硫化氫通過調(diào)控NF-κB通路抑制阿霉素引起的心肌細(xì)胞炎癥與細(xì)胞毒性*

徐文明， 郭潤民， 陳景福， 陳 剛， 郭瑞鮮， 馮鑒強(qiáng)， 廖新學(xué)

(1中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院黃埔院區(qū)內(nèi)科，廣東 廣州 510700； 2廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心內(nèi)科，廣東 湛江 524001；3中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，廣東 廣州 510080；中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院 4心血管內(nèi)科， 5高血壓血管病科，廣東 廣州 510080)

硫化氫通過調(diào)控NF-κB通路抑制阿霉素引起的心肌細(xì)胞炎癥與細(xì)胞毒性*

徐文明1， 郭潤民2， 陳景福2， 陳 剛1， 郭瑞鮮3， 馮鑒強(qiáng)3， 廖新學(xué)4，5△

(1中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院黃埔院區(qū)內(nèi)科，廣東 廣州 510700；2廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心內(nèi)科，廣東 湛江 524001；3中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，廣東 廣州 510080；中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院4心血管內(nèi)科，5高血壓血管病科，廣東 廣州 510080)

目的探討硫化氫(H2S)是否通過調(diào)控核因子κB(NF-κB)通路抑制阿霉素(DOX)引起的心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)與細(xì)胞毒性。方法應(yīng)用Western blotting法測(cè)定NF-κB p65表達(dá)；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-6及腫瘤壞死因子α(TNF-α)的分泌水平；細(xì)胞計(jì)數(shù)盒(CCK-8)檢測(cè)細(xì)胞存活率，Hoechst 33258核染色法檢測(cè)凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)及數(shù)量的變化。結(jié)果應(yīng)用5 μmol/L DOX處理H9c2心肌細(xì)胞明顯上調(diào)磷酸化NF-κB p65(p-p65)表達(dá)水平，并引起炎癥反應(yīng)和細(xì)胞毒性，表現(xiàn)為IL-1β、IL-6、TNF-α的分泌水平升高、凋亡細(xì)胞數(shù)量增多及細(xì)胞存活率降低。400 μmol/L NaHS(H2S供體)預(yù)處理30 min能顯著抑制DOX對(duì)心肌細(xì)胞p-p65表達(dá)的上調(diào)作用，并減輕DOX引起的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞損傷，使IL-1β、IL-6、TNF-α的分泌水平下降、凋亡細(xì)胞數(shù)量降低及細(xì)胞存活率升高。與NaHS的作用相似，NF-κB抑制劑吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽(PDTC,100 μmol/L)預(yù)處理也能阻斷DOX引起的心肌炎癥反應(yīng)和細(xì)胞毒性。IL-1受體拮抗劑(IL-1Ra, 20 μg/L)與DOX共處理能拮抗DOX對(duì)心肌細(xì)胞NF-κB p65的激活作用及細(xì)胞毒性作用。結(jié)論在DOX引起的心肌細(xì)胞炎癥中，NF-κB通路與IL-1β之間存在正的相互作用；H2S可通過抑制NF-κB通路保護(hù)心肌細(xì)胞對(duì)抗DOX引起的炎癥反應(yīng)與細(xì)胞毒性。

硫化氫； NF-κB； 阿霉素； 心肌細(xì)胞； 炎癥反應(yīng)

