惡性胸水中醛縮酶A的水平及其對(duì)人肺腺癌細(xì)胞增殖、遷移與侵襲能力的影響*

馮小鵬， 孫珍貴， 汪向海， 邢 敏， 陳興無(wú)

(皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院呼吸內(nèi)科，安徽 蕪湖 241001)

惡性胸水中醛縮酶A的水平及其對(duì)人肺腺癌細(xì)胞增殖、遷移與侵襲能力的影響*

馮小鵬#， 孫珍貴， 汪向海， 邢 敏， 陳興無(wú)△

(皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院呼吸內(nèi)科，安徽 蕪湖 241001)

目的比較肺癌患者伴惡性胸水(MPE)和結(jié)核性胸膜炎患者胸水(TBPE)中醛縮酶A(ALDOA)的表達(dá)水平及其與癌胚抗原(CEA)和乳酸脫氫酶(LDH)的相關(guān)性，探討ALDOA對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響。方法ELISA和化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)65例MPE和35例TBPE中ALDOA、CEA和LDH水平；以不同濃度的ALDOA作用于A549細(xì)胞，分別采用MTT 法、劃痕及體外侵襲實(shí)驗(yàn)研究ALDOA對(duì)A549細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響。結(jié)果MPE中ALDOA濃度[(46.8±21.4) μg/L]明顯高于TBPE[(23.9±17.2) μg/L](P<0.01)，其中腺癌[(71.7±32.1) μg/L]明顯高于鱗癌[(21.3±14.6) μg/L](P<0.05)；MPE中CEA和LDH水平[(82.2±56.6) μg/L和(755.8±382.5) U/L]也明顯高于TBPE[(12.6±9.7)μg/L和(388.4±163.9) U/L](P<0.01)。2組患者胸水中ALDOA與CEA和LDH均呈正相關(guān)關(guān)系(P<0.01或P<0.05)。不同濃度ALDOA刺激A549細(xì)胞后，細(xì)胞增殖增強(qiáng)且遷移、侵襲加快，并呈濃度依賴性。結(jié)論肺癌患者M(jìn)PE中ALDOA表達(dá)水平明顯高于TBPE中的水平，其中肺腺癌胸水ALDOA水平明顯高于鱗癌；ALDOA與CEA和LDH水平高度正相關(guān)；ALDOA濃度依賴性地增強(qiáng)肺腺癌A549細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。

醛縮酶A； 胸水； 肺腫瘤； 細(xì)胞增殖; 細(xì)胞遷移； 腫瘤侵襲

肺癌是全球最常見(jiàn)的惡性腫瘤及死亡的首要原因，非小細(xì)胞肺癌(non-small-cell lung cancer,NSCLC)是最常見(jiàn)的類型[1]，尤其肺腺癌的發(fā)病率迅速增加，占全部肺癌的40%左右[2]。盡管診斷、治療取得較大進(jìn)展，NSCLC長(zhǎng)期生存率仍不能令人滿意，5年存活率低于15%[3]。早期蔓延或轉(zhuǎn)移是其5年生存率低的主要原因[4]。轉(zhuǎn)移到胸膜形成惡性胸水(malignant pleural effusion，MPE)是一種常見(jiàn)的并發(fā)癥[5]，部分患者甚至是就診的首發(fā)表現(xiàn)。顯微鏡下，可見(jiàn)胸膜表面有眾多的腫瘤浸潤(rùn)病灶，表明癌細(xì)胞具高度侵襲性，但癌細(xì)胞進(jìn)入胸膜腔以及促進(jìn)胸膜轉(zhuǎn)移灶蔓延的機(jī)制仍有待進(jìn)一步探討。

癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的重要標(biāo)志是持續(xù)性增殖和運(yùn)動(dòng)性增強(qiáng)，許多介質(zhì)發(fā)揮了重要作用。細(xì)胞周圍微環(huán)境營(yíng)養(yǎng)缺乏、pH變化和氧合不足誘導(dǎo)代謝和增殖狀態(tài)的改變，有利于癌細(xì)胞在轉(zhuǎn)移部位的生存。MPE提供癌癥細(xì)胞生存的微環(huán)境和有關(guān)介質(zhì)，可促進(jìn)癌細(xì)胞在胸膜腔的生長(zhǎng)和遷移[6]。

