張晨月, 張 舒, 吳 瑩, 金葉智, 李根茂, 王 謙, 郝 鈺
(北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,北京 100029)
犀角地黃湯合銀翹散對流感病毒感染的小鼠肺組織及大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1和VCAM-1表達(dá)的影響*
張晨月, 張 舒, 吳 瑩, 金葉智, 李根茂, 王 謙, 郝 鈺△
(北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,北京 100029)
目的研究中醫(yī)經(jīng)典合方犀角地黃湯合銀翹散(XDY)對流感病毒性肺炎小鼠肺組織及對流感病毒感染的大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(RPMVECs)中細(xì)胞間黏附分子1(ICAM-1)和血管細(xì)胞黏附分子1(VCAM-1)表達(dá)的影響,探討其治療病毒性肺炎的機(jī)制。方法54只雄性BALB/c小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組和XDY組,每組18只,后2組以流感病毒滴鼻感染,XDY組灌胃給予XDY;在感染后的2、4和6 d分別取材,免疫組化法觀察肺組織中ICAM-1和VCAM-1表達(dá)。從雄性Wistar大鼠中分離并原代培養(yǎng)RPMVECs,設(shè)置正常組、病毒組、病毒+XDY含藥血清組、腫瘤壞死因子α(TNF-α)組和TNF-α+XDY含藥血清組;刺激因素作用24 h后,real-time PCR檢測ICAM-1和VCAM-1 mRNA水平,流式細(xì)胞術(shù)檢測ICAM-1和VCAM-1蛋白表達(dá)。結(jié)果與正常組比較,模型組肺組織中ICAM-1和VCAM-1表達(dá)持續(xù)增多(P<0.01),而XDY組的表達(dá)均低于模型組 (P<0.01);與正常組比較,流感病毒和TNF-α作用的RPMVECs中 ICAM-1和VCAM-1 mRNA及蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.01),XDY能下調(diào)ICAM-1和VCAM-1 mRNA及蛋白表達(dá) (P<0.01)。結(jié)論抑制流感病毒感染導(dǎo)致的RPMVECs黏附分子的表達(dá)從而抑制機(jī)體的炎癥級聯(lián)反應(yīng)可能是XDY治療流感病毒性肺炎的作用機(jī)制之一。
犀角地黃湯合銀翹散; 病毒性肺炎; 流感病毒; 肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞; 細(xì)胞間黏附分子1; 血管細(xì)胞黏附分子1
病毒性肺炎是流感最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一,導(dǎo)致較高的死亡率[1]。因此,病毒性肺炎的防治在流感的治療中尤為重要。犀角地黃湯合銀翹散(Xijiao Dihuang and Yinqiao San decoction, XDY)是源于吳鞠通《溫病條辨·上焦篇》的經(jīng)典合方,該方以銀翹散清解衛(wèi)分之毒,以犀角地黃湯解營血之毒,兩方相合,具有清熱解毒、涼血止血、化瘀通絡(luò)之功效,臨床上臨證加減用于治療病毒性肺炎[2]。前期研究證實(shí),流感病毒性肺炎小鼠肺組織有大量炎癥細(xì)胞浸潤,XDY對流感病毒沒有直接的抗病毒作用,但可減少肺組織中炎癥細(xì)胞的浸潤,主要通過抑制病毒所致的炎癥級聯(lián)反應(yīng)起到治療作用[3]。黏附分子在白細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附、穿越血管壁而滲出的過程中發(fā)揮重要作用[4],因此,本研究以流感病毒感染的小鼠為模型,觀察XDY對病毒性肺炎小鼠細(xì)胞間黏附分子1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)和血管細(xì)胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)表達(dá)的影響;以大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(rat pulmonary microvascular endothelial cells, RPMVECs)為模型,研究XDY含藥血清對流感病毒感染的RPMVECs中ICAM-1和VCAM-1表達(dá)影響,探討XDY治療病毒性肺炎的相關(guān)分子機(jī)制。
