阿霉素聯(lián)合致敏樹突狀細(xì)胞對荷宮頸癌小鼠的治療作用*

曾小平， 王紅梅， 黃永紅， 周曉燕， 蔡震宇， 徐方云

(南昌大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 1病理生理學(xué)教研室， 2免疫學(xué)教研室, 江西 南昌 330006)

阿霉素聯(lián)合致敏樹突狀細(xì)胞對荷宮頸癌小鼠的治療作用*

曾小平2， 王紅梅1△， 黃永紅1， 周曉燕1， 蔡震宇1， 徐方云1

(南昌大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院1病理生理學(xué)教研室，2免疫學(xué)教研室, 江西 南昌 330006)

目的探討阿霉素(adriamycin，ADM)聯(lián)合凍融抗原致敏的樹突狀細(xì)胞(dendritic cells，DCs)對荷宮頸癌小鼠的免疫治療作用。方法建立小鼠皮下移植瘤模型；應(yīng)用反復(fù)凍融法處理小鼠宮頸癌U14細(xì)胞，并致敏小鼠骨髓來源的DCs，制備DCs疫苗；流式細(xì)胞術(shù)鑒定DCs成熟表型；荷瘤小鼠分為對照組(PBS組)、DCs疫苗組、ADM組和ADM聯(lián)合DCs疫苗組，進(jìn)行3個周期的治療。觀察腫瘤大小，第21 d取血，ELISA法檢測小鼠血清IL-2、IL-12和IFN-γ含量；處死動物，稱腫瘤重量。結(jié)果腫瘤凍融抗原致敏DCs后，可高表達(dá)白細(xì)胞分化抗原CD11c、CD80和CD86；經(jīng)3個周期的治療后，ADM聯(lián)合DCs疫苗組平均瘤重及平均瘤體積均小于ADM組、DCs疫苗組和對照組(P<0.05)，聯(lián)合治療組抑瘤率大于其它3組(P<0.05)，且血清IL-2、IL-12和IFN-γ水平明顯升高 (P<0.05)。結(jié)論ADM聯(lián)合腫瘤抗原致敏的DCs疫苗可增強(qiáng)動物的抗腫瘤免疫應(yīng)答，能有效抑制荷宮頸癌小鼠腫瘤的生長。

樹突狀細(xì)胞； 阿霉素； 腫瘤免疫療法； 子宮頸癌

樹突狀細(xì)胞(dendritic cells, DCs)是1973年由Steinman和Cohn發(fā)現(xiàn)的，因為在它成熟時生出許多樹突樣或偽足樣突起而得名[1]，是目前所知唯一能激活初始T細(xì)胞的專職抗原提呈細(xì)胞(antigen presenting cells，APC)，具有強(qiáng)大激活CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T-lymphocyte, CTL)和CD4+輔助性T細(xì)胞(helper T-lymphocyte，Th)的能力，在免疫應(yīng)答中居于中心地位，對機(jī)體克服腫瘤的免疫逃逸、增強(qiáng)機(jī)體對腫瘤的免疫清除等具有十分重要的作用?；熕幬镏委熓强鼓[瘤的重要手段之一，化療藥物可引起腫瘤細(xì)胞死亡，而這些死亡(包括壞死或凋亡)的腫瘤細(xì)胞有可能致敏DCs。在探討化療誘發(fā)免疫原性瘤細(xì)胞凋亡時，發(fā)現(xiàn)蒽環(huán)類抗生素在體內(nèi)和體外均能引起免疫原性細(xì)胞死亡，阿霉素(adriamycin，ADM)處理的腫瘤細(xì)胞激發(fā)細(xì)胞毒性免疫應(yīng)答特別有效，這種應(yīng)答是由DCs介導(dǎo)的[2]。本文將重點探索化療藥物ADM聯(lián)合DCs腫瘤疫苗對荷宮頸癌小鼠的聯(lián)合治療效應(yīng)，觀察經(jīng)ADM處理荷瘤小鼠后，對DCs抗腫瘤免疫應(yīng)答是否具有增強(qiáng)作用。

