胰島素樣生長因子I通過改善線粒體功能保護(hù)新生大鼠心肌細(xì)胞免于凋亡*

李晉菊， 丁碧藍(lán)， 許曉玲， 張劍凱， 黃 穎， 李 濤， 吳柱國△

(廣東醫(yī)學(xué)院 1兒科專業(yè)碩士研究生， 2第二臨床學(xué)院， 3廣東省醫(yī)學(xué)分子診斷重點(diǎn)實驗室, 廣東 東莞 523808)

胰島素樣生長因子I通過改善線粒體功能保護(hù)新生大鼠心肌細(xì)胞免于凋亡*

李晉菊1#， 丁碧藍(lán)2， 許曉玲2， 張劍凱3， 黃 穎3， 李 濤3， 吳柱國2△

(廣東醫(yī)學(xué)院1兒科專業(yè)碩士研究生，2第二臨床學(xué)院，3廣東省醫(yī)學(xué)分子診斷重點(diǎn)實驗室, 廣東 東莞 523808)

目的探討線粒體機(jī)制在胰島素樣生長因I(IGF-I)保護(hù)心肌細(xì)胞中的作用。方法體外培養(yǎng)新生大鼠心肌細(xì)胞，過氧化氫處理誘導(dǎo)凋亡，JC-1線粒體膜電位檢測法和透射電鏡觀察心肌細(xì)胞線粒體膜電位和形態(tài)的改變，Annexin V-FITC/PI雙染色法、caspase-3活性測定、DNA-ladder分析和Hoechst 33258染色方法觀察心肌細(xì)胞凋亡的情況。結(jié)果過氧化氫可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，siRNA下調(diào)Kruppel 樣因子9(KLF9)48 h后，心肌細(xì)胞線粒體膜電位下降率明顯降低，由對照組的(24.0±1.6)%，降為IGF-I處理組的(18.3±1.2)%和KLF9下調(diào)組的(15.2±1.2)%；線粒體形態(tài)明顯改善；DNA片段化改善；caspase-3活性降低，與對照組相比IGF-I處理組降低(1.30±0.28)倍，KLF9下調(diào)組降低(1.31±0.43)倍；Annexin V-FITC/PI雙染法顯示細(xì)胞凋亡率對照組為(42.5±1.8)%，IGF-I處理組為(22.4±4.2)%，KLF9下調(diào)組為(32.5±3.5)%；Hoechst 33258染色結(jié)果顯示凋亡小體減少，KLF9下調(diào)組與IGF-I的抗心肌細(xì)胞凋亡效果相似。結(jié)論IGF-I通過下調(diào)KLF9表達(dá)改善線粒體功能，保護(hù)心肌細(xì)胞免于凋亡。

心肌細(xì)胞； 胰島素樣生長因子I； Kruppel 樣因子9； 線粒體； 細(xì)胞凋亡

胰島素樣生長因子I(insulin-like growth factor I, IGF-I)是一類無論在結(jié)構(gòu)和功能上都與胰島素比較相似的生長因子。大量體內(nèi)、外實驗研究表明，IGF-I可以保護(hù)心肌細(xì)胞免于凋亡[1-2]，而且在心肌梗死的患者體內(nèi)IGF-I濃度降低[3]。線粒體在細(xì)胞凋亡的過程中扮演重要角色，線粒體是細(xì)胞內(nèi)還原性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)的主要來源，通過細(xì)胞色素C向胞內(nèi)的釋放、電子傳遞的改變以及膜電勢和通透性的改變參與細(xì)胞凋亡的過程[4]。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，IGF-I可以通下調(diào)Kruppel樣因子9 (Kruppel-like factor 9,KLF9)從而進(jìn)一步下調(diào)細(xì)胞色素C家族的P4501A1 (cytochrome P450 1A1,CYP1A1),保護(hù)心肌細(xì)胞免于凋亡[5]。細(xì)胞色素C從線粒體的釋放正是細(xì)胞凋亡的標(biāo)志之一[6]。作為體內(nèi)從不休息的細(xì)胞，心肌細(xì)胞的線粒體含量最為豐富[7]，那么IGF-1保護(hù)心肌細(xì)胞免于凋亡的同時是否也可以恢復(fù)線粒體功能，這一問題的回答將使我們進(jìn)一步明確IGF-I保護(hù)心肌細(xì)胞免于凋亡的機(jī)制。因此本文觀察了利用KLF9特異性siRNA下調(diào)KLF9基因表達(dá)以后，誘導(dǎo)凋亡狀態(tài)下新生大鼠心肌細(xì)胞線粒體功能的恢復(fù)情況，及其與凋亡的相關(guān)性。

