微小RNA 30c增加有氧運動訓(xùn)練小鼠心室順應(yīng)>性的研究

賈明學(xué)，張國海，李 艷，董國忠，桑國強，楊宏興

心臟是人體循環(huán)系統(tǒng)中的重要器官，主要功能是提供動力將血液運行至身體各器官和組織。心臟功能的有效運轉(zhuǎn)是人體運動的基礎(chǔ)，也是運動員完成高強度運動、獲得優(yōu)異成績的關(guān)鍵。改善和提高訓(xùn)練過程中運動員的心臟功能是運動醫(yī)學(xué)專家關(guān)注的焦點。最近十年來，運動基因組學(xué)發(fā)現(xiàn)，運動能力及運動的健康效應(yīng)與個體遺傳基因存在著密切關(guān)系。但是，個體遺傳基因的差異僅僅可以解釋個體耐力訓(xùn)練、最大耗氧量、力量以及其它關(guān)鍵性狀50%的差異［4］。近年，隨著表觀遺傳學(xué)的不斷發(fā)展及其對運動醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的交叉滲透，國內(nèi)外學(xué)者開始嘗試從控制基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的表觀遺傳方面，如微小RNA、DNA甲基化和乙?；瑏硌芯窟\動導(dǎo)致心臟血流動力負(fù)荷增加所引起的心臟結(jié)構(gòu)和功能的改變，從而幫助運動員更好的適應(yīng)訓(xùn)練方式，改善和提高心臟功能［9］。

微小RNAs（microRNAs，miRNAs）是一類大約22個核苷酸組成的的單鏈非編碼RNAs，其通過與基因3’非編碼區(qū)域結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮著基因調(diào)節(jié)的作用［1］。miRNAs參與了細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞分化、發(fā)育、代謝和凋亡等一系列生理和病理進(jìn)程［2］，近年來，對于miRNAs已經(jīng)成為熱點研究。有研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs在心臟的生長和發(fā)育過程中存在著差異表達(dá)的情況，其通過對靶基因的調(diào)控影響心臟的重塑過程。miRNAs特異表達(dá)譜能夠?qū)U(kuò)張性心肌病、肥厚性心肌病、急性心肌梗塞等心臟疾病起到早期精確指示作用［7，13］。研究證實，心肌成纖維細(xì)胞產(chǎn)生大量膠原蛋白、結(jié)締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）會導(dǎo)致心臟病理性肥大，心室順應(yīng)性降低，影響心臟功能的發(fā)揮［16］。miRNA-1，133a和133b則可以抑制轉(zhuǎn)錄生長因子-β的表達(dá)，降低心肌成纖維細(xì)胞膠原蛋白的產(chǎn)生，從而對心臟結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生保護(hù)作用［18］。Soci和他的同事則發(fā)現(xiàn)，miRNA29c可以降低心肌組織中膠原蛋白基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，從而提高心室順應(yīng)性［17］。Duisters則發(fā)現(xiàn)，在心肌疾病中miRNA-30c和miR-133顯著下調(diào)，而CTGF、膠原蛋白和纖維化則顯著增加，在隨后的動物和細(xì)胞實驗中證實miRNA-30c通過與CTGF基因mRNA3’非編碼區(qū)結(jié)合，從而可以有效抑制CTGF蛋白的表達(dá)［8］。

運動可以使機體各組織和器官miRNA表達(dá)量產(chǎn)生變化，特異性表達(dá)的miRNA通過對靶基因的調(diào)控來影響機體對運動的適應(yīng)［5］。本研究在前人研究的基礎(chǔ)上猜測長期有規(guī)律的有氧運動可以使小鼠心肌組織產(chǎn)生特異表達(dá)的miRNA，它們通過影響CTGF的表達(dá)而影響小鼠心室順應(yīng)性。由此本研究首先通過基因芯片篩選出有氧運動組和對照組小鼠心臟差異性表達(dá)的miRNA，再用實時定量的PCR來驗證幾個關(guān)健的miRNA，最后通過miRNA與CTGF表達(dá)的相關(guān)分析，來重點探索心臟對運動適應(yīng)的分子機制。