缺氧是實(shí)體腫瘤組織內(nèi)廣泛存在的現(xiàn)象，此時(shí)癌細(xì)胞氧利用率高，糖酵解增強(qiáng)。醛縮酶A(果糖1，6-二磷酸醛縮酶，fructose 1,6-bisphosphate aldolase A, ALDOA)是糖酵解過(guò)程的關(guān)鍵酶之一，催化果糖-1,6-二磷酸裂解為3-磷酸甘油醛和磷酸二羥丙酮。已證明該酶在肺癌和肺癌MPE中[7-8]高表達(dá)，并且可通過(guò)某些生長(zhǎng)因子如表皮生長(zhǎng)因子結(jié)合于細(xì)胞骨架，促進(jìn)細(xì)胞遷移、加快損傷修復(fù)[9]。

我們推測(cè)肺癌患者M(jìn)PE中ALDOA水平升高，可能增進(jìn)癌細(xì)胞增殖、遷移與侵襲。本研究觀察肺癌(包括腺癌和鱗癌)MPE和結(jié)核性胸水(tuberculous pleurisy,TBPE)中ALDOA水平差異，比較ALDOA與診斷MPE有較高特異性的2種腫瘤標(biāo)志物[癌胚抗原(carcinoembryonic antigen, CEA)和乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)]的相關(guān)性；通過(guò)MTT、劃痕和Transwell小室實(shí)驗(yàn)，觀察ALDOA對(duì)人肺腺癌細(xì)胞株A549增殖、遷移和侵襲的影響，旨在探討ALDOA在肺腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移、侵襲及MPE形成中的作用。

材 料 和 方 法

1研究對(duì)象

選擇皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院呼吸內(nèi)科2010年7月～2011年6月間確診為肺癌合并胸水的住院患者(MPE組)65例[男27，女38例，平均年齡(57.8±15.3)歲]和結(jié)核性胸水患者(TBPE組)35例[男20、女15例，平均年齡(49.9±13.6)歲]。所有患者簽知情同意書。MPE診斷標(biāo)準(zhǔn)：(1)患者影像學(xué)顯示原發(fā)性支氣管肺癌合并MPE；(2)胸腔積液中找到肺癌細(xì)胞和(或)胸膜活檢標(biāo)本病理學(xué)確診為轉(zhuǎn)移性肺癌。TBPE診斷標(biāo)準(zhǔn)：胸水為滲出液，腺苷脫氨酶>40 U/L，胸膜活檢示結(jié)核性肉芽腫[10]。

2胸水采集和存儲(chǔ)

收集患者入院后首次胸腔穿刺抽取的胸水20 mL，經(jīng)3 000 r/min離心分離，留取上清等份分裝于離心管、-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

3胸水上清ALDOA濃度測(cè)定

ELISA法測(cè)定ALDOA濃度，操作步驟參照試劑盒(上海豪森生物有限公司)說(shuō)明書進(jìn)行。檢測(cè)靈敏度下限為23.5 ng/L。

4LDH和CEA水平測(cè)定

應(yīng)用全自動(dòng)生化儀、電化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)定量檢測(cè)LDH和CEA，操作按照儀器和試劑(拜耳集團(tuán)診斷部)說(shuō)明書進(jìn)行。

5細(xì)胞株及主要試劑

人肺腺癌細(xì)胞株A549由中國(guó)科技大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)，RPMI-1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶(Gibco), 胎牛血清(杭州四季清公司)，ALDOA(ProSpec)，MTT試劑(Sigma),Transwell小室(Corning)，Matrigel凝膠(北京威格拉斯生物技術(shù)有限公司)。

6A549細(xì)胞培養(yǎng)

A549細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素以及100 mg/L鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，于37 ℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，胰酶消化后進(jìn)行細(xì)胞傳代，分別根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要種于不同的培養(yǎng)板(皿)中。

7細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

將A549細(xì)胞以1×108/L接種于96孔培養(yǎng)板, 培養(yǎng)24 h后,加入含不同濃度ALDOA(0、5、25、50 μg/L)的無(wú)血清培養(yǎng)液作用24 h。然后每孔加入10 μL MTT(5 g/L),繼續(xù)培養(yǎng)4 h。終止反應(yīng)后棄上清液，每孔加入100 μL DMSO, 振蕩10 min, 至藍(lán)色結(jié)晶完全溶解,于全自動(dòng)酶標(biāo)儀570 nm處測(cè)定吸光度(A)。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

