頂空氣相色譜法測定水飛薊素中殘留溶劑的研究

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所 北京協(xié)和藥廠（100050）劉冬 何秀峰 王愛國

中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院（110001）田昕Δ

水飛薊素為菊科藥用植物水飛薊（Silybum marianumGaretn.）的干燥果實(shí)經(jīng)有機(jī)溶媒提取、精制而成的植物提取物，呈黃色粉末或結(jié)晶狀粉末，味苦；易溶于丙酮、乙酸乙酯、乙醇、難溶于氯仿，不溶于水。主要成分有水飛薊賓、異水飛薊賓、水飛薊寧和水飛薊亭等黃酮類物質(zhì)，被稱為“天然的保肝藥”。水飛薊素具有保護(hù)肝臟細(xì)胞免受毒性物質(zhì)侵害、抗氧化、抗輻射等功效，是治療肝病應(yīng)用最為廣泛的中藥提取物之一。目前，水飛薊素的劑型大部分為口服制劑，如水飛薊素片、益肝靈片及軟膠囊、水飛薊賓卵磷脂復(fù)合物硬膠囊等，日服用劑量在300mg以上。

水飛薊素的國家藥品標(biāo)準(zhǔn)WS-10001-（HD-0600）-2002中未規(guī)定其殘留溶劑的檢測，根據(jù)其溶解特性，不同廠家的提取工藝、涉及的有機(jī)溶劑存在一定差別，主要有丙酮、乙醇以及乙酸乙酯。《中國藥典》2010年版[1]及ICH（人用藥品注冊技術(shù)要求國際協(xié)調(diào)會(huì)）均規(guī)定了其溶劑殘留的限度為：乙醇、丙酮以及乙酸乙酯均不得過0.5%。筆者對于不同提取工藝中可能用到的溶劑乙醇、丙酮以及乙酸乙酯進(jìn)行了控制，建立了水飛薊素的殘留溶劑測定法，經(jīng)驗(yàn)證該測定方法符合《中國藥典》2010年版中“有機(jī)溶劑殘留”測定的有關(guān)規(guī)定，各組份的分離度均符合要求；經(jīng)過采用3個(gè)不同廠家共計(jì)9批次產(chǎn)品的檢測，表明該方法操作簡便，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

1 儀器與試劑

Agilent6890N氣相色譜儀，Agilent7689E頂空進(jìn)樣裝置，配有Agilent操作控制及積分軟件；Mettler Toledo AG285分析天平。

甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、二甲基亞砜均為色譜純；樣品為水飛薊素（購自A、B、C三個(gè)不同中藥提取公司，共9批次）。

2 色譜條件與系統(tǒng)適用性研究

色譜柱為HP-5彈性石英毛細(xì)管柱（30m×0.53mm，i.d，5.0μm），進(jìn)樣口溫度為180℃，采用氫火焰離子化檢測器（FID），檢測器溫度為250℃。柱溫采用程序升溫，初始溫度40℃，保持6min，以15℃/min升至180℃，保持3min，載氣為氮?dú)猓魉贋?.7mL/min，分流比為1∶10。頂空預(yù)熱溫度為85℃，預(yù)熱時(shí)間為20min，傳輸管溫度為95℃，進(jìn)樣口溫度為105℃[2]。

附表 9批水飛薊素的殘留溶劑含量測定結(jié)果（n＝2）

3 內(nèi)標(biāo)溶液及對照溶液的制備

取甲醇適量，精密稱定，加二甲基亞砜溶解并定量稀釋成每1.0mL約含甲醇3mg的溶液，作為內(nèi)標(biāo)溶液。取色譜純乙醇、丙酮、乙酸乙酯適量，分別精密稱定，加內(nèi)標(biāo)溶液溶解并定量稀釋成每1mL中約含乙醇、丙酮、乙酸乙酯均為2.5mg的溶液作為對照溶液。

4 供試品溶液的配制

稱取供試品0.5g，精密稱定，置頂空瓶中，加入內(nèi)標(biāo)溶液1.0mL使其溶解，密封，預(yù)熱后取頂空瓶上部氣體進(jìn)樣。

5 空白試驗(yàn)