材 料 和 方 法

1動物

初生1～3 d的SD新生大鼠購自廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心。

2試劑與儀器

DMEM培養(yǎng)基購于邁晨公司，Lipofectamine 2000、胎牛血清和0.25%胰酶購于Invitrogen，IGF-I 由Genentech公司惠贈，KLF9 siRNA及control siRNA購自Santa Cruz，caspase-3 和DNA-ladder檢測試劑盒購自Merck, Hoechst 33258和線粒體膜電位檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)公司，Annexin V-FITC/PI雙染色檢測試劑盒購于凱基公司，其它常規(guī)試劑購自Sigma。電泳儀器采用Bio-Rad的Mini-PROTEAN System。圖像采集應(yīng)用Bio-Rad的Molecular Imager VersaDoc MP Systems。透射電鏡觀察由中山大學(xué)電鏡室協(xié)助完成。

3主要方法

3.1細(xì)胞培養(yǎng)、誘導(dǎo)凋亡與轉(zhuǎn)染 將生后1～3 d的SD新生大鼠浸入裝有75%乙醇的燒杯中消毒，將消毒好的乳鼠置于大玻璃培養(yǎng)皿中(120 mm)，在無菌條件下用眼科剪子及鑷子開胸取出心臟，取3個小培養(yǎng)皿，各加預(yù)先溫育的Ca2+free medium 5～10 mL，把心臟放于3個培養(yǎng)皿中漂洗3次至心臟表面無血漬，洗滌液澄清為止，把心臟放入一小玻璃培養(yǎng)皿(75 mm)中剪成小塊，一個心臟剪成5塊，將剪好的心臟轉(zhuǎn)移至預(yù)先裝有9 mL胰酶的小燒杯中，用磁力攪拌器攪拌10 min，,速度為保持轉(zhuǎn)動的最低速(約60 r/min)靜置1 min左右，待自然沉降后吸取上層混懸液丟棄，補(bǔ)充至原來體積的胰酶繼續(xù)消化10 min，靜置1 min左右，待自然沉降后吸取上層混懸液至50 mL離心管Ⅰ,輕吹打幾下使心肌細(xì)胞呈單個分散狀態(tài)后馬上850 r/min、22 ℃離心7 min，棄上清，加5 mL Ca2+DMEM重懸細(xì)胞，吸取轉(zhuǎn)移至50 mL離心管Ⅱ安放一旁，重復(fù)上步驟7～10次直至組織塊完全消化為止，將所有收集到離心管Ⅱ中的細(xì)胞懸液850 r/min、22 ℃離心7 min，棄去上清，加入20 mL DMEM輕吹打，分別裝入2個10 cm培養(yǎng)皿中，放置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)90 min后，收集培養(yǎng)液中的非貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)移到50 mL新離心管，850 r/min、22 ℃ 離心7 min，棄上清，吸取40 mL DMEM培養(yǎng)，24 h后觀察細(xì)胞的貼壁情況， 48 h后換液。以后每2～3 d換1次。

誘導(dǎo)凋亡時，先用無血清DMEM洗細(xì)胞3次，然后換成無血清的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)。同時分別加IGF-I 10 nmol/L和KLF9 siRNA 10 μmol/L。KLF9 siRNA轉(zhuǎn)染方法參見Lipofectamine 2000操作手冊，24 h或32 h后均加H2O2200 μmol/L，48 h后收集細(xì)胞。