阿霉素(又稱多柔比星，doxorubicin， DOX)是一種臨床上常用的化療藥物，用于治療白血病及一些實(shí)體癌腫，如乳腺癌、卵巢癌和小細(xì)胞肺癌等。然而，由于它能引起嚴(yán)重的劑量依賴性的急性或慢性心肌毒性(cardiotoxicity)[1-2],故限制了其在臨床上的應(yīng)用。DOX引起心肌毒性的機(jī)制是多方面的，其中的一個(gè)病理生理機(jī)制是誘發(fā)心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)。Sauter等[3]報(bào)道，DOX引起一些炎癥細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素 (interleukin, IL)-1β、IL-6和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α， TNF-α)的分泌增多。值得注意的是，TNF-α能激活核因子 κB(nuclear factor-κB, NF-κB)[4]。柔紅霉素(daunorubicin,DOX類似物)能增強(qiáng)TNF-α對(duì)NF-κB的激活作用[5]，提示NF-κB可能也參與DOX引起的炎癥。但是，在DOX引起的心肌細(xì)胞炎癥中，NF-κB通路的作用如何?尚未完全清楚。

NF-κB是一個(gè)二聚體轉(zhuǎn)錄因子，具有調(diào)節(jié)與應(yīng)激反應(yīng)(包括炎癥、氧化應(yīng)激、凋亡等)相關(guān)的基因的作用，并參與心肌的炎癥與壞死過程[6]。最近，我們證實(shí)，第3種內(nèi)源性氣體信號(hào)分子——硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)能通過抑制NF-κB/環(huán)氧化酶2(cyclooxygenase-2, COX-2)通路保護(hù)人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞(HaCat細(xì)胞)對(duì)抗化學(xué)性低氧引起的炎癥[7],并能保護(hù)心肌細(xì)胞對(duì)抗DOX心肌毒性[8]。因此，我們推測(cè)外源性H2S可通過調(diào)控NF-κB通路對(duì)抗DOX引起的心肌細(xì)胞炎癥。為了驗(yàn)證上述推測(cè)，本研究應(yīng)用5 μmol/L DOX處理H9c2心肌細(xì)胞建立DOX心肌毒性實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蚚8]，重點(diǎn)探討：(1)NF-κB在DOX引起的心肌細(xì)胞炎癥中的作用；(2)硫氫化鈉(sodium hydrosulfide,NaHS；H2S供體)能否通過調(diào)控NF-κB通路對(duì)抗DOX引起的心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)。

材 料 和 方 法

1材料

DOX和NaHS購自Sigma-Aldrich，細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8(Cell Counter Kit-8, CCK-8)由Dojindo Lab提供，蛋白預(yù)覽marker(10～170 kD)購自Fermenta，DMEM-F12 培養(yǎng)基以及特級(jí)胎牛血清購自Gibco BRL，抗NF-κB p65、磷酸化NF-κB p65(p-p65)抗體及吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽(pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC;NF-κB 抑制劑) 購自Cell Signaling Technology。IL-1受體拮抗劑(IL-1 receptor antagonist, IL-1Ra)購自ProSpec。IL-1β、IL-6 和TNF-α ELISA試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。

2細(xì)胞培養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)分組

H9c2心肌細(xì)胞來源于大鼠胚胎期心臟組織，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)基，置于5% CO2、37 ℃的溫箱條件下培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分8組：(1)正常對(duì)照組；(2)DOX損傷組：應(yīng)用5 μmol/L DOX處理H9c2心肌細(xì)胞；(3)PDTC預(yù)處理+DOX損傷組：100 μmol/L PDTC作用心肌細(xì)胞30 min，撤去，用PBS洗2次，接著應(yīng)用5 μmol/L DOX 作用24 h;(4)NaHS預(yù)處理+DOX損傷組：400 μmol/L NaHS作用H9c2 心肌細(xì)胞30 min, 撤去，用PBS洗2次，接著應(yīng)用5 μmol/L DOX 作用24 h;(5)IL-1Ra+DOX共處理組：參考Byrne等[9]介紹的方法應(yīng)用20 μg/L IL-1β受體阻斷劑IL-1 Ra與DOX共同處理H9c2心肌細(xì)胞24 h；(6)PDTC組：單獨(dú)應(yīng)用100 μmol/L PDTC作用心肌細(xì)胞30 min；(7)NaHS組：單獨(dú)應(yīng)用400 μmol/L NaHS作用H9c2 心肌細(xì)胞30 min；(8)IL-1Ra組：單獨(dú)應(yīng)用20 μg/L IL-1Ra處理H9c2細(xì)胞24 h。