1 材料與方法

1.1 分組

實驗用小鼠20只，均為6周齡的KM小鼠，平均體重為15.9±2.1g，由某大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供。實驗動物購入后，首先在實驗室動物房將小鼠分籠為3～4只／籠，然后對小鼠進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)一周，飼料為標(biāo)準(zhǔn)普通飼料，控制動物房溫度恒定為22℃，每天12h自然光照，小鼠能夠自由飲食和飲水；在適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，根據(jù)隨機數(shù)字表將20只小鼠隨機分為2組，每組10只；一組小鼠在原飼養(yǎng)條件下，不進(jìn)行任何處理，為安靜對照組，另一組小鼠在原飼養(yǎng)條件下，同時進(jìn)行為期8周的有氧運動訓(xùn)練。在進(jìn)行實驗前對兩組小鼠稱量體重，發(fā)現(xiàn)兩組間小鼠體重?zé)o統(tǒng)計學(xué)差異。

1.2 小鼠有氧運動訓(xùn)練方法

有氧運動訓(xùn)練組小鼠進(jìn)行無負(fù)重游泳訓(xùn)練，小鼠游泳池為一長方體魚缸改裝而成，規(guī)格為100cm×80cm×50 cm，水深30cm，水溫控制為22℃。在正式有氧運動訓(xùn)練前，首先讓實驗組小鼠在游泳池內(nèi)進(jìn)行為期3天，每天2次，每次10min的適應(yīng)性游泳。然后實驗組小鼠正式開始8周的有氧運動訓(xùn)練，每周訓(xùn)練5天。前5周，小鼠每天在早上時間7:30—8:30進(jìn)行一次有氧游泳，后3周小鼠每天運動2次，期間間隔12h，運動時間固定在每天早上7:30—8:30和晚上19:30—20:30，運動持續(xù)時間由第一周的30min開始，每周增加10min直至90min。當(dāng)在有氧游泳過程中發(fā)現(xiàn)小鼠動作不協(xié)調(diào)，有下沉趨勢時，將其取出休息3min，待其體力恢復(fù)后，再放入游泳池中繼續(xù)游泳。有氧運動訓(xùn)練結(jié)束后，分別對兩組小鼠進(jìn)行游泳最長耐力時間測定，記錄每只小鼠游泳最長堅持時間。小鼠游泳運動結(jié)束后迅速吹干毛發(fā)，放回鼠籠中。

1.3 小鼠心臟超聲心動圖測定方法

小鼠有氧運動訓(xùn)練結(jié)束后一周，對全部小鼠進(jìn)行心臟超聲心動圖檢測，具體方法為:首先對小鼠腹腔注射25%烏拉坦（用量為1ml／100g）麻醉，隨后將小鼠仰臥固定在35℃恒溫加熱板上，對小鼠左胸前進(jìn)行脫毛處理，最后使用高分辨小動物超聲成像系統(tǒng)（Vevo770型號，加拿大Visual Sonics公司）和連接15L8高頻探頭的超聲儀（Contrast Pulse SequencingTM，Sequoia 512，德國Siemens公司）對小鼠心臟進(jìn)行超聲心動圖檢測。將高頻探頭頻率設(shè)置為30MHz，聚焦深度為1.3cm，采集小鼠心臟二維、M型超聲心動圖像，測量評價小鼠心臟形態(tài)和功能學(xué)的各項指標(biāo)。本次研究選用的形態(tài)學(xué)指標(biāo)有舒張期心室后壁厚度（PWTD）、收縮期心室后壁厚度（PWTS）、左心室舒張末期內(nèi)徑（LVEDD）、舒張期心室隔膜厚度（IVSTD）和收縮期心室隔膜厚度（IVSTS）；選用的功能學(xué)指標(biāo)有左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、左心室短軸縮短指數(shù)（LVFS）、平均環(huán)周纖維縮短速率（VCF）、E波峰值（Peak E）、A 波峰值（Peak A）、E波峰值和A波峰值的比值（Ratio E／A）和左室等容舒張時間（IVRT）。