1材料
1.1動物及病毒株 BALB/c小鼠(動物合格證號為SGXK20070001)和清潔雄性Wistar大鼠(動物合格證號為SGXK20120001)購自北京維通利華實(shí)驗動物中心;流感病毒亞洲甲型鼠肺適應(yīng)株A/FM/1/34(H1N1),由中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒學(xué)研究所提供,于9日齡雞胚尿囊腔連續(xù)傳代2次后,血凝滴度為1∶512。采用Reed Muench法[5]測定計算其對小鼠的半數(shù)致死量(50%lethal dose,LD50)為10-3.877, 半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(50%tissue culture infectious dose,TCID50)為10-4.6/0.1 L。
1.2主要試劑 反轉(zhuǎn)錄試劑購自Fermentas MBI,PCR試劑購自大連寶生物工程有限公司,ICAM-1抗體和重組大鼠TNF-α購自Proteintech,SABC免疫組化試劑盒和VCAM-1抗體購自博士德。M199和胎牛血清購自HyClone,雙抗和胰蛋白酶-EDTA消化液購自Solarbio,RNeasy Mini Kit 購自Qiagen,Gold View和DNA MarkerⅠ購自北京科宏博恩。內(nèi)皮細(xì)胞生長添加劑(Endothelial Cell Growth Supplement,ECGS)、PE Mouse Anti-Rat CD106和PE Mouse Anti-RatCD54購自BD。Rabbit Anti-PECAM-1購自北京博奧森。Real-time PCR引物:ICAM-1上游引物5’-AGG TATCCA TCC ATC CCA CA-3’,下游引物5’-GCC ACA GTT CTC AAA GCA CA-3’; VCAM-1上游引物5’-TGA CAT CTC CCC TGG ATC TC-3’,下游引物5’-CTC CAG TTT CCT TCG CTG AC-3’,由奧科生物科技有限公司合成。
1.3藥物 XDY復(fù)方,由水牛角30 g(代替犀角)、生地黃30 g、芍藥12 g、丹皮9 g、連翹9 g、金銀花9 g、苦桔梗6 g、薄荷6 g、竹葉4 g、生甘草5 g、荊芥穗5 g、淡豆豉5 g和牛蒡子9 g組成1劑,藥材購自北京同仁堂藥店。成人生藥量2.3 g·kg-1·d-1,小鼠的等效劑量為成人的10倍,即23 g·kg-1·d-1。大鼠的等效劑量為成人的6.3倍,即13.8 g·kg-1·d-1。將藥材煎制濃縮為含生藥2.07 kg/L的合劑,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
2方法
2.1動物分組和造模 雄性BALB/c小鼠54只,體重16~18 g,隨機(jī)分為正常組、模型組和XDY組,每組18只。小鼠在乙醚輕度麻醉下,除正常組外每只小鼠以25 μL 50 LD50病毒液滴鼻感染,正常組用等量無菌PBS液滴鼻。感染后1 h,正常組和模型組予以雙蒸水灌胃;XDY組給XDY 23 g·kg-1·d-1灌胃;各組均為給藥2次/d,連續(xù)給藥5 d。
2.2免疫組化法檢測小鼠肺組織中ICAM-1和VCAM-1表達(dá) 感染后第2天、第4天和第6天,每組取6只小鼠處死,摘取肺臟,取全肺做常規(guī)固定、石蠟包埋、切片后,按試劑盒說明書操作。每組切片隨機(jī)選5張,每張取5個高倍(×400)視野,用高清晰度Olympus BX51光學(xué)顯微鏡加制冷攝像頭采集圖像,Image-Pro? Plus 5.1 圖像分析軟件測定肺內(nèi)ICAM-1和VCAM-1蛋白表達(dá),并計算其陽性表達(dá)積分吸光度(integral absorbance,IA)。
2.3XDY含藥血清的制備 Wistar大鼠,體重300 g左右,隨機(jī)分為2組,含藥血清組及正常組。含藥血清組給予XDY藥液13.8 g·kg-1·d-1灌胃,正常組給予等體積的生理鹽水,每日2次,連續(xù)3 d,于末次灌藥前12 h禁食。第4天早晨末次灌藥后1 h,10%水合氯醛腹腔注射麻醉,腹主動脈采血,室溫靜置4 h后,3 000 r/min離心15 min,分離血清,經(jīng)56 ℃、30 min滅活處理后,-70 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>
2.4RPMVECs原代培養(yǎng)及鑒定 根據(jù)姜明等[6]的方法,原代培養(yǎng)RPMVECs并進(jìn)行鑒定。