3細(xì)胞存活率的測(cè)定

H9c2 心肌細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，當(dāng)細(xì)胞生長到培養(yǎng)孔的約80%面積時(shí)， 根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行不同的處理，每個(gè)處理因素設(shè)4個(gè)復(fù)孔。終止培養(yǎng)后，每孔加入10 μL CCK-8，輕搖，37 ℃孵育2 h，用酶標(biāo)儀(λ=450 nm)記錄各孔的吸光度(A)。取4孔A值的平均數(shù)，按下列公式計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率(%)=處理組A/對(duì)照組A×100%，重復(fù)3次。

4Hoechst33258核染色法觀察凋亡細(xì)胞形態(tài)和數(shù)量改變

H9c2 心肌細(xì)胞按分組要求(1)正常對(duì)照組；(2)DOX損傷組；(3)NaHS預(yù)處理+DOX損傷組;(4)NaHS組)進(jìn)行相應(yīng)的處理后，小心棄去培養(yǎng)基，用PBS 洗1遍，4% 多聚甲醛固定10 min，PBS 漂洗后，加入5 mg /L Hoechst 33258 試劑，室溫輕搖30 min。在熒光顯微鏡(BX50-FLA, Olympus) 下攝片，染色質(zhì)均勻分布，核被染成均勻藍(lán)色的細(xì)胞定為正常細(xì)胞，核呈濃縮、碎裂的明亮藍(lán)色細(xì)胞定為凋亡細(xì)胞，隨機(jī)選取視野在熒光顯微鏡下攝片。

5ELISA法測(cè)定IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌水平

采用雙抗體夾心ABC-ELISA 法檢測(cè)培養(yǎng)基中IL-1β、IL-6和TNF-α的水平。H9c2細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，當(dāng)80%融合時(shí)，分別給予不同的條件處理培養(yǎng)基，每組3個(gè)復(fù)孔。處理完成后，取100 μL培養(yǎng)基加入預(yù)先用IL-1β、IL-6 和TNF-α抗體包被的酶標(biāo)板中，37 ℃孵育90 min，然后吸出培養(yǎng)基，加入IL-1β、IL-6和TNF-α抗體繼續(xù)孵育60 min，經(jīng)TBS漂洗3次，加入生物素標(biāo)記的Ⅱ抗，反應(yīng)30 min，采用TMB 法顯色，經(jīng)終止液終止反應(yīng)后，用酶標(biāo)儀(Multiscan MK3，Thermo Labsystems)記錄450 nm 波長處的吸光度。取3 孔標(biāo)準(zhǔn)化處理后的A值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

6Westernblotting法檢測(cè)NF-κB的表達(dá)水平

H9c2心肌細(xì)胞接種于60 mm培養(yǎng)皿中，各實(shí)驗(yàn)組給予不同的處理因素后，用預(yù)冷的PBS洗2次，加入細(xì)胞裂解液，4 ℃靜置30 min，12 000 r/min離心10 min，取上清，采用BCA法進(jìn)行蛋白定量?？偟鞍捉?jīng)SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉1.5 h，隨后加入抗p65和p-p65抗體(1∶1 000)，4 ℃過夜，用TBST洗3次，10 min/次。將PVDF膜用發(fā)光試劑ECL顯色，暗室曝光到X線片上，凝膠成像系統(tǒng)掃描分析結(jié)果。

7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示，組間比較用單因素方差分析(One-way ANOVA)，兩兩比較按LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行，檢驗(yàn)水準(zhǔn)P<0.05。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1硫化氫抑制DOX對(duì)心肌細(xì)胞磷酸化NF-κBp65表達(dá)的上調(diào)作用