8細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

l×108/L A549細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板，完全融合后，無(wú)血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。用10 μL加樣槍槍頭尖端在細(xì)胞板上劃痕，PBS漂洗2次，每孔加入400 μL含不同濃度ALDOA(5、25、50 μg/L)的無(wú)血清培養(yǎng)液，分別于0 h、24 h在倒置相差顯微鏡下觀察、拍照，每條劃痕隨機(jī)取3處用NIH Image圖像分析軟件(ImageJ)測(cè)量劃痕寬度，取平均值計(jì)算其遷移距離，遷移距離(μm)=0 h的劃痕寬度-24 h的劃痕寬度。

9Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)

采用Transwell小室法，將生長(zhǎng)良好的A549細(xì)胞重懸于無(wú)血清培養(yǎng)液，取l×108/L細(xì)胞懸液200 μL接種于Transwell上室，下室加入500 μL含ALDOA(0、5、25、50 μg/L)的無(wú)血清培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h。取

出Transwell小室，棄培養(yǎng)液，甲醇固定20 min，將小室適當(dāng)風(fēng)干，0.1%結(jié)晶紫染色20 min；自來(lái)水洗3遍，棉簽擦盡上室面細(xì)胞，光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取3個(gè)視野，計(jì)數(shù)小室下室面的細(xì)胞數(shù)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，取平均值。

10細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)方法與9類似,但侵襲小室上室面濾膜用5 g/L Matrigel 100 μL覆蓋，風(fēng)干后用于實(shí)驗(yàn)。

11統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組間均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，雙變量相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)性分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1兩組患者胸水中ALDOA、CEA和LDH水平

肺癌MPE組和TBPE組胸水中ALDOA濃度分別為(46.8±21.4)μg/L和(23.9±17.2)μg/L，MPE組明顯高于TBPE組(P<0.01)。CEA濃度分別為(82.2±56.6)μg/L和(12.6±9.7)μg/L；LDH濃度分別為(755.8±382.5)U/L和(388.4±163.9)U/L；MPE組均明顯高于TBPE組(P<0.01)，見(jiàn)圖1。

Figure 1. Comparison of ALDOA (A),CEA (B) and LDH (C) levels in malignant pleural effusion (MPE) and tuberculous pleural effusion (TBPE).Mean±SD.n=3.**P<0.01vsTBPE.

圖1兩組患者胸水中ALDOA、CEA和LDH水平的比較

2肺腺癌和鱗癌MPE中ALDOA水平

肺腺癌和鱗癌患者M(jìn)PE中ALDOA濃度分別為：(71.7±32.1)μg/L和(21.3±14.6)μg/L，腺癌組明顯高于鱗癌組(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

Figure 2. Comparison of ALDOA in MPE from adenocarcinoma and squamous-cell carcinoma patients.Mean±SD.n=3.*P<0.05vssquamous-cell carcinoma.

圖2肺腺癌和鱗癌患者M(jìn)PE中ALDOA水平的比較

3MPE和TBPE中ALDOA與CEA和LDH的相關(guān)性

MPE中ALDOA與CEA和LDH顯著正相關(guān)(r=0.8672，P<0.01;r=0.4963，P<0.05)，TBPE中ALDOA與CEA和LDH也分別呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系(r=0.6783，P<0.01；r=0.4676，P<0.05)。

4ALDOA對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響

MTT 實(shí)驗(yàn)表明，低濃度ALDOA(5 μg/L)對(duì)A549細(xì)胞增殖無(wú)明顯影響(P>0.05)，但25和50 μg/L ALDOA明顯促進(jìn)A549細(xì)胞增殖(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

5ALDOA對(duì)A549細(xì)胞遷移的影響

細(xì)胞劃痕后經(jīng)不同濃度ALDOA刺激24 h,細(xì)胞遷移距離分別為(17.3±5.2)μm、(44.8±12.7)μm和(73.3±14.6)μm；與對(duì)照組[(13.00±4.95)μm]比較，低濃度ALDOA(5 μg/L)對(duì)A549細(xì)胞遷移無(wú)明顯影響(P>0.05)，但25和50 μg/L ALDOA組細(xì)胞遷移距離明顯增加(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

Figure 3. Effect of ALDOA on A549 cell proliferation.Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μg/L.