1.4 小鼠心臟組織取樣和稱重

在有氧運動最后一次訓(xùn)練結(jié)束48h后，首先將所有小鼠稱重（BW），隨后迅速將小鼠頸椎脫位法猝死，然后解剖小鼠將心臟完整取出并進(jìn)行修剪，將心臟沿冠狀面切開，用濾紙吸干心臟表面液體后稱重心臟（HW），最后將小鼠心臟組織迅速放入液氮中速凍后，再轉(zhuǎn)至-80℃超低溫冰箱中保存待用。

1.5 miRNA芯片和實時定量PCR技術(shù)檢測miRNA方法

1.5.1 小鼠左心室組織總RNA提取和質(zhì)量檢測

用液氮預(yù)冷自動組織研磨儀的切頭后對小鼠左心室組織樣本進(jìn)行研磨，嚴(yán)格按照TRIzol試劑（Invitrogen公司）說明書的步驟，逐步提取出組織樣本中的總RNA。應(yīng)用紫外分光光度計測定總RNA的吸光度A260值和A280值，用A260值計算總RNA濃度，計算A260／A280值檢測提取的總RNA的純度；最后用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)一步檢測RNA質(zhì)量。

1.5.2 miRNA芯片檢測不同組別小鼠左心室組織miRNA的表達(dá)

分別將有氧運動訓(xùn)練組和對照組小鼠左心室組織提取的總RNA混合在一起，使用LNATMmiRNA 芯片（11.0版，丹麥Exiqon公司）檢測兩組樣品miRNA的表達(dá)水平。LNATMmiRNA芯片中包含了1807個特異性探針，可以檢測Sanger miRBase 11.0數(shù)據(jù)庫中小鼠全部609條miRNA。分別取5μg上述兩組左心室組織樣本的總RNA進(jìn)行miRNA芯片雜交，具體步驟按照各試劑說明書進(jìn)行；雜交后芯片用生物芯片掃描儀（Genepix 4000B，美國 Molecular Devices公司）635nm波長進(jìn)行圖像掃描，所得數(shù)據(jù)用生物芯片掃描分析軟件（Genepix Pro 6.0，美國 Molecular Devices公司）分析，使用原始值減去背景值做修正，并用中值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，分別計算出兩組樣本之間標(biāo)準(zhǔn)值的比值。

1.5.3 實時定量PCR檢測候選miRNA的表達(dá)量

取每個樣本左心室組織總RNA 2μg作為初始模板，按照說明書配制總反應(yīng)體系20μl，應(yīng)用第一鏈cDNA合成試劑盒（中國上海，上海研拓生物科技有限公司）在核酸擴(kuò)增儀（Gene Amp PCR System 9700，美國ABI公司）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。隨后去掉上述合成的cDNA為模板，以U6作為內(nèi)參，每個檢測樣本做3個復(fù)孔，在實時熒光定量PCR系統(tǒng)（7900HT Fast，美國 ABI公司）進(jìn)行實時定量PCR，具體步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。實驗中所用引物均由美國ABI公司合成。根據(jù)系統(tǒng)收集的數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCT法計算樣品中miRNA的相對含量，其中CT值為PCR反應(yīng)檢測到的熒光強度值顯著大于背景值的循環(huán)數(shù)，計算公式為ΔCt＝Ct目的基因-Ct內(nèi)參；ΔΔCt＝ΔCt實驗組-ΔCt對照組。

1.6 小鼠左心室組織CTGF基因和蛋白表達(dá)測定

將上述各樣本抽提的總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄生成單鏈cDNA，最后用定熒光量PCR試劑盒（DyNAmo SYBR Green qPCR，上海博華生物科技有限公司）檢測CTGF基因的mRNA表達(dá)水平，各操作步驟均依照試劑盒說明書進(jìn)行。以β-actin基因表達(dá)量作為定量PCR的內(nèi)參。基因表達(dá)變化倍數(shù)采用以下公式計算:ΔCt＝Ct目的基因-Ct內(nèi)參；ΔΔCt＝ΔCt實驗組-ΔCt對照組。將上述各樣本左心室組織研磨液沉淀離心后，取10μl組織液，用小鼠結(jié)締組織生長因子酶聯(lián)免疫分析試劑盒（美國R＆D公司）進(jìn)行蛋白含量的測定，具體步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