應(yīng)用5 μmol/L DOX處理H9c2細(xì)胞90 min能明顯增加p-p65的表達(dá)水平，與正常對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。但是，在DOX處理心肌細(xì)胞前，應(yīng)用400 μmol/L NaHS預(yù)處理30 min能顯著抑制DOX對(duì)p-p65表達(dá)的上調(diào)作用(P<0.01)。單獨(dú)應(yīng)用400 μmol/L NaHS處理心肌細(xì)胞30 min對(duì)p-p65的表達(dá)無明顯的影響，見圖1。

Figure 1. Hydrogen sulfide inhibited doxorubicin (DOX)-induced up-regulation of phosphorylated NF-κB p65 (p-p65) expression in H9c2 cells. Mean±SEM.n=5.**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsDOX.

圖1硫化氫抑制DOX對(duì)心肌細(xì)胞磷酸化NF-κBp65表達(dá)的上調(diào)作用

2硫化氫和NF-κB抑制劑抑制DOX對(duì)心肌細(xì)胞IL-1β分泌的促進(jìn)作用

圖2顯示，應(yīng)用5 μmol/L DOX處理H9c2細(xì)胞24 h可明顯增加IL-1β的分泌水平，與正常對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。400 μmol/L NaHS預(yù)處理30 min能顯著阻斷DOX對(duì)心肌細(xì)胞IL-1β分泌的促進(jìn)作用(P<0.01)。與NaHS的作用相似，在DOX處理心肌細(xì)胞前，應(yīng)用100 μmol/L PDTC預(yù)處理30 min也能抑制DOX對(duì)IL-1β分泌的促進(jìn)作用(P<0.01)。單獨(dú)NaHS 或PDTC預(yù)處理本身不影響IL-1β的基礎(chǔ)分泌水平。上述結(jié)果提示H2S可通過抑制NF-κB通路繼而阻斷DOX對(duì)心肌細(xì)胞IL-1β分泌的促進(jìn)作用。

3硫化氫和NF-κB抑制劑抑制DOX對(duì)心肌細(xì)胞IL-6分泌的促進(jìn)作用

圖3顯示，應(yīng)用5 μmol/L DOX處理H9c2細(xì)胞24 h可引起IL-1β的分泌明顯增多，與正常對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。在DOX處理心肌細(xì)胞前，分別應(yīng)用400 μmol/L NaHS或100 μmol/L PDTC預(yù)處理30 min均能減弱DOX對(duì)心肌細(xì)胞IL-6分泌的促進(jìn)作用(P<0.01)。單獨(dú)NaHS 或PDTC預(yù)處理本身對(duì)心肌細(xì)胞IL-6的基礎(chǔ)分泌無明顯影響。上述結(jié)果提示，H2S可通過抑制NF-κB通路繼而抑制DOX對(duì)心肌細(xì)胞IL-6分泌的促進(jìn)作用。

Figure 2. Hydrogen sulfide and NF-κB inhibitor PDTC attenuated doxorubicin(DOX)-induced over-secretion of IL-1β in H9c2 cells. Mean±SEM.n=5.**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsDOX.

圖2硫化氫和NF-κB抑制劑抑制DOX對(duì)心肌細(xì)胞IL-1β分泌的促進(jìn)作用

Figure 3. Hydrogen sulfide and NF-κB inhibitor PDTC blocked doxorubicin(DOX)-induced increase in IL-6 secretion in H9c2 cells. Mean±SEM.n=5.**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsDOX.