2.5熒光定量PCR檢測RPMVECs中ICAM-1和VCAM-1 mRNA水平 原代培養(yǎng)RPMVECs,設(shè)置正常組、病毒組、病毒加XDY含藥血清組、TNF-α組和TNF-α加XDY含藥血清組(上述各組病毒最終滴度為100 TCID50,TNF-α終濃度為100 μg/L,含藥血清終濃度為15%)。干預(yù)因素作用24 h后,收集各組細(xì)胞,按RNeasy Mini Kit試劑盒操作說明書提取各組細(xì)胞總RNA,用TE綬沖液10倍稀釋。PCR擴(kuò)增按One Step SYBR Prime Script PT-PCR kitⅡ試劑盒說明書進(jìn)行。擴(kuò)增條件為:Pattern 1:42 ℃ 5 min;95 ℃10 s;Pattern 2:循環(huán)40,95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,測得Ct值。結(jié)果以目的基因與內(nèi)參基因的比值表示。
2.6流式細(xì)胞術(shù)檢測ICAM-1和VCAM-1蛋白的表達(dá) 原代培養(yǎng)RPMVECs,分組同2.5。干預(yù)因素作用24 h,消化細(xì)胞,4 ℃、1 000 r/min離心5 min,棄上清,PBS溶液洗滌3次后,PE標(biāo)記的ICAM-1和VCAM-1孵育30 min,4 ℃、1 000 r/min離心5 min,棄上清,再用PBS溶液洗滌3次后,4%多聚甲醛固定,流式細(xì)胞術(shù)檢測平均熒光強(qiáng)度。
3統(tǒng)計學(xué)處理
數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。多組間差異采用單因素方差分析(One-way ANOVA),組間兩兩比較用LSD法,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
1XDY對肺組織中ICAM-1和VCAM-1表達(dá)的影響
感染后第6天各組肺組織ICAM-1和VCAM-1的免疫組化染色見圖1。流感病毒感染小鼠后第2天、第4天和第6天,模型組肺組織中ICAM-1和VCAM-1表達(dá)明顯增多,與正常組相比差異顯著(P<0.01)。XDY組黏附分子的表達(dá)在各個時點(diǎn)均低于模型組,差異顯著(P<0.01),見圖2。
2Real-timePCR檢測流感病毒感染的RPMVECs中ICAM-1和VCAM-1mRNA水平
流感病毒感染RPMVECs 24 h后,病毒組ICAM-1和VCAM-1 mRNA表達(dá)明顯增多,與正常組相比有顯著差異(P<0.01),病毒加XDY含藥血清組黏附分子mRNA的表達(dá)低于模型組,差異顯著(P<0.01);TNF-α組ICAM-1和VCAM-1 mRNA表達(dá)明顯增多,與正常組相比差異顯著(P<0.01),TNF-α加XDY含藥血清組黏附分子mRNA的表達(dá)低于TNF-α組,差異顯著(P<0.01),見圖3。
Figure 1. Effect of XDY prescription on ICAM-1 and VCAM-1 expression in the lungs of mice with viral pneumonia on the 6th day after infection. A: control; B: mice were infected with influenza virus; C: mice were infected with influenza virus then treated with XDY.
圖1感染后第6天小鼠肺組織ICAM-1和VCAM-1的表達(dá)
Figure 2. Effects of XDY prescription on ICAM-1 (A) and VCAM-1(B) expression in the lungs of mice with viral pneumonia. Mean±SD.n=6.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsmodel group.
圖2XDY對病毒性肺炎小鼠肺組織中ICAM-1和VCAM-1表達(dá)的影響
Figure 3. Effects of XDY prescription on ICAM-1 and VCAM-1 mRNA expression in RPMVECs exposed to virus or TNF-α. Mean±SD.n=3.△△P<0.01vscontrol group;**P<0.01vsvirus group;##P<0.01vsTNF-α group.