材 料 和 方 法

1動物

昆明(Kunming, KM)小鼠，雌性，6～8周齡，18～20 g，由南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物部提供。小鼠宮頸癌U14細(xì)胞是由化學(xué)致癌物甲基膽蒽誘發(fā)的未分化鱗狀細(xì)胞癌，在本研究室傳代保存，復(fù)蘇后常規(guī)傳代培養(yǎng)。

2主要試劑

RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自HyClone，重組小鼠粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(recombinant murine granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, rmGM-CSF)和重組小鼠白細(xì)胞介素 4(recombinant murine interleukin-4, rmIL-4)購自PeproTech，PE標(biāo)記抗小鼠CD11c單克隆抗體、抗小鼠CD86單克隆抗體和FITC標(biāo)記抗小鼠CD80單克隆抗體購自BioLegend，四甲基偶氮唑藍(lán)[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, MTT]、胰蛋白酶和絲裂霉素C購自Sigma。阿霉素購自浙江海正藥業(yè)有限公司。酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)試劑盒購自Westang Bio-Tech。

3主要方法

3.1荷瘤小鼠模型的建立 小鼠宮頸癌U14細(xì)胞常規(guī)復(fù)蘇后傳代培養(yǎng)。取處于對數(shù)生長期的U14細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline, PBS)洗滌后，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×1010cells/L，接種于小鼠右側(cè)腋窩皮下，每只0.1 mL (1×106cells)。

3.2反復(fù)凍融法提取腫瘤抗原 收集U14細(xì)胞，經(jīng)液氮迅速冷凍后，立即放入37 ℃水浴中至剛剛?cè)诨?，即再次放入液氮迅速冷凍，反?fù)5次凍融循環(huán)獲得腫瘤細(xì)胞凍融裂解物, 10 000 r/min低溫離心20 min，上清用0.22 μm針頭濾器過濾，Lowry法測蛋白含量，-20 ℃保存。

3.3DCs的體外分離、培養(yǎng)和鑒定 在無菌條件下，從KM小鼠股骨和脛骨沖洗骨髓腔收集骨髓細(xì)胞，過200目鋼網(wǎng)，1 000 r/min 離心 5 min，棄上清，以Tris-NH4Cl處理2～3 min去除紅細(xì)胞，用PBS洗滌2次，RPMI-1640培養(yǎng)液洗1次后，將細(xì)胞懸于含rmGM-CSF(100 μg/L)和rmIL-4(100 μg/L)的含10% 胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)液中(細(xì)胞濃度為1×109cells/L)培養(yǎng)。每2 d半量換液加全量細(xì)胞因子1次，第6 d時，用100 mg/L U14細(xì)胞凍融抗原刺激DCs 24 h，收集疏松貼壁細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞CD11c、CD86和CD80的表達(dá)。倒置顯微鏡每日觀察細(xì)胞形態(tài)。

3.4ADM聯(lián)合DCs瘤苗的體內(nèi)抗腫瘤效應(yīng) KM小鼠皮下接種1×106個腫瘤細(xì)胞。第7 d平衡各組腫瘤體積，將荷瘤小鼠隨機(jī)分為4組(n=6)：對照組(PBS組)、ADM組、DCs疫苗組和ADM聯(lián)合DCs治療組。各組實驗動物分別于接種腫瘤細(xì)胞后第 7、12、17 d給予相應(yīng)治療：PBS 對照組小鼠注射 PBS 0.1 mL, ADM組按6 mg/kg注射0.1 mL ADM，DCs 疫苗組注射DCs 1×106個(0.1 mL)，聯(lián)合治療組在注射同劑量ADM后36 h注射相同劑量DCs。方法采用腫瘤周圍多點注射。觀察腫瘤生長情況?？ǔ邷y量腫瘤的長徑 a和短徑 b，按V=1/2ab2算出腫瘤體積。接種腫瘤細(xì)胞第 21 d頸椎脫臼法處死動物，剝離腫瘤組織，濾紙吸干后稱重，計算抑瘤率。抑瘤率(%)=1-治療組腫瘤重量(或體積)/對照組腫瘤重量(或體積)×100%?？傄至雎蕿橹亓考绑w積兩組抑瘤率的均數(shù)。