資料采用SPSS 15統(tǒng)計軟件分析，定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，所有定量資料均進(jìn)行正態(tài)性檢驗，因本文所有資料均服從正態(tài)性假設(shè)，故當(dāng)方差齊性時，兩組定量資料間的比較采用t檢驗，當(dāng)方差不齊時，兩組定量資料的組間比較采用t’檢驗，兩變量的相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 有氧運動訓(xùn)練后小鼠與對照組一般特征比較

為了評價小鼠8周有氧運動訓(xùn)練后的效果，本研究檢測了有氧運動訓(xùn)練組與對照組小鼠身體一般形態(tài)學(xué)指標(biāo)以及血液動力學(xué)指標(biāo)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，8周后有氧運動訓(xùn)練組小鼠體重（23.76±2.67）與對照組（23.33±2.56）相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＝0.718）；有氧運動訓(xùn)練組小鼠血壓（112±6）與對照組（107±5）相比差異同樣無統(tǒng)計學(xué)意義（P＝0.058）；有氧運動訓(xùn)練組小鼠 HR（310±10次／min）顯著低于對照組（346±13次／min，P＜0.001）；有氧運動訓(xùn)練組小鼠 HW（mg），HW／BW（mg／g）、˙VO2max（ml／kg／min）和運動耐受時間均高于對照組，其中與對照組相比有氧運動訓(xùn)練組小鼠 HW增加了18.1%，HW／BW增加了15.8%，˙VO2max增 加 了 19.6%，運 動 耐 受 時 間 增 加 了31.6%，兩組間這些指標(biāo)經(jīng)統(tǒng)計學(xué)檢驗，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。由此證明，8周有氧運動訓(xùn)練對小鼠的形態(tài)學(xué)和血流動力學(xué)指標(biāo)產(chǎn)生了影響，如小鼠心臟重量增加，靜息狀態(tài)下心動降緩、攝氧量增加、運動耐受時間增長等。

2.2 有氧運動訓(xùn)練組與對照組小鼠超聲心動圖結(jié)果比較

8周有氧運動訓(xùn)練后，同時對兩組小鼠心臟進(jìn)行超聲心動圖檢測，發(fā)現(xiàn)有氧運動訓(xùn)練對小鼠心臟結(jié)構(gòu)和功能均有明顯影響。有氧運動組小鼠收縮期心室后壁厚度（PWTS）、左心室舒張末期內(nèi)徑（LVEDD）、舒張期心室隔膜厚度（IVSTD）和收縮期心室隔膜厚度（IVSTS）4個心臟形態(tài)學(xué)指標(biāo)均顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）；兩組間舒張期心室后壁厚度（PWTD）差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＝0.487）；有氧運動組小鼠左室等容舒張時間（IVRT）顯著低于對照組小鼠，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＝0.002）；有氧運動組小鼠E波峰值和A波峰值的比值（Ratio E／A）顯著高于對照組小鼠，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.001）；兩組間左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、左心室短軸縮短指數(shù)（LVFS）和平均環(huán)周纖維縮短速率（VCF）差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05）。總體結(jié)果表明，8周有氧運動訓(xùn)練后小鼠心臟呈現(xiàn)生理性肥大變化，同時其心臟順應(yīng)性也有一定程度提升（表2）。

表1 本研究有氧運動訓(xùn)練組與對照組小鼠一般特征比較一覽表Table 1.General characteristics between aerobic exercise training mice and control mice

表2 本研究有氧運動訓(xùn)練組與對照組小鼠超聲心動圖檢測結(jié)果比較一覽表Table 2.Echocardiography Measurements between Aerobic Exercise Training Mice and Control Mice