圖3硫化氫和NF-κB抑制劑抑制DOX對(duì)心肌細(xì)胞IL-6分泌的促進(jìn)作用

4硫化氫和NF-κB抑制劑阻斷DOX對(duì)心肌細(xì)胞TNF-α分泌的促進(jìn)作用

圖4顯示，應(yīng)用5 μmol/L DOX處理H9c2細(xì)胞24 h，可明顯地增加TNF-α的分泌水平，與正常對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。在DOX處理心肌細(xì)胞前，分別應(yīng)用400 μmol/L NaHS或100 μmol/L PDTC預(yù)處理30 min可顯著阻斷DOX對(duì)心肌細(xì)胞TNF-α分泌的促進(jìn)作用(P<0.01)。單獨(dú)NaHS 或PDTC預(yù)處理本身對(duì)心肌細(xì)胞TNF-α的基礎(chǔ)分泌無明顯的影響。

5硫化氫抑制DOX引起的心肌細(xì)胞凋亡

Hoechst 33258 核染色檢測(cè)結(jié)果顯示，正常H9c2心肌細(xì)胞染色質(zhì)分布均勻，為彌散均勻的低密度熒光(圖5A)。但是，經(jīng)5 μmol/L DOX處理24 h后，未經(jīng)硫化氫預(yù)處理的H9c2心肌細(xì)胞呈現(xiàn)典型的凋亡特征，即細(xì)胞核呈現(xiàn)濃縮致密的固縮形態(tài)或顆粒熒光(圖5B)。400 μmol/L NaHS預(yù)處理本身對(duì)H9c2心肌細(xì)胞的凋亡無明顯的影響(圖5D)，但是，NaHS預(yù)處理能明顯地對(duì)抗5 μmol/L DOX對(duì)心肌細(xì)胞的致凋亡作用，使呈現(xiàn)濃縮致密的固縮形態(tài)或顆粒狀熒光的凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯減少(圖5C)。

Figure 4. Hydrogen sulfide and NF-κB inhibitor PDTC reduced doxorubicin(DOX)-induced up-regulation of TNF-α secretion in H9c2 cells. Mean±SEM.n=5.**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsDOX.

圖4硫化氫和NF-κB抑制劑抑制DOX對(duì)心肌細(xì)胞TNF-α分泌的上調(diào)作用

6IL-1β受體拮抗劑抑制DOX對(duì)心肌細(xì)胞p-p65表達(dá)的上調(diào)作用

圖6顯示，IL-1Ra與DOX共處理可明顯地減弱DOX對(duì)p-p65表達(dá)的上調(diào)作用。單獨(dú)IL-1Ra處理H9c2心肌細(xì)胞90 min對(duì)p-p65的基礎(chǔ)表達(dá)無明顯的作用。結(jié)合圖2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提示在DOX誘發(fā)心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)中，NF-κB與IL-1β之間存在正的相互作用。

7NF-κB和IL-1β介導(dǎo)DOX引起的心肌細(xì)胞毒性

圖7顯示，應(yīng)用5 μmol/L DOX處理H9c2心肌細(xì)胞24 h可引起細(xì)胞毒性，使細(xì)胞存活率明顯地降低，與正常對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。在DOX處理心肌細(xì)胞前，應(yīng)用100 μmol/L PDTC預(yù)處理30 min可抑制DOX引起的細(xì)胞毒性，使細(xì)胞存活率明顯升高(P<0.01)。另一方面，應(yīng)用 20 μg/L IL-1Ra與DOX共同處理H9c2細(xì)胞24 h也能拮抗DOX引起的細(xì)胞毒性(P<0.01)。單獨(dú)應(yīng)用PDTC或IL-1Ra處理心肌細(xì)胞對(duì)細(xì)胞存活率無明顯影響。上述結(jié)果提示NF-κB和IL-1β參與DOX引起的心肌細(xì)胞毒性。

Figure 5. Inhibitory effect of hydrogen sulfide on doxorubicin(DOX)-induced apoptosis of H9c2 cells (Hoechst staining,×400).A:control group;B:DOX group; C:DOX+NaHs group;D:NaHS group. Mean±SEM.n=5.**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsDOX.

圖5硫化氫抑制DOX對(duì)心肌細(xì)胞的致凋亡作用

Figure 6. Antagonist of IL-1β receptor (IL-1Ra) depressed doxorubicin(DOX)-induced up-regulation of phosphorulated NF-κB p65 (p-p65) expression level in H9c2 cells. Mean±SEM.n=5.**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsDOX.