圖3XDY對流感病毒感染的RPMVECs中ICAM-1和VCAM-1mRNA表達(dá)的影響
3流式細(xì)胞術(shù)檢測流感病毒感染的RPMVECs中ICAM-1和VCAM-1蛋白的表達(dá)
干預(yù)因素作用24 h,與正常組比較,病毒組和TNF-α組RPMVECs的ICAM-1和VCAM-1表達(dá)升高,均有顯著差異(P<0.01);與病毒組相比,病毒加含藥血清組ICAM-1和VCAM-1表達(dá)降低,且均有顯著差異(P<0.01);與TNF-α組相比,TNF-α加XDY含藥血清組ICAM-1和VCAM-1表達(dá)降低,且均有顯著差異(P<0.01),見圖4、5和表1。
XDY是治療病毒性肺炎的經(jīng)典合方。前期研究已經(jīng)證明該方可降低病毒性肺炎小鼠的死亡率,延長生存時間;體外研究表明XDY含藥血清可明顯抑制流感病毒感染后肺泡巨噬細(xì)胞炎癥細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)及自由基的產(chǎn)生,具有抗炎作用[7]。本研究探討了XDY對流感病毒感染的小鼠肺組織及體外RPMVECs中黏附分子ICAM-1和VCAM-1表達(dá)的影響,以進(jìn)一步闡述該方治療流感病毒性肺炎的作用機(jī)制。
病毒性肺炎是流感的常見并發(fā)癥,是導(dǎo)致流感較高死亡率的重要原因。前期研究表明,流感病毒在感染肺組織中的滴度與肺的病理改變并不同步,肺部炎性病變的發(fā)生不僅與病毒對細(xì)胞的直接作用有關(guān),還與病毒感染后機(jī)體發(fā)生的炎癥級聯(lián)反應(yīng)密切相關(guān),過度的炎癥反應(yīng)似乎在病毒性肺炎的發(fā)病過程中更為重要[3]。流感病毒感染后,體內(nèi)單核巨噬細(xì)胞在肺組織周圍聚集并被激活,巨噬細(xì)胞釋放大量的前炎癥因子如TNF-α、趨化性細(xì)胞因子MCP-1及自由基等,在炎癥因子作用下,肺泡上皮細(xì)胞和微血管內(nèi)皮細(xì)胞被激活,高表達(dá)ICAM-1、VCAM-1等黏附分子,吸引更多炎癥細(xì)胞聚集和過度活化,形成瀑布效應(yīng),導(dǎo)致嚴(yán)重病理損傷[4]。因此,ICAM-1和VCAM-1在病毒性肺炎的發(fā)病過程中尤為重要。有研究報道TNF-α通過與TNF-α受體作用導(dǎo)致磷脂酶C的激活,繼而水解PC-PLC產(chǎn)生DAG,從而激活PKC;上述通路參與調(diào)節(jié)TNF-α誘導(dǎo)NF-κB的激活,并與ICAM-1基因啟動子中的共識序列結(jié)合導(dǎo)致了ICAM-1表達(dá)升高[8]。又有研究證實(shí)內(nèi)皮細(xì)胞上ICAM-1表達(dá)升高還會通過NF-κB之外的其它信號通路導(dǎo)致VCAM-1的升高[9]。
ICAM-1和VCAM-1是目前發(fā)現(xiàn)的介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞與白細(xì)胞之間相互黏附的免疫球蛋白超家族黏附分子中最重要的兩種,分別通過與整合素家族的αLβ2和α4相結(jié)合發(fā)揮作用[10]。ICAM-1主要表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞及淋巴細(xì)胞等的細(xì)胞膜表面,正常情況下表達(dá)量較低,炎癥因子刺激后,表達(dá)量迅速增加[11]。ICAM-1分子與αLβ2相互作用導(dǎo)致白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷徙最終積聚于炎癥部位[4、12]。研究發(fā)現(xiàn),炎癥細(xì)胞黏附是腺病毒和呼吸道合胞病毒肺炎中肺部感染的重要環(huán)節(jié),ICAM-1和其受體的相互作用又是炎癥細(xì)胞黏附、聚集的關(guān)鍵[13]。
Figure 4. The ICAM-1 expression detected by flow cytometry in RPMVECs exposed to virus or TNF-α. A:control group;B:virus group; C:virus+XDY group; D:TNF-α group; E:TNF-α+XDY group.
圖4流感病毒感染的RPMVECs中ICAM-1的表達(dá)
Figure 5. The VCAM-1 expression detected by flow cytometry in RPMVECs exposed to virus or TNF-α. A:control group;B:virus group; C:virus+XDY group; D:TNF-α group; E:TNF-α+XDY group.