2.3 有氧運動訓(xùn)練后小鼠左心室肌組織miRNA表達(dá)結(jié)果

在有氧運動引起的小鼠心臟生理性肥大中，為了檢測出差異表達(dá)的miRNA，本研究采用基因芯片檢測609個小鼠miRNA，miRNA檢測相對量在兩組間相比倍數(shù)大于2，即認(rèn)為兩組間該miRNA表達(dá)有差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組左心室肌組織相比，有氧運動訓(xùn)練后小鼠左心室肌組織中表達(dá)上調(diào)超過2倍的miRNA有12個，分別為hsa-miR-29c、hsa-miR-30c、hsa-miR-181b、hsa-miR-363、hsa-miR-181c、hsa-miR-338-3p、hsa-miR-1225-5p、hsa-miR-26b、hsa-miR-132、hsa-miR-15a、hsa-miR-939 和 hsa-miR-7；表達(dá)下調(diào)超過2倍的miRNA有8個，分別為hsa-miR-1、hsamiR-133a、hsa-miR-16、hsa-miR-21、hsa-miR-125b、hsamiR-145、hsa-miR-126和hsa-miR-652（表3）。參考相關(guān)文獻(xiàn)，同時選取上調(diào)倍數(shù)和下調(diào)倍數(shù)處于前兩位的miRNA，分 別 為 hsa-miR-29c、hsa-miR-30c，hsa-miR-1 和 hsa-miR-133a，使用實時定量PCR檢測來驗證其差異表達(dá)是否與基因芯片結(jié)果一致。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，此四個miRNA定量PCR檢測結(jié)果與基因芯片檢測結(jié)果趨勢一致，有氧運動組小鼠左心室肌組織miRNA-1和miRNA-133a顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；有氧運動組小鼠左心室肌組織miRNA-29c和miRNA-30c顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，圖1）。

表3 本研究有氧運動訓(xùn)練后小鼠心室肌細(xì)胞miRNA差異表達(dá)結(jié)果一覽表Table 3.Differential Expression of miRNAs in Left Ventricle Induced by Aerobic Exercise Training

圖1 本研究有氧運動訓(xùn)練組和對照組小鼠心室肌細(xì)胞miRNA-1、miRNA-133a、miRNA-29c和miRNA-30c實時定量PCR表達(dá)結(jié)果Figure 1.Differential Expression of miRNAs-1，133a，29c and 30cin Left Ventricle by Real-time PCR in Aerobic Exercise Training Mice and Control Mice

2.4 有氧運動訓(xùn)練組與對照組小鼠左心室組織CTGF基因和蛋白表達(dá)結(jié)果以及有氧運動訓(xùn)練組小鼠心肌CTGF蛋白與miRNA-30c的相關(guān)分析

在有氧運動引起的小鼠心臟生理性肥大中，為了研究結(jié)締組織生長因子（CTGF）的作用，本研究在兩組小鼠中檢測了左心室CTGF基因和蛋白的表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有氧運動訓(xùn)練組小鼠左心室CTGF基因和蛋白的表達(dá)量均顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，圖2）。同時相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，在有氧運動訓(xùn)練組小鼠左心室組織中CTGF蛋白表達(dá)量與miRNA-30c表達(dá)量呈顯著負(fù)相關(guān)（P＝0.004），相關(guān)系數(shù)r為-0.818（圖3）。

圖2 本研究有氧運動訓(xùn)練組和對照組小鼠左心室肌組織CTGF基因和蛋白表達(dá)結(jié)果Figure 2.Gene and Protein Expression of CTGF in Left Ventricle of Aerobic Exercise Training Mice and Control mice

圖3 有氧運動訓(xùn)練組小鼠左心室肌組織CTGF蛋白和miRNA-30c的相關(guān)分析Figure 3.Correlation Analysis of CTGF Protein and miRNA-30cin Left Ventricle of Aerobic Exercise Training Mice

3 討論與分析

本研究探討了有氧運動訓(xùn)練對小鼠心臟形態(tài)結(jié)構(gòu)、功能及心室肌miRNAs的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有氧運動訓(xùn)練明顯提高了小鼠心室內(nèi)徑、心壁厚度和功能學(xué)指標(biāo)Ratio E／A，提示運動誘導(dǎo)小鼠心臟生理性肥大，增加了心室順應(yīng)性；與安靜對照組相比，8周有氧運動訓(xùn)練后小鼠心肌組織中miRNA-1和-133a顯著下降，而miRNA-29和-30c則顯著升高；同時觀察到有氧運動訓(xùn)練組小鼠心肌組織中CTGF基因和蛋白的表達(dá)顯著低于對照組；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，有氧運動訓(xùn)練組小鼠心肌組織中miRNA-30c表達(dá)量與CTGF蛋白表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r＝-0.818。由此可知，有氧運動訓(xùn)練通過增加心室肌組織中miRNA-30c的表達(dá)量，抑制心肌組織中CTGF的表達(dá)和濃度，從而提高了運動引起心臟生理性肥大過程中心室順應(yīng)性，有利于心臟功能的正常有效發(fā)揮。

