furans.Herbs，2005，36(2):164-166.

3 Kimura K，Okuda T，T kano T.Studies on the constituents of Catalpa ovata G.Don.Iactive principles of fruits.Yao Xue Za Zhi(藥學(xué)雜志，日)，1962，83:635-638.

4 Kauai E，Machida K，Kikuchi M.Studies on the constituents of Catalpa species I Iridoids from Catalpae fiuctus.Chem Pharm Bull，1996，44:1607-1609.

5 Wang QZ，Liang JY.Zi chemical constituents.Herbal medicine，2003，34(7):2-4.

6 V-Ortiz de Urbina A，Martin ML，F(xiàn)enrandez B.In vitro antispasmodic activity of peracetylated penstemonoside，aucubin and catalpol.Planta Med，1994，60:512-515.

7 Fujiwara A，Toshiyuki Mori，Akira Iida.Antitumor-promoting naphthoquinones from Catalpa ovata．J Nat Prod，1998，61:629-632.

8 Inouye H，Ueda S，moue K.(2R)-Catalponone，a biosynthetic intermediate for prenyl naphthoquinone congeners of the wood of Catalpa ovata．Phytochemistry，1981，20:1707-1710.

9 Li C.Excerpt phenolic compounds in Azusa leaves.International J Chin Med Volumes，2002，24:358-359.

10 Nozaka T，Watanabe F，Ishino M.A mutagenic new iridoid in the water extract of Catalpae fructus．Chem Pharm Bull，1989，37:2838-2840.

11 Seter WN，Setzer MC.Plant-derived triterpenoids as potential antineoplastic agents.Mini Rev Med Chem，2003，3:540-556.