圖6IL-1β受體拮抗劑抑制DOX對(duì)心肌細(xì)胞p-p65表達(dá)的上調(diào)作用

Figure 7. Both NF-κB and IL-1β mediated doxorubicin(DOX)-induced cytotoxicity in H9c2 cells. Mean±SEM.n=5.**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsDOX.

圖7NF-κB和IL-1β介導(dǎo)DOX引起的心肌細(xì)胞毒性

討 論

近年，炎癥在DOX心肌毒性中的作用日益受到重視。本研究在DOX處理H9c2細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭杏^察到，DOX能引起心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)為前炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌明顯增多，這與一些報(bào)道的結(jié)果一致[3，10]。有報(bào)道指出，DOX可能是激活癌細(xì)胞NF-κB通路的誘導(dǎo)者[11]，因此，本研究觀察DOX對(duì)心肌細(xì)胞p-NF-κB p65表達(dá)的影響。NF-κB被認(rèn)為是控制炎癥反應(yīng)的核心因子。NF-κB家族主要由5個(gè)亞單位：即NF-κB1(p50)、NF-κB2(p52)、p65(RelA)、RelB和c-Rel構(gòu)成[12]。其中p65是NF-κB發(fā)揮功能的必需亞單位。與前文[11]的結(jié)果相似，本研究觀察到，DOX能明顯地上調(diào)H9c2細(xì)胞p-NF-κB p65的表達(dá)水平，提示DOX能激活NF-κB通路。進(jìn)一步的研究還發(fā)現(xiàn)，NF-κB抑制劑PDTC能抑制DOX對(duì)心肌細(xì)胞IL-1β、IL-6和TNF-α分泌的上調(diào)作用，提示激活NF-κB通路可能是DOX引起心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)的機(jī)制之一。

IL-1β被認(rèn)為是一種在免疫和炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)中起重要作用的細(xì)胞因子,參與DOX對(duì)IL-6分泌的促進(jìn)作用[3]。為了探討在DOX誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞炎癥中，IL-1β與NF-κB之間是否存在相互作用，本研究觀察了IL-1β受體拮抗劑IL-1Ra對(duì)DOX引起NF-κB激活作用的影響。結(jié)果表明，IL-1Ra能拮抗DOX對(duì)p-p65表達(dá)的上調(diào)作用，結(jié)合上述的結(jié)果(PDTC抑制DOX對(duì)IL-1β分泌的促進(jìn)作用)，提示IL-1β與NF-κB之間可能存在正的相互作用。有報(bào)道指出，IL-1可持續(xù)地激活蛋白激酶，繼而導(dǎo)致NF-κB核轉(zhuǎn)移，引起細(xì)胞死亡[13]。Ing等[14]也報(bào)道，IL-1可通過促進(jìn)一氧化氮的生成而引起心肌細(xì)胞死亡。因此，這種相互作用可加重DOX引起的心肌炎癥反應(yīng)與損傷，可能是DOX誘發(fā)心肌細(xì)胞炎癥的一個(gè)新機(jī)制，今后需進(jìn)一步深入研究。