圖3ALDOA對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響

利用Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)ALDOA組穿透的細(xì)胞增多，并且濃度越大穿透的細(xì)胞越多。鏡下計(jì)數(shù)顯示，ALDOA組細(xì)胞穿過(guò)Transwell小室數(shù)分別為20.0±4.8、58.0±7.3和107.0±15.6；與對(duì)照組(11.0±1.5)相比，低濃度ALDOA(5 μg/L)對(duì)A549細(xì)胞遷移無(wú)明顯影響(P>0.05)，另2種濃度ALDOA組細(xì)胞穿過(guò)Transwell小室的細(xì)胞數(shù)均明顯增加(P<0.05)，而且濃度越高穿過(guò)Transwell小室的細(xì)胞數(shù)越多，見(jiàn)圖5。

Figure 4. Effect of ALDOA on A549 cell migration(×200). A:control；B:ALDOA (5 μg/L)；C:ALDOA (25 μg/L); D:ALDOA (50 μg/L).

圖4ALDOA對(duì)A549細(xì)胞遷移的影響

6ALDOA對(duì)A549細(xì)胞侵襲的影響

ALDOA作用于A549細(xì)胞，24 h后光鏡下計(jì)數(shù)穿過(guò)Transwell聚碳酸酯膜的細(xì)胞數(shù)分別為76.6±13.9、101.1±11.9和127.4±14.6，對(duì)照組為67.3±14.3；與對(duì)照組比較，ALDOA組細(xì)胞侵襲數(shù)增多；而50 μg/L組細(xì)胞侵襲數(shù)明顯多于5 μg/L和25 μg/L組(P<0.05),見(jiàn)圖6。

討 論

異常生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移被視為癌細(xì)胞重要的生物學(xué)特性，幾個(gè)步驟調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生(局部浸潤(rùn)、進(jìn)入血管、外滲、啟動(dòng)、腫瘤微轉(zhuǎn)移灶形成、血管發(fā)生)，其中癌細(xì)胞浸潤(rùn)是最重要和特征性步驟，而癌細(xì)胞浸潤(rùn)過(guò)程中細(xì)胞的遷移和侵襲起著至關(guān)重要作用[11]。闡明細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、遷移和侵襲的分子機(jī)制對(duì)了解肺癌及MPE的發(fā)展非常重要。癌細(xì)胞直接侵襲胸膜組織蔓延并持續(xù)增殖和胸膜通透性增強(qiáng)可能是MPE發(fā)生的最主要機(jī)制。

越來(lái)越多的研究表明腫瘤微環(huán)境對(duì)腫瘤惡性進(jìn)展的臨床意義[6]。MPE含有多種源于炎癥、上皮細(xì)胞和癌細(xì)胞釋放的血漿濾出蛋白，提供癌細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲和脈管播散的微環(huán)境和有關(guān)介質(zhì)。迄今, 一些生物標(biāo)志物如CEA、LDH等已應(yīng)用于胸腔積液的病因分析。這些介質(zhì)也可能特異維持癌細(xì)胞在胸膜腔生存和侵襲，用作研究胸水形成機(jī)制的工具。

癌細(xì)胞增殖和侵襲需有足夠的能量供應(yīng)，代謝重編程有益于癌細(xì)胞生存[12]。癌細(xì)胞糖酵解作用增強(qiáng)，醛縮酶在其中起重要作用，通過(guò)裂解己糖磷酸果糖1,6-二磷酸C3和C4鍵，催化磷酸果糖1,6-二磷酸轉(zhuǎn)換為3-磷酸甘油醛和磷酸二羥丙酮，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞糖代謝和細(xì)胞增殖。惡性腫瘤患者血清中醛縮酶升高，尤以同工酶ALDOA最突出。已證明ALDOA與人類許多疾病如腫瘤包括肺癌[7]、肝癌、自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展有重要關(guān)系。癌組織ALDOA濃度明顯高于癌旁組織，其濃度的高低對(duì)患者化療藥物選擇、治療效果及預(yù)后均有指導(dǎo)意義。肺癌患者血清ALDOA與其自體抗體蛋白水平升高，其上調(diào)的機(jī)制尚不清楚。Lin等[8]發(fā)現(xiàn)ALDOA等糖代謝酶異常還與MPE形成有關(guān),免疫組化和免疫熒光分析MPE和胸膜轉(zhuǎn)移病灶發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞特異性表達(dá)ALDOA。

Figure 5. Effect of ALDOA on A549 cell migration detected by Transwell assay(×200). A:control；B:ALDOA (5 μg/L)；C:ALDOA (25 μg/L); D:ALDOA (50 μg/L).Mean±SD.n=3.*P<0.05vsA.