3.5ELISA 法檢測荷瘤小鼠血清中細(xì)胞因子的含量 荷瘤小鼠在頸椎脫臼法處死前，摘眼球取血，收集血清，ELISA檢測血清中 IL-12、IL-2和干擾素γ(interferon γ,IFN-γ)的水平，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

4統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)作統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 (mean±SD)表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1荷瘤小鼠模型

小鼠皮下接種腫瘤后1～4 d生長較緩慢，以后迅速增長，多數(shù)呈類似橢圓形生長，第7 d時，注射部位出現(xiàn)明顯質(zhì)地較硬的結(jié)節(jié)，成瘤率達(dá)100%。

2DCs的形態(tài)學(xué)觀察

小鼠骨髓細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，可觀察到部分細(xì)胞呈集落樣生長，胞體為圓形，第3 d可見部分細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)不規(guī)則，體積增大，且形成的集落變大，數(shù)量增多，懸浮細(xì)胞增多；培養(yǎng)4～6 d，懸浮細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，細(xì)胞表面毛刺狀突起逐漸明顯；培養(yǎng)6 d加入腫瘤凍融抗原繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞表面毛刺狀突起更加明顯，形成典型的DCs形態(tài)特征，見圖1。

Figure 1. Morphology of the DCs under inverted microscope.A: the 3rd day; B: the 5th day; C: the 7th day.

圖1倒置顯微鏡觀察DCs的形態(tài)

3DCs表型測定

小鼠骨髓細(xì)胞培養(yǎng)7 d后，用吸管輕吹板底，收集細(xì)胞。應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測腫瘤抗原致敏的DCs，均高表達(dá)CD11c(74.37%±7.62%)、CD80(79.92%±6.58%)和CD86 (86.83%±7.31%)。

4荷瘤小鼠治療效果

小鼠皮下接種腫瘤細(xì)胞建立荷瘤小鼠模型后，全部成瘤。接種后前5 d腫瘤生長較緩慢，以后腫瘤體積迅速增長，第7 d平均體積約0.4 cm×0.4 cm×0.4 cm左右，給予第1次治療。接種腫瘤第17 d測量腫瘤體積，聯(lián)合治療組和ADM組小鼠腫瘤體積均小于對照組(P<0.05)，第21 d時腫瘤體積大小為 ADM聯(lián)合DCs疫苗組

5ELISA法檢測荷瘤小鼠血清中細(xì)胞因子的含量

ELISA檢測各實驗組小鼠血清，顯示聯(lián)合治療組荷瘤小鼠外周血血清中IL-2、IL-12和IFN-γ 高于ADM組、DCs治療組和對照組(P<0.05)，見圖3。

表1荷瘤小鼠不同時間皮下腫瘤體積

Table 1. The tumor volume of tumor-bearing mice at different time points(cm3. Mean±SD.n=6)

Group10d17d21dControl3.566±0.3985.492±0.7318.341±0.687DCs3.008±0.3673.914±0.7724.664±0.435*ADM2.297±0.2542.735±0.521*3.513±0.348*☆DCs+ADM2.138±0.3602.269±0.418*2.451±0.325*☆△

*P<0.05vscontrol；☆P<0.05vsDCs；△P<0.05vsADM.

Figure 2. The weight of tumor on tumor-bearing mice in different groups.Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group；☆P<0.05vsDCs；△P<0.05vsADM.

圖2各實驗組荷瘤小鼠腫瘤的重量

Figure 3. Production of cytokines in the serum of tumor-bearing mice.Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol；☆P<0.05vsDCs；△P<0.05vsADM.