近年，隨著表觀遺傳學(xué)的不斷發(fā)展及其對運動醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的交叉滲透，國內(nèi)、外學(xué)者開始嘗試從控制基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的表觀遺傳方面，如微小RNA（micro RNA）、DNA甲基化和乙?；?，來研究運動導(dǎo)致心臟血流動力負(fù)荷增加所引起的心臟結(jié)構(gòu)和功能的改變，改善和提高運動員心臟功能，幫助運動員更好的適應(yīng)訓(xùn)練方式以及取得優(yōu)異的成績。微小RNAs（microRNAs，miRNAs）是一類大約22個核苷酸組成的單鏈非編碼RNAs。miRNAs的生成非常復(fù)雜，需要許多酶蛋白以及RNAs的參與。首先，細(xì)胞核內(nèi)由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄出的長鏈初始RNAs被RNA酶Ⅲ家族的Drosha和DGCR8組成的酶復(fù)合體剪切成長約65-70核苷酸、帶有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的前體miRNAs；隨后，前體miRNAs被轉(zhuǎn)運至胞漿，在同樣RNA酶Ⅲ家族Dicer酶的處理下形成長度約22個核苷酸的雙鏈miRNAs，其中一條鏈很快降解，另一條鏈進(jìn)入RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體成為成熟的miRNAs。與RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體結(jié)合的miRNAs，通過堿基配對方式結(jié)合到靶基因mRNA的3’端非翻譯區(qū)，誘導(dǎo)靶mRNA的降解或抑制其翻譯成蛋白質(zhì)，在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮著基因調(diào)節(jié)的作用［12］。miRNAs參與了細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞分化、發(fā)育、代謝和凋亡等一系列生理和病理進(jìn)程。研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs在心臟的生長和發(fā)育過程中存在著差異表達(dá)的情況，其通過對靶基因的調(diào)控影響心臟的重塑過程。

有研究已經(jīng)證實，miRNA-1、-133a和29c對于心臟生理性或病理性肥大中心肌組織重塑和功能發(fā)揮起著非常重要的作用。miRNA-1和-133a在正常心肌組織呈高表達(dá)狀態(tài)，而在肥厚性心肌病和心房擴(kuò)張病人心臟中表達(dá)水平則顯著降低［19，20］。Ikeda在體外心肌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，miRNA-1通過與鈣調(diào)蛋白、Mef2a和Gata4等心肌肥大相關(guān)基因3’端非編碼區(qū)結(jié)合抑制心肌組織這些基因的表達(dá)水平，在裸鼠和成年小鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)中增加miRNA-1水平，可明顯抑制心肌細(xì)胞肥大［11］。Liu通過基因工程技術(shù)敲除小鼠miRNA-133a和-133b基因后發(fā)現(xiàn)，小鼠心臟纖維化導(dǎo)致心臟嚴(yán)重畸形，如室間隔缺損、右心房和心室擴(kuò)大［14］。本研究通過8周有氧運動訓(xùn)練誘導(dǎo)了小鼠心臟肥大，同時發(fā)現(xiàn)其心臟組織中miRNA-1和-133a顯著下降，這可能是運動抑制了相關(guān)miRNA表達(dá)，從而使原來被抑制的心肌肥大相關(guān)基因被激活，使心臟纖維化增加導(dǎo)致心臟生理性肥大。Castoldi和他的同事報道，心肌組織中miRNA-133a和29c可以抑制Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá)，miRNA-133a和29c表達(dá)量下降，介導(dǎo)了血管緊張素Ⅱ依賴性高血壓心肌纖維化的發(fā)生［6］。Van等在小鼠和人體心臟組織中研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-29可以調(diào)節(jié)多種膠原蛋白、纖維蛋白的表達(dá)，其表達(dá)下降會增加膠原蛋白和纖維蛋白的表達(dá)，從而導(dǎo)致心臟纖維化［21］。運動對心肌組織中miRNAs的表達(dá)影響的研究很少，國內(nèi)學(xué)者趙永才研究運動對小鼠心肌miRNAs的影響時發(fā)現(xiàn)，運動降低了心肌組織中miRNA-1和133a的表達(dá)，miRNA-1和133a表達(dá)下降與運動致心臟生理性肥大過程中心臟重塑有關(guān)［3］。Soci則發(fā)現(xiàn)，有氧運動降低了小鼠心肌組織中miRNA-1和133a的表達(dá)同時，增加了miRNA-29c的表達(dá)，同時證實miRNA-29c表達(dá)增加提升了小鼠心室順應(yīng)性［17］。本研究發(fā)現(xiàn)，有氧運動訓(xùn)練后小鼠心肌組織中miRNA-29c顯著升高，這與Soci的研究是一致的，這可能是運動誘導(dǎo)了miRNA-29c的表達(dá)，miRNA-29c的表達(dá)的增加可以抑制心臟膠原蛋白和纖維蛋白的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)由于運動致心臟miRNA-1和133a表達(dá)量降低，而導(dǎo)致的心臟過度纖維化，避免了運動致心臟生理性肥大過向病理性纖維化轉(zhuǎn)化，提升了心臟心室順應(yīng)性，有利于心臟對運動的生理性適應(yīng)。