圖5流感病毒感染的RPMVECs中VCAM-1的表達(dá)
表1XDY對流感病毒感染的RPMVECs中ICAM-1和VCAM-1蛋白表達(dá)的影響
Table 1. Effects of XDY on the protein expression of ICAM-1 and VCAM-1 in RPMVECs exposed to virus or TNF-α (IA.Mean±SD.n=3)
GroupICAM-1VCAM-1Control1221.50±115.161514.40±111.90Virus2367.70±142.29△△2970.40±113.06△△Virus+XDY2066.50±113.13**2385.60±111.28**TNF-α4156.60±124.94△△2431.10±111.87△△TNF-α+XDY1163.20±114.93##2140.80±113.03##
△△P<0.01vscontrol group;**P<0.01vsvirus group;##P<0.01vsTNF-α group
VCAM-1又名可誘導(dǎo)性細(xì)胞黏附分子,不僅可以在IL-1、TNF-α、IFN-γ等炎癥細(xì)胞因子的誘導(dǎo)下表達(dá)增加,其表達(dá)也能誘導(dǎo)細(xì)胞因子以及一些趨化因子的產(chǎn)生[14]。VCAM-1的表達(dá)也是非組成性的,在正常狀態(tài)下表達(dá)很少或不表達(dá)。在細(xì)胞因子(如TNF-α、IL-1β等)或內(nèi)毒素的刺激下表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞以及樹突狀細(xì)胞的表面,同時可介導(dǎo)白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附,介導(dǎo)炎癥反應(yīng)由急性期轉(zhuǎn)向慢性期的過度階段中單核細(xì)胞的聚集[15]。
本研究發(fā)現(xiàn)XDY組黏附分子的表達(dá)在各個時點(diǎn)均低于模型組,證實(shí)了XDY能下調(diào)流感病毒引起的黏附分子的升高。前期研究證實(shí)XDY能抑制流感病毒感染肺組織中TNF-α的產(chǎn)生,而TNF-α又可誘導(dǎo)ICAM-1和VCAM-1的高表達(dá)。那么XDY降低ICAM-1和VCAM-1表達(dá)的作用是否與其對TNF-α的抑制有關(guān)呢?為此,本研究進(jìn)一步觀察了XDY對TNF-α刺激RPMVECs后ICAM-1、VCAM-1表達(dá)的影響,結(jié)果表明XDY能降低TNF-α所致黏附分子表達(dá)的升高。這說明不論對病毒還是炎癥因子誘導(dǎo)的ICAM-1、VCAM-1高表達(dá),XDY均有直接的抑制作用,從而證實(shí)了該方可作用于病毒感染后炎癥級聯(lián)反應(yīng)中多個環(huán)節(jié)發(fā)揮治療作用。該方抗炎作用中的具體環(huán)節(jié)及作用的分子機(jī)制,我們將在今后的研究中進(jìn)一步探討。
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EffectsofXijiaoDihuangandYinqiaoSandecoctiononICAM-1andVCAM-1expressioninmouselungtissuesandratpulmonarymicrovascularendothelialcellsinfectedwithinfluenzavirus
ZHANG Chen-yue, ZHANG Shu, WU Ying, KIM Ye-ji, LI Gen-mao, WANG Qian, HAO Yu
(SchoolofBasicMedicalSciences,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China.E-mail:yuhao64@sina.com)
AIM: To investigate the effects of Xijiao Dihuang and Yinqiao San decoction (XDY) on the expression of intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) and vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) in mouse lung tissues and rat pulmonary microvascular endothelial cells (RPMVECs) infected with influenza virus, and to explore its mechanism for treatment of viral pneumonia.METHODSFifty-four male BALB/c mice were randomly divided into normal group, model group and XDY group (n=18 in each group). The viral pneumonia model was established by intranasally dripping influenza A (H1N1) virus into the mice. The mice in XDY group were treated with XDY 1 h after dripping the virus. The expression of ICAM-1 and VCAM-1 in lung tissues was examined by immunohistochemical staining 2, 4 and 6 d after infection. On the other hand, RPMVECs were obtained from male Wistar rats and primarily cultured. The cells were randomly divided into control group, virus group, virus+XDY group, tumor necrosis factor α (TNF-α) group and TNF-α+XDY group. The mRNA and protein expression of ICAM-1 and VCAM-1 was evaluated by real-time PCR and flow cytometry 24 h after infection.RESULTSVirus exposure increased ICAM-1 and VCAM-1 expression in mouse lung tissues (P<0.01), and XDY treatment attenuated this effect (P<0.01). Virus and TNF-α both led to the increases in mRNA and protein expression of ICAM-1 and VCAM-1 in RPMVECs (P<0.01), which were also reduced by treatment with XDY (P<0.01).CONCLUSIONTreatment with XDY decreases virus-induced ICAM-1 and VCAM-1 expression, suggesting an important role of XDY in treatment of viral pneumonia.
Xijiao Dihuang and Yinqiao San decoction; Viral pneumonia; Influenza virus; Pulmonary microvascular endothelial cells; Intercellular adhesion molecule-1; Vascular cell adhesion molecule-1
R364.5
A
1000- 4718(2013)09- 1685- 06
2013- 05- 10
2013- 07- 17
國家自然科學(xué)基金資助項目(No.30772871)
△通訊作者 Tel: 010-64286973; E-mail: yuhao64@sina.com
10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.09.026