圖5Transwell小室檢測(cè)ALDOA對(duì)細(xì)胞遷移的影響

本研究中，我們發(fā)現(xiàn)ALDOA在MPE中的濃度明顯高于結(jié)核性胸水，而且以肺腺癌胸水升高最明顯；提示MPE特別是肺腺癌相關(guān)的MPE存在能量供給和利用異常,而且ALDOA還可能與MPE形成有關(guān)。MPE患者胸水中ALDOA水平上調(diào)可能與缺氧誘導(dǎo)因子1α[13]和腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)表達(dá)有關(guān)。這種糖代謝異常不僅對(duì)腫瘤發(fā)生，而且對(duì)MPE中癌細(xì)胞胸膜侵襲、增殖和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子分泌均十分重要[8]。

Figure 6. Effect of ALDOA on A549 cell invasion(×200). A:control；B:ALDOA (5 μg/L)；C:ALDOA (25 μg/L); D:ALDOA (50 μg/L).Mean±SD.n=3.**P<0.01vsA.

圖6ALDOA對(duì)A549細(xì)胞侵襲的影響

CEA是最特異性的癌胚蛋白之一，反映腫瘤的存在，其mRNA水平也被用于檢測(cè)微播散或微轉(zhuǎn)移(灶)。胸水CEA是MPE的一個(gè)有用診斷工具，也有助于鑒別惡性胸膜間皮瘤和轉(zhuǎn)移性肺癌[14]；而且是不能由細(xì)胞檢測(cè)的胸膜亞臨床微轉(zhuǎn)移的一個(gè)有用指標(biāo)[15]。MPE中CEA水平升高可能與癌細(xì)胞阻塞淋巴管及胸膜浸潤(rùn)、CEA產(chǎn)生后不易進(jìn)入血循環(huán)，在胸腔內(nèi)積聚有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)觀察到MPE較結(jié)核性胸水CEA水平升高，并且以肺腺癌MPE中濃度最高；相關(guān)性分析表明胸水CEA與ALDOA高度相關(guān)。MPE中癌細(xì)胞CEA基因表達(dá)激活，可促進(jìn)細(xì)胞黏附、抑制細(xì)胞死亡、介導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及激發(fā)腫瘤免疫，因此CEA在MPE癌細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移和侵襲過(guò)程中可能有重要作用。MPE中CEA與ALDOA的共同上升趨勢(shì)提示兩者在MPE發(fā)生過(guò)程中可能有協(xié)同作用，兩者是否存在共同的生成誘導(dǎo)因子或具有促進(jìn)關(guān)系則不甚清楚。LDH也是一種糖酵解酶，為NAD+的中間產(chǎn)物；人胸膜間皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞具有強(qiáng)陽(yáng)性LDH細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)。癌組織中無(wú)氧酵解增強(qiáng)，促使糖酵解關(guān)鍵酶LDH升高。本研究中，我們觀察到MPE和中LDH與ALDOA也呈正相關(guān)關(guān)系，可能與這兩種糖酵解酶有共同的生成誘導(dǎo)因子有關(guān)。

糖酵解酶除了影響能量生成，還對(duì)細(xì)胞某些功能有調(diào)控作用：腫瘤組織乏氧環(huán)境及糖酵解過(guò)程增強(qiáng)均有利于觸發(fā)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子生成；糖酵解的代謝產(chǎn)物乳酸也刺激血管生成，糖酵解率高的癌細(xì)胞呈優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)。有研究發(fā)現(xiàn)ALDOA在增殖的細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)[13]，提示其與細(xì)胞增殖相關(guān)。在結(jié)腸癌，ALDOA參與細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)，刺激癌細(xì)胞擴(kuò)散[16]。本研究發(fā)現(xiàn)ALDOA濃度依賴性地刺激A549增殖，提示ALDOA可通過(guò)調(diào)節(jié)糖酵解而影響腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)增殖。