圖3各組小鼠血清細(xì)胞因子水平

討 論

DCs作為一種專職抗原提呈細(xì)胞，能攝取、加工及處理抗原，并將抗原提呈給T細(xì)胞，啟動適應(yīng)性免疫應(yīng)答，從而誘導(dǎo)高效而特異的抗腫瘤免疫[3]。DCs通過酶解抗原，并以抗原肽-MHC復(fù)合物的形式表達(dá)于細(xì)胞表面，該復(fù)合物能被T細(xì)胞所識別，并能夠刺激初始T細(xì)胞增殖，激發(fā)特異性的細(xì)胞毒性作用。因此，以 DCs 為基礎(chǔ)的免疫療法在當(dāng)今腫瘤治療中是最有價值的方法之一。

然而由于腫瘤患者體內(nèi)腫瘤免疫抑制作用的影響，DCs處于失能狀態(tài)，難以激發(fā)機(jī)體有效的抗腫瘤免疫反應(yīng)[4]，同時腫瘤細(xì)胞免疫原性低、宿主對腫瘤抗原缺乏反應(yīng)是惡性腫瘤發(fā)生和發(fā)展的重要因素。目前DCs疫苗主要是通過人工合成某種已知抗原肽、核酸、腫瘤細(xì)胞等致敏自體DCs細(xì)胞制備而成，從而激活體內(nèi)特異性細(xì)胞毒反應(yīng)[5]，是以 DCs 為基礎(chǔ)腫瘤免疫治療的基本原理，然而單一的免疫治療效果并非如人們所期待的，近年來已有不少學(xué)者發(fā)現(xiàn)接受自體DCs疫苗治療的患者，病情有所加重，生存期縮短[6]，出現(xiàn)DCs功能抑制，引起機(jī)體對腫瘤抗原的免疫耐受并促進(jìn)腫瘤生長[7]，表明DCs疫苗的臨床應(yīng)用還存在許多亟待解決的問題[8]。

研究表明，免疫的最佳“危險信號”是漸進(jìn)性壞死的腫瘤細(xì)胞或凋亡小體，這些細(xì)胞或小體可釋放腫瘤相關(guān)抗原[9]?；熕幬锸强鼓[瘤治療的重要手段之一，化療藥物可引起腫瘤細(xì)胞的死亡，其死亡方式包括壞死或凋亡。這些死亡的細(xì)胞或其產(chǎn)物可向DCs提供抗原。ADM在體內(nèi)外都能誘導(dǎo)免疫原性瘤細(xì)胞死亡，而不影響DCs疫苗的免疫原性，且能增強(qiáng)其抗腫瘤作用[2]。本研究應(yīng)用ADM聯(lián)合腫瘤抗原致敏的DCs疫苗，研究其對荷瘤小鼠的抗腫瘤免疫效應(yīng)，結(jié)果顯示ADM聯(lián)合DCs疫苗治療后，能夠抑制荷瘤小鼠腫瘤的生長，血清IL-2、IFN-γ和IL-12水平也較其它對照組高。IL-2、IL-12和IFN-γ在機(jī)體抗腫瘤免疫中發(fā)揮重要作用，如IL-2和IL-12刺激自然殺傷細(xì)胞或CTL的殺瘤活性，IFN-γ具有較強(qiáng)的抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用。IL-2和IFN-γ均為 Th1細(xì)胞直接分泌，IL-12主要由DCs等專職APC產(chǎn)生，是CD4+Th0細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化的主要誘導(dǎo)因子。IL-2是CD4+T和CD8+T細(xì)胞增殖和分化的因子。本實驗所檢測的細(xì)胞因子結(jié)果間接說明了聯(lián)合治療組小鼠機(jī)體的免疫系統(tǒng)已處于活化狀態(tài)[10]。