3.2DNA片段化分析 每個樣品收集1×106個細(xì)胞，按照 Merck的DNA-ladder檢測試劑盒說明書操作。

3.3Caspase-3活性分析 收集1×106個細(xì)胞，做好標(biāo)記，PBS重懸細(xì)胞，以4 ℃、500×g離心5 min，棄上清。每1×106個細(xì)胞加50 μL Sample Buffer A (49 μL Sample buffer+0.1 μL PMSF+0.9 μL DTT)，渦旋混合。冰上孵育10 min，4 ℃、1 000×g離心10 min。 轉(zhuǎn)移上述溶解液至96孔板上，每孔加50 μL Assay Buffer B (49 μL Assay Buffer+ 0.1 μL PMSF+0.9 μL DTT)，混勻， 每孔加入10 μL caspase-3 底物，蓋上蓋，37 ℃孵育2 h，進(jìn)行酶標(biāo)儀檢測，選擇激發(fā)光波長400 nm，發(fā)射光波長550 nm，記錄熒光值，以正常心肌細(xì)胞組caspase-3熒光值為基準(zhǔn)，求出各組的caspase-3相對活性，并繪制柱狀圖。

3.4Hoechst 33258染色 適量細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板中，用PBS洗3次，加入1 mL固定液，4 ℃固定過夜，去除固定液，用PBS洗2次，每次用搖床晃3 min，吸盡液體。加入1 mL Hoechst 33258染色液，染色5 min，手動晃動數(shù)次，去除染色液，用PBS洗2次，每次用搖床晃3 min，吸緊液體。加1滴抗熒光淬滅劑于6孔板內(nèi)，激發(fā)波長350 nm，發(fā)射波長460 nm，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照。

3.5Annexin V-FITC/PI雙染法 按凱基公司Annexin V-FITC/PI雙染色檢測試劑盒說明書操作。(0.5～1)×105細(xì)胞加入195 μL Annexin V-FITC 結(jié)合液和5 μL Annexin V-FITC，輕輕混勻，室溫避光孵育10 min，1000×g離心5 min，棄上清，加入190 μL Annexin V-FITC 結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞，加入10 μL PI染色液，隨即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測，Annexin V-FITC為綠色熒光，PI為紅色熒光。

3.6線粒體膜電位檢測 按碧云天公司的JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒說明書操作。(1～6)×105細(xì)胞重懸于0.5 mL培養(yǎng)液，加入0.5 mL JC-1染色液，37 ℃孵育20 min，600×g離心3 min，用JC-1染色緩沖液洗滌2次，再用適量JC-1染色緩沖液重懸后，用流式細(xì)胞儀分析。

3.7透射電鏡的檢測 吸出細(xì)胞培養(yǎng)液，用細(xì)胞刮輕輕刮下細(xì)胞至2 mL 離心管中，4 ℃、500×g離心5 min，加入2.5%戊二醛固定液，固定5 min，4 ℃、500×g離心5 min，勿搖晃，保持標(biāo)本在4 ℃(冰盒)中，送電鏡室進(jìn)行環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片， 鋨酸染色，在透射電鏡下觀察線粒體超微結(jié)構(gòu)并拍照。

4統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用多組間比較的單因素方差分析，組間數(shù)據(jù)兩兩比較用Bonferroni檢驗，數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1乳鼠原代心肌細(xì)胞分離與培養(yǎng)

利用差異吸附方法，我們成功地分離了新生大鼠心肌細(xì)胞，通過倒置相差顯微鏡觀察，貼壁的心肌細(xì)胞呈梭形、菱形或多角形，可觀察到輕微搏動，心肌細(xì)胞比例占90%以上，見圖1。

Figure 1. The morphology of neonatal rat primary myocardial cells.A: phase contrast; B: HE staining.

圖1新生大鼠心肌細(xì)胞的形態(tài)

2KLF9特異性siRNA下調(diào)新生大鼠心肌細(xì)胞KLF9基因的表達(dá)

KLF9特異性siRNA轉(zhuǎn)染新生大鼠心肌細(xì)胞后，可以特異性地下調(diào)新生大鼠心肌細(xì)胞KLF9的mRNA及蛋白表達(dá),見圖2。

Figure 2.KLF9-specific siRNA inhibited KLF9 mRNA (A) and protein (B) expression in neonatal rat primary myocardial cells.Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol siRNA.