取1.0mL內(nèi)標(biāo)溶液置于頂空瓶中，采用上述色譜條件進(jìn)樣測定，色譜圖中除內(nèi)標(biāo)物質(zhì)甲醇、溶劑二甲基亞砜兩個(gè)主要色譜峰外無其他明顯色譜峰出現(xiàn)，且在乙醇、丙酮、乙酸乙酯出峰處無干擾。

6 線性關(guān)系的考察

精密稱取乙醇、丙酮以及乙酸乙酯各約200.0mg至1 0 m L容量瓶中，以內(nèi)標(biāo)溶液稀釋至刻度搖勻，作為標(biāo)準(zhǔn)溶液1，精密量取5 m L 標(biāo)準(zhǔn)溶液1 置于另一1 0 m L 容量瓶中并加內(nèi)標(biāo)溶液稀釋至刻度，搖勻，作為標(biāo)準(zhǔn)溶液2，依此類推，分別稀釋配制成含乙醇濃度為5.0、2.5、1.25、0.625、0.25、0.025μg/mL系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液6瓶，各精密量取1.0mL置6個(gè)頂空瓶中，照上述方法進(jìn)行測定，記錄色譜圖，通過積分確定峰面積，以濃度為橫坐標(biāo)，以乙醇、丙酮、乙酸乙酯與甲醇峰面積的比值為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。得到：殘留溶劑乙醇、丙酮、乙酸乙酯的濃度在0.025～20.0μg/mL范圍內(nèi)，線性較好，回歸方程如下：

乙醇：Y＝-0.03053+0.4137C，r＝0.9999

丙酮：Y＝-0.03421+1.9743C，r＝0.9999

乙酸乙酯：Y＝0.032406+1.5092C，r＝0.9999

7 最小檢測限

本方法各溶液中乙醇、丙酮、乙酸乙酯的最小檢測限（S/N＞3）分別為3.0、3.0、1.0μg/mL。

8 精密度試驗(yàn)

分取對照溶液各1.0mL于6個(gè)頂空瓶中，依次進(jìn)樣。記錄峰面積值，計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，乙醇、丙酮、乙酸乙酯分別為0.13%、0.79%、0.60%，精密度良好。

9 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

稱取同一批號(hào)的水飛薊素樣品約0.5g于頂空瓶中，共稱6份，精密加入配好的對照溶液各1.0mL，各份樣品按上述方法進(jìn)行測定，計(jì)算平均回收率（n＝6），乙醇、丙酮、乙酸乙酯分別為98.30%（RSD＝0.82%）、97.62%（RSD＝1.1%）、96.89%（RSD＝1.4%），表明方法的準(zhǔn)確度較好。

10 樣品的測定

稱取水飛薊素樣品3個(gè)廠家共計(jì)9批次產(chǎn)品，按供試品溶液制備方法制備供試品溶液，采用上述色譜條件測定樣品中有機(jī)溶劑殘留量，結(jié)果見附表。

11 討論

11.1 溶劑的選擇 水飛薊素為菊科植物水飛薊的干燥果實(shí)經(jīng)有機(jī)溶媒提取、精制得到，以水飛薊賓、異水飛薊賓等成分為主的黃酮類物質(zhì)，其易溶于丙酮、乙酸乙酯、乙醇，難溶于氯仿，不溶于水?？紤]到這一點(diǎn)，筆者在方法選擇過程中，以二甲基亞砜為溶媒，以甲醇為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，采取頂空進(jìn)樣法，預(yù)熱使樣品完全溶解后進(jìn)行測定，得到了比較滿意的效果。

11.2 測定結(jié)果的討論 經(jīng)測定3個(gè)水飛薊素生產(chǎn)廠家的9批次樣品測定結(jié)果可以看出，其提取工藝、所使用的提取溶劑存在一定差別，且B廠家的產(chǎn)品丙酮含量超過規(guī)定限度（0.5%）。水飛薊素日服用劑量較高，為更好的保障制劑產(chǎn)品安全、有效，建議在現(xiàn)有國家標(biāo)準(zhǔn)中增加殘留溶劑的檢測，以保障生產(chǎn)藥品的安全性。

綜上所述，本文所建立的氣相色譜條件可同時(shí)測定水飛薊素中的乙醇、丙酮、乙酸乙酯的含量，方法簡單可靠，可以保障生產(chǎn)藥品的安全性。