H2S是繼一氧化碳和一氧化氮之后被發(fā)現(xiàn)的第3種內(nèi)源性氣體信號(hào)分子。近年，越來越多的研究證實(shí)，H2S具有心肌保護(hù)作用[8,13-16]。值得注意的是，DOX能抑制心肌細(xì)胞內(nèi)源性H2S的生成[8]，外源性H2S能保護(hù)心肌細(xì)胞，對(duì)抗DOX引起的心肌毒性[8,15]。本研究進(jìn)一步證實(shí)，NaHS在抑制DOX細(xì)胞毒性及細(xì)胞凋亡的同時(shí)，能阻斷DOX對(duì)IL-1β、IL-6和TNF-α分泌的上調(diào)作用，提示H2S能抑制DOX引起的心肌炎癥反應(yīng)，并發(fā)現(xiàn)外源性H2S也能抑制DOX對(duì)NF-κB通路的激活作用，提示通過抑制NF-κB通路可能是H2S抑制DOX誘導(dǎo)的心肌炎癥的作用機(jī)制之一。最近，我們證實(shí)，H2S可通過其抗氧化作用抑制NF-κB通路，繼而抑制化學(xué)性缺氧引起的HaCat細(xì)胞炎癥[7]。因此，H2S是否通過抗氧化機(jī)制抑制NF-κB通路繼而抑制DOX引起的心肌細(xì)胞炎癥，尚需進(jìn)一步探討。

[1] Scully RE, Lipshultz SE. Anthracycline cardiotoxicity in long-term survivors of childhood cancer[J]. Cardiovasc Toxicol, 2007, 7(2):122-128.

[2] Hrdina R, Gersl V, KlimtovI, et al. Anthracycline-induced cardiotoxicity[J].Acta Medica (Hradec Kralove) , 2000, 43(3):75-82.

[3] Sauter KA, Wood LJ, Wong J, et al. Doxorubicin and daunorubicin induce processing and release of interleukin-1beta through activation of the NLRP3 inflammasome[J]. Cancer Biol Ther, 2011,11(12):1008-1016.

[4] Riganti C, Doublier S, Costamagna C, et al. Activation of nuclear factor-κB pathway by simvastatin and RhoA silencing increases doxorubicin cytotoxicity in human colon cancer HT29 cells[J]. Mol Pharmacol, 2008, 74(2):476-484.

[5] Boland MP, Foster SJ, O’Neill LA. Daunorubicin activates NFκB and induces κB-dependent gene expression in HL-60 promyelocytic and Jurkat T lymphoma cells[J]. J Biol Chem, 1997,272(20):12952-12960.

[6] Shi Y, Moon M, Dawood S, et al. Mechanisms and management of doxorubicin cardiotoxicity[J].Herz, 2011,36(4):296-305.

[7] Yang C, Yang Z, Zhang M, et al.Hydrogen sulfide protects against chemical hypoxia-induced cytotoxicity and inflammation in HaCaT cells through inhibition of ROS/NF-κB/COX-2 pathway[J]. PLoS One, 2011,6(7):e21971.

[8] Wang XY, Yang CT, Zheng DD, et al. Hydrogen sulfide protects H9c2 cells against doxorubicin-induced cardiotoxicity through inhibition of endoplasmic reticulum stress[J]. Mol Cell Biochem, 2012,363(1-2):419-426.

[9] Byrne LS, Peng J, Sarkar S, et al. Interleukin-1 beta-induced up-regulation of opioid receptors in the untreated and morphine-desensitized U87 MG human astrocytoma cells[J]. J Neuroinflammation, 2012,9: 252.

[10] Riad A, Bien S, Westermann D, et al. Pretreatment with statin attenuates the cardiotoxicity of Doxorubicin in mice[J]. Cancer Res, 2009,69(2):695-699.

[11] Yu HG, Ai YW, Yu LL, et al. Phosphoinositide 3-kinase/Akt pathway plays an important role in chemoresistance of gastric cancer cells against etoposide and doxorubicin induced cell death[J]. Int J Cancer, 2008,122(2):433-443.

[12] Abd-El-Aleem SA, Ferguson MW, Appleton I, et al.Expression of cyclooxygenase isoforms in normal human skin and chronic venous ulcers[J]. J Pathol, 2001,195(5):616-623.

[13] Schreck R, Rieber P, Baeuerle PA. Reactive oxygen intermediates as apparently widely used messengers in the activation of the NF-kappa B transcription factor and HIV-1[J]. EMBO J,1991,10(8): 2247-2258.