圖2KLF9特異性siRNA抑制新生大鼠心肌細(xì)胞KLF9mRNA和蛋白的表達(dá)

3KLF9基因表達(dá)下調(diào)可以改善新生大鼠心肌細(xì)胞的凋亡

由圖3A可見，IGF-I刺激或用特異性siRNA阻斷KLF9表達(dá)，均可改善由過氧化氫處理導(dǎo)致細(xì)胞凋亡引起的DNA片段化。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，IGF-I刺激或用特異性siRNA阻斷KLF9表達(dá)，均使心肌細(xì)胞的凋亡率下降，對照組為(42.5±1.8)%，IGF-I處理組為(22.4±4.2)%，KLF9siRNA組為(32.5±3.5)%，差異顯著,見圖3B。Hoechst 33258染色結(jié)果顯示(圖3C)，KLF9 siRNA組和IGF-I組較control siRNA組相比較，凋亡小體較少。Control siRNA組caspase-3活性(圖3D)為正常未處理組細(xì)胞的(1.98±0.39)倍， IGF-I組與KLF9 siRNA組分別為(1.30±0.28)倍及(1.31±0.43)倍，IGF-I組與KLF9 siRNA組caspase-3活性較control siRNA組均有下降，差異顯著(P<0.01)。

Figure 3. Cardiomyocyte apoptosis after down-regulation ofKLF9 expression. A: DNA-ladder;B: Annexin V-FITC/PI C: Hoechst 33258 staining; D: caspase-3 activity.1: normal; 2: 10 nmol/L IGF-I+200 μmol/L H2O2; 3: control siRNA+200 μmol/L H2O2; 4:KLF9 siRNA+200 μmol/L H2O2.Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol siRNA.

圖3下調(diào)KLF9表達(dá)后心肌細(xì)胞凋亡的情況

4KLF9基因表達(dá)下調(diào)可以改善新生大鼠心肌細(xì)胞線粒體膜電勢

Control siRNA組線粒體膜電位下降(24.0±1.63)%，而IGF-I處理組和KLF9 siRNA組線粒體膜電位下降分別為(18.3±1.2)%和(15.2±1.2)%，IGF-I組和KLF9 siRNA組線粒體膜電位較control siRNA組有明顯改善，見圖4。以上結(jié)果說明KLF9基因表達(dá)下調(diào)可以改善由過氧化氫引起的心肌細(xì)胞線粒體損傷。

5KLF9基因表達(dá)下調(diào)可以改善新生大鼠心肌細(xì)胞線粒體形態(tài)

Control siRNA組線粒體腫脹，線粒體膜結(jié)構(gòu)不完整，而IGF-I處理或用特異性siRNA阻斷KLF9表達(dá)，仍有線粒體的腫脹，但與control siRNA組相比，線粒體形態(tài)明顯改善,見圖5。

討 論

IGF-I可以通過調(diào)控心肌細(xì)胞的基因表達(dá)而保護(hù)心肌細(xì)胞免于凋亡[8]，并且可以保護(hù)低溫誘導(dǎo)的心臟損傷[9]。在我們的前期工作中發(fā)現(xiàn)IGF-I可以下調(diào)心肌細(xì)胞KLF9的表達(dá)，由于KLF9是一個轉(zhuǎn)錄因子，因此其表達(dá)發(fā)生改變以后會進(jìn)一步影響受其調(diào)控的基因的表達(dá)。目前研究發(fā)現(xiàn)KLF9主要調(diào)控細(xì)胞色素C家族成員的表達(dá)[10-12]，而細(xì)胞色素C主要存在于線粒體當(dāng)中。線粒體功能不全與心血管疾病的發(fā)生密切相關(guān)[13]，在重癥休克時，線粒體功能不全使平滑肌細(xì)胞中ATP生成減少，它是引起血管收縮反應(yīng)下降和頑固性低血壓的原因之一[14]。在某些因素誘導(dǎo)下，線粒體結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞，膜通透性增加，細(xì)胞色素C外流，這是細(xì)胞凋亡的重要原因[15]。細(xì)胞色素C是催化細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生的主要酶類，下調(diào)其表達(dá)會導(dǎo)致ROS產(chǎn)生減少，從而保護(hù)由ROS引起的細(xì)胞凋亡。在肝細(xì)胞中下調(diào)CYP2E1和1A1表達(dá)，對細(xì)胞凋亡有明顯的保護(hù)作用[16-17]。本研究在前期工作的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)IGF-I可以通過下調(diào)KLF9的基因表達(dá)，部分恢復(fù)過氧化氫誘導(dǎo)下心肌細(xì)胞的線粒體功能，這種恢復(fù)作用是通過下調(diào)細(xì)胞色素C的基因表達(dá)來實現(xiàn)的[5]，而且這種保護(hù)與心肌細(xì)胞的凋亡密切相關(guān)。這一發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了線粒體在心肌細(xì)胞凋亡中的作用，揭示了IGF-I保護(hù)心肌細(xì)胞免于凋亡的新機(jī)制，為心臟病的防治提供新的依據(jù)。