除了參與糖酵解途徑與細(xì)胞生存、增殖，ALDOA可通過(guò)某些生長(zhǎng)因子如EGF結(jié)合細(xì)胞骨架，促進(jìn)細(xì)胞遷移、加快損傷修復(fù)[9]。在人角質(zhì)形成細(xì)胞(HaCaT)中，ALDOA沿皺膜和偽足高表達(dá), 與偽足一起定位于肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架。通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)，觀察到轉(zhuǎn)染ALDOA siRNA的HaCaT細(xì)胞機(jī)械劃傷后傷口修復(fù)明顯減慢，偽足形成細(xì)胞也減少；EGF刺激后,傷口修復(fù)區(qū)和ALDOA及其mRNA水平增加[9]。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)觀察ALDOA對(duì)細(xì)胞遷徙的影響，發(fā)現(xiàn)在ALDOA作用下A549細(xì)胞遷徙加快，且這種促進(jìn)作用呈明顯劑量依賴性；進(jìn)一步通過(guò)Transwell小室檢測(cè)ALDOA對(duì)A549細(xì)胞穿透的影響，發(fā)現(xiàn)ALDOA刺激的A549細(xì)胞穿過(guò)Transwell小室的細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組明顯增多，并且也呈濃度依賴性；提示ALDOA增強(qiáng)肺癌細(xì)胞A549遷徙及穿透并呈濃度依賴性。此外，我們發(fā)現(xiàn)ALDOA促進(jìn)A549細(xì)胞與Matrigel膠的黏附，ALDOA刺激的A549細(xì)胞穿過(guò)聚碳酸酯膜的細(xì)胞數(shù)明顯增多，并且ALDOA濃度越高，穿透的細(xì)胞越多；提示ALDOA增強(qiáng)肺癌細(xì)胞A549黏附及侵襲并呈濃度依賴性。

總之，受滲透壓、缺氧、酸堿性等多種理化因素的影響，胸水中ALDOA、CEA和LDH表達(dá)水平增高，尤其在肺腺癌伴胸膜轉(zhuǎn)移的患者中ALDOA增高明顯。ALDOA促進(jìn)A549細(xì)胞增殖、遷移、粘附和侵襲，提示ALDOA在肺癌特別是腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移、MPE形成中起著重要的作用。

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AldolaseAlevelinmalignantpleuraleffusionanditseffectsonproliferation,migrationandinvasionofhumanlungadenocarcinomacells

FENG Xiao-peng, SUN Zhen-gui, WANG Xiang-hai, XING Min, CHEN Xing-wu

(DepartmentofRespiratoryDisease,YijishanHospitalofWannanMedicalCollege,Wuhu241001,China.E-mail:cxw0028@126.com)

AIM: To investigate the levels of aldolase A (ALDOA), carcinoembryonic antigen (CEA) and lactate dehydrogenase (LDH) in malignant pleural effusion (MPE) from patients with lung cancer and tuberculous pleural effusion (TBPE) from patients with tuberculous pleurisy, and to explore the effects of ALDOA on the proliferation, migration and invasion of human lung adenocarcinoma A549 cells.METHODSPleural effusion samples including 65 cases of MPE and 35 cases of TBPE were collected, and the levels of ALDOA, CEA and LDH were detected by ELISA and chemiluminescence assay. After A549 cells were treated with different concentrations of ALDOA, the proliferation, migration and invasion of the cells were investigated by MTT assay, scratch test, Matrigel assay and Transwell invasion assay.RESULTSThe levels of ALDOA, CEA and LDH in MPE were (46.8±21.4) μg/L, (82.2±56.6) μg/L and (755.8±382.5) U/L, respectively, which were significantly higher than those in TBPE [(23.9±17.2) μg/L, (12.6±9.7) μg/L and (388.4±163.9) U/L, respectively;P<0.01]. The concentration of ALDOA in MPE from adenocarcinoma patients [(71.7±32.1) μg/L] was significantly higher than that in MPE from squamous-cell carcinoma patients [(21.3±14.6) μg/L,P<0.05]. The concentrations of ALDOA in MPE and TBPE were positively correlated with the concentrations of CEA and LDH (P<0.01 orP<0.05). ALDOA enhanced the proliferation, migration and invasion of A549 cells in a concentration-dependent manner.CONCLUSIONThe expression level of ALDOA in MPE is significantly higher than that in TBPE, especially in MPE from lung adenocarcinoma patients. There are highly positive correlations between ALDOA and CEA, ALDOA and LDH in pleural effusion. ALDOA concentration-dependently promotes the proliferation, migration and invasion of A549 cells.

Aldolase A; Pleural effusion; Lung neoplasms; Cell proliferation; Cell migration; Neoplasm invasiveness

R363

A

1000- 4718(2013)09- 1662- 06

2013- 04- 28

2013- 07- 09

弋磯山醫(yī)院引進(jìn)人才專項(xiàng)科研基金資助項(xiàng)目(No.YR201012)

△通訊作者 Tel： 0553-5739320； E-mail: cxw0028@126.com

# 現(xiàn)工作單位：廣東省惠州市第一人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.09.022