[14] Ing DJ, Zang J, Dzau VJ, et al. Modulation of cytokine-induced cardiac myocyte apoptosis by nitric oxide, Bak, and Bcl-x[J]. Circ Res,1999,84(1): 21-33.

[15] 李建平, 楊春濤, 楊戰(zhàn)利, 等.CFTR氯通道在硫化氫誘導(dǎo)的心肌保護(hù)及細(xì)胞增殖中的作用[J].中國病理生理雜志, 2009, 25(6): 1070-1075.

[16] 蘇鈺雯, 杜軍保, 韓 薇, 等.硫化氫供體對(duì)阿霉素心肌病大鼠氧化應(yīng)激作用的影響[J]. 中國病理生理雜志, 2008, 24(8): 1469-1474.

Hydrogensulfideinhibitsdoxorubicin-inducedinflammationandcytotoxicityinratcardiomyocytesbymodulatingactivationofNF-κBpathway

XU Wen-ming1, GUO Run-ming2, CHEN Jing-fu2, CHEN Gang1, GUO Rui-xian3, FENG Jian-qiang3, LIAO Xin-xue4,5

(1DepartmentofInternalMedicine,RegionofHuangpu,theFirstAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510700,China;2DepartmentofCardiology,AffiliatedHospital,GuangdongMedicalCollege,Zhanjiang524001,China;3DepartmentofPhysiology,ZhongshanSchoolofMedicine,SunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China;4DepartmentofCardiovasology,5DepartmentofHypertension&VascularDiseases,theFirstAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China.E-mail:liaoxinx@mail.sysu.edu.cn)

AIM: To investigate whether hydrogen sulfide (H2S) attenuates doxorubicin (DOX)-induced inflammation and cytotoxicity in rat cardiomyocytes (H9c2 cells) by modulating nuclear factor κB (NF-κB) pathway.METHODSThe expression of NF-κB p65 was measured by western blotting. The secretion levels of interleukin (IL)-1β, IL-6 and tumor necrosis factor α (TNF-α) were tested by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Cell viability was detected by Cell Counting Kit-8 (CCK-8) assay. Hoechst 33258 nuclear staining was used to detect the morphological changes and number of apoptotic cells.RESULTSTreatment of H9c2 cells with 5 μmol/L DOX significantly up-regulated the expression level of phosphorylated NF-κB p65 (p-p65), and induced inflammation and cytotoxicity, as evidenced by increases in secretion levels of IL-1β, IL-6 and TNF-α and number of apoptotic cells as well as a decrease in cell viability. Pretreatment of H9c2 cells with 400 μmol/L NaHS (a donor of H2S) for 30 min markedly depressed the up-regulation of p-p65 expression induced by DOX. In addition, NaHS pretreatment also reduced DOX-induced inflammatory response and injury, leading to decreases in IL-1β, IL-6 and TNF-α secretion and number of apoptotic cells as well as an increase in cell viability. Similar to the effect of NaHS, pretreatment with 100 μmol/L pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC), an inhibitor of NF-κB, also blocked DOX-induced cardiac inflammation and cytotoxicity. Co-administration of IL-1 receptor antagonist (IL-1Ra) and DOX reduced DOX-induced activation of NF-κB and cytotoxicity in H9c2 cells.CONCLUSIONDuring the DOX-induced cardiomyocyte inflammation, there is positive interaction between NF-κB pathway and IL-1β. H2S may protect cardiomyocytes against DOX-induced inflammatory response and cytotoxicity by inhibiting NF-κB pathway.

Hydrogen sulfide; NF-kappa B; Doxorubicin; Cardiomyocytes; Inflammatory response

R363

A

1000- 4718(2013)09- 1561- 06

2013- 06- 24

2013- 08- 28

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81270296)；廣東省科技計(jì)劃(No.2012B031800358)

△通訊作者 Tel: 020-87332628; E-mail: liaoxinx@mail.sysu.edu.cn

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.09.004