Figure 4. The fall rate of cardiomyocyte mitochondrial membrane potential after down-regulation ofKLF9 expression.Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol siRNA.

圖4下調(diào)KLF9表達(dá)后心肌細(xì)胞線粒體膜電位的變化

Figure 5. The cardiomyocyte mitochondrial morphology after down-regulation ofKLF9 expression.A:normal;B:control siRNA+H2O2; C:IGF-I+H2O2;D:KLF9 siRNA+H2O2.

圖5下調(diào)KLF9表達(dá)后心肌細(xì)胞線粒體形態(tài)的變化

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Insulin-likegrowthfactorIprotectsneonatalratcardiomyocytesfromapoptosisthroughimprovementofmitochondrialfunction

LI Jin-ju1, DING Bi-lan2, XU Xiao-ling2, ZHANG Jian-kai3, HUANG Ying3, LI Tao3, WU Zhu-guo2

(1PediatricGraduateStudent,2theSecondClinicalCollege,3GuangdongProvincialKeyLaboratoryofMedicalMolecularDiagnosis,GuangdongMedicalCollege,Dongguan523808,China.E-mail:wugdmc@126.com)

AIM: To investigate whether mitochondrial mechanism is involved in the anti-apoptotic effect of insulin-like growth factor I (IGF-I) on cardiomyocytes.METHODSPrimary neonatal rat cardiomyocytes (NRCMs) were cultured and treated with 200 μmol/L hydrogen peroxide (H2O2) to induce apoptosis. Kruppel-like factor 9 (KLF9)-specific siRNA was transfected into the cells by Lipofectamine 2000. The mitochondrial function was measured by JC-1 mitochondrial membrane potential (MMP) assay. The mitochondrial morphology was observed by transmission electron microscopy. Myocardial cell apoptosis was detected by Annexin V-FITC/PI dual staining, caspase-3 activity assay, DNA-ladder analysis and Hoechst 33258 staining.RESULTSThe apoptosis of NRCMs was induced by H2O2, with MMP decreased by (24.0±1.6)% compared with control group. The fall rates of MMP in IGF-I group andKLF9 siRNA group were (18.3±1.2)% and (15.2±1.2)%, respectively (bothP<0.01 vs H2O2group), and improved mitochondrial morphology, decreased caspase-3 activity, attenuated DNA fragmentation and reduced apoptotic bodies were also observed in these two groups. The apoptotic rates of NRCMs in IGF-I group andKLF9 siRNA group were (22.4±4.2)% and (32.5±3.5)%, respectively, both lower than that in H2O2group [(42.5±1.8)%,P<0.01]. The anti-apoptotic effect ofKLF9 silencing on NRCMs was consistent with that of IGF-I treatment.CONCLUSIONIGF-I protects NRCMs from apoptosis through down-regulatingKLF9 expression and improving mitochondrial function.

Cardiomyocytes; Insulin-like growth factor I; Kruppel-like factor 9; Mitochondria; Apoptosis

R329.21

A

1000- 4718(2013)09- 1585- 05

2013- 02- 21

2013- 07- 30

廣東省自然科學(xué)基金資助項目(No. 10152402301000009)；東莞市高等院?？萍加媱澲攸c(diǎn)項目(No. 201010815202)

△通訊作者 Tel: 0769-22896978; E-mail: wugdmc@126.com

# 現(xiàn)工作單位： 臨汾市人民醫(yī)院兒科

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.09.008