對于腫瘤細(xì)胞抗原的最適提呈，不僅需要尚未成熟的DCs對凋亡細(xì)胞的吞噬，且需要DCs通過與凋亡腫瘤細(xì)胞或其產(chǎn)物接觸從而活化和成熟[11-12]。DCs與凋亡小體接觸后，提供腫瘤相關(guān)抗原及活化/成熟的環(huán)境。研究表明，DCs注入到荷高自發(fā)凋亡率腫瘤的機(jī)體后，或DCs注入結(jié)合凋亡誘導(dǎo)治療后，可誘導(dǎo)抗腫瘤應(yīng)答的產(chǎn)生[13]。本實驗結(jié)果亦證實了體外誘導(dǎo)成熟的DCs聯(lián)合化療藥物能抑制腫瘤的生長，并刺激抗腫瘤免疫應(yīng)答反應(yīng)。ADM處理荷瘤小鼠后，死亡的腫瘤細(xì)胞有可能被髓細(xì)胞樣的和漿細(xì)胞樣的DCs高效率吞噬，從而誘導(dǎo)抗腫瘤免疫應(yīng)答必需的抗原特異性CTL。研究發(fā)現(xiàn)，ADM可增加胃癌細(xì)胞熱休克蛋白70的表達(dá)以及DCs對腫瘤細(xì)胞組分的攝取從而上調(diào)DCs分泌IL-12[14]。ADM處理的腫瘤細(xì)胞抗原沖擊的DCs對T細(xì)胞刺激后，亦可引起IFN-γ釋放增加，在本實驗中得到證實。據(jù)報道，疫苗接種前一次性或反復(fù)給予ADM不會阻礙肽沖擊DCs和可溶性抗原疫苗的免疫原性；這種結(jié)合療法可誘導(dǎo)有效的T細(xì)胞反應(yīng)[2]。DCs作為APC用于腫瘤生物治療發(fā)揮了一定的療效，但腫瘤機(jī)體內(nèi)DCs數(shù)量少，功能缺陷，應(yīng)用化療藥物和體外特異性腫瘤抗原致敏的DCs對腫瘤患者進(jìn)行聯(lián)合治療，為DCs的應(yīng)用及腫瘤治療提供了研究思路與理論依據(jù)。

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Effectofadriamycincombinedwithsensitizeddendriticcellsoncervicaltumor-bearingmice

ZENG Xiao-ping2, WANG Hong-mei1, HUANG Yong-hong1, ZHOU Xiao-yan1, CAI Zhen-yu1, XU Fang-yun1

(1DepartmentofPathophysiology,2DepartmentofImmunology,BasicMedicalCollegeofNanchangUniversity,Nanchang330006,China.E-mail:wanghongmay@hotmail.com)

AIM: To explore the immunotherapeutic effect of adriamycin (ADM) combined with frozen-thawed antigen-sensitized dendritic cells (DCs) on cervical tumor-bearing mice.METHODSThe U14 cervical cancer model of Kunming mice was established by subcutaneous implantion of U14 cells in axillary fossa. DCs vaccine was prepared by U14 cervical cancer cell frozen-thawed antigen-sensitized mouse bone marrow-derived DCs. Mature phenotype of sensitized DCs was identified by flow cytometry. Tumor-bearing mice were randomly divided into 4 groups and treated for 3 cycles with PBS (control), DCs vaccine, ADM and ADM combined with DCs vaccine, respectively. The tumor volume was evaluated. The tumor weight and the levels of interleukin-2 (IL-2), IL-12 and interferon γ (IFN-γ) in the serum were determined by ELISA on the 21st day.RESULTSCancer cell frozen-thawed antigen-sensitized DCs had higher expression levels of CD11C, CD80 and CD86. The volume and weight of the tumor in ADM combined with DCs vaccine group were less than those in ADM group, DCs vaccine group and control group. The tumor inhibitory rate in combination group was higher than that in the other 3 groups. Compared with the other 3 groups, the serum levels of IL-2, IL-12 and IFN-γ in combination group significantly increased.CONCLUSIONADM combined with tumor antigen-sensitized DCs vaccine can strengthen the animal antitumor immune response and effectively inhibit the growth of tumor in cervical tumor-bearing mice.

Dendritic cells; Adriamycin; Tumor immunotherapy; Uterine cervical neoplasms

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.04.028

1000- 4718(2013)04- 0734- 05

2012- 09- 07

2013- 03- 08

江西省教育廳基金資助項目(No.GJJ08086)；江西省衛(wèi)生廳基金資助項目(No.20072015)

△通訊作者 Tel: 0791-88608348； E-mail: wanghongmay@hotmail.com