心臟組織中細(xì)胞外基質(zhì)在保持心臟收縮力量和心肌細(xì)胞間電信號的傳遞方面發(fā)揮重要的作用，但是，在高血壓和壓力負(fù)荷等病理反應(yīng)刺激下，心臟組織中細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)過度積聚在心臟中，會改變心臟收縮力量和肌電信號傳遞，從而對心臟功能的發(fā)揮產(chǎn)生不利影響［15］。結(jié)締組織生長因子（CTGF）能夠誘導(dǎo)心肌細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)的合成，介導(dǎo)心肌組織纖維化［10］。Rudy和他的同事觀察到，在有心臟疾病的裸鼠以及左心室肥大的病人中miRNA-30表達(dá)量與CTGF水平顯著負(fù)相關(guān)，同時發(fā)現(xiàn)在體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中敲除miRNA-30基因，則會增加CTGF的表達(dá)水平。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-30可以與CTGF基因3’端結(jié)合，從而抑制CTGF的表達(dá)［8］。在本研究中發(fā)現(xiàn)，有氧運動誘導(dǎo)小鼠心肌組織中miRNA-30c的表達(dá)，同時發(fā)現(xiàn)有氧運動組小鼠心肌組織中CTGF表達(dá)水平與miRNA-30c量顯著負(fù)相關(guān)，這與前人研究是一致的；同時本研究也觀察到，有氧運動后小鼠心室順應(yīng)性增加了，這可能與有氧運動誘導(dǎo)miRNA-30c表達(dá)，miRNA-30與CTGF基因3’端結(jié)合從而抑制CTGF的表達(dá)，同時CTGF表達(dá)的降低下調(diào)了心肌組織中細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的水平，避免了運動誘導(dǎo)心臟生理性肥大過程中心肌組織過度纖維化，從而有利于心臟生理性肥大過程中心臟功能的正常發(fā)揮。

4 總結(jié)

本研究發(fā)現(xiàn)，有氧運動訓(xùn)練誘導(dǎo)了心室肌組織中miRNA-30c的表達(dá)，抑制了心肌組織中CTGF基因的表達(dá)和蛋白濃度，提高運動引起心臟生理性肥大過程中心室順應(yīng)性，有利于心臟功能的正常有效發(fā)揮，為避免運動員在高強度訓(xùn)練過程中心臟負(fù)荷過大而造成心臟損害，提供了新的思路和方向。

今后需要研究更多心臟相關(guān)miRNAs，探討在不同運動條件下，它們對心臟影響的更深層次的分子生物學(xué)機制，同時，將研究結(jié)果在大樣本人群中進(jìn)行驗證。

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