他克莫司對EAE鼠血清IL-12和IFN-γ的影響及其與髓鞘堿性蛋白相關(guān)性的研究

趙麗波 張健莉 付宏娟 黃月萍

黑龍江省醫(yī)院老年神經(jīng)內(nèi)科，黑龍江哈爾濱 150036

多發(fā)性硬化（mulitple sclerosis，MS）是一種以中樞神經(jīng)系統(tǒng)白質(zhì)脫髓鞘為主要病理特點(diǎn)的自身免疫性疾病，MS產(chǎn)生的免疫反應(yīng)多認(rèn)為是自身免疫細(xì)胞被激活后對髓鞘堿性蛋白（MBP）的免疫反應(yīng)[1]。MBP是構(gòu)成中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘的一種特殊蛋白質(zhì)，在髓鞘形成和腦分化發(fā)育過程中起著重要作用[2]。MS患者體內(nèi)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的自身抗原-MBP暴露與免疫活性細(xì)胞相互作用誘導(dǎo)了特異的免疫應(yīng)答，導(dǎo)致炎性髓鞘病理性脫失，游離的MBP就會(huì)進(jìn)入血液中導(dǎo)致血液中含量升高[3]。目前臨床對MS進(jìn)行腦脊液免疫學(xué)檢查項(xiàng)目較多，但尚無一滿意的特異性檢查，因此，臨床一般將周圍血和腦脊液同時(shí)進(jìn)行檢查[4]。本研究旨在通過觀察利用MBP作為抗原，復(fù)制MS的動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）豚鼠周圍血和腦脊液MBP、血清白介素 12（IL-12）干擾素 γ（IFN-γ）的水平，并動(dòng)態(tài)觀察應(yīng)用他克莫司治療前及治療后不同時(shí)間MBP、IL-12、IFN-γ的變化情況，從而可能為預(yù)防MS臨床復(fù)發(fā)提供一種有效的新藥提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

大鼠 IL-12、IFN-γ、MBP（ELISA）試劑盒（美國 R&D公司）；BIO-RAD 550型酶標(biāo)儀（美國BIO-RA D公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及方法

豚鼠22只，雌雄各半，7～8周齡，體重 200～250 g，利用MBP作為抗原，復(fù)制MS的動(dòng)物模型EAE，在每只大鼠的雙側(cè)后足跖一次性皮下注射含有豚鼠MBP 25 μg的弗氏完全佐劑（FCA）200 μL，模型制備成功的表現(xiàn)為急性、嚴(yán)重的單向病程，可自發(fā)緩解。將試驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為研究組（12只）和對照組（10只），對照組予以 EAE+生理鹽水，研究組在EAE誘導(dǎo)的第1～7天，每日腹腔內(nèi)注射劑量為1 mg/kg的他克莫司，其中急性發(fā)作期8只，緩解期4只。

1.3 檢測方法

大鼠心室內(nèi)取血0.6 mL，靜置20 min，3 000 r/min離心 20 min，取血清-20℃凍存，備測 IL-12、IFN-γ、MBP 用。IL-12、IFN-γ、MBP 檢測采用雙抗體夾心法（ELISA）測定，操作方法嚴(yán)格按使用說明書進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用 t檢驗(yàn)，以 P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清和腦脊液中MBP水平比較

研究組大鼠血清和腦脊液中的MBP水平均顯著高于對照組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。且兩組腦脊液中的MBP水平均顯著高于血清中MBP水平，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表1。

表1 兩組血清和腦脊液中MBP水平比較（±s）

表1 兩組血清和腦脊液中MBP水平比較（±s）

注：與血清MBP比較，#P＜0.01

組別 只數(shù) MBP水平血清（ng/mL） 腦脊液（ng/mL）研究組對照組t值P值12 10 7.62±1.74 1.52±0.83 3.946＜0.01 12.07±3.42#4.39±1.35#5.284＜0.01

2.2 大鼠急性發(fā)作期及緩解期血清及腦脊液MBP水平及血清IL-12、IFN-γ水平比較

研究組MS大鼠急性發(fā)作期及緩解期血清及腦脊液中MBP、IL-12、IFN-γ水平均明顯高于對照組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），且MS急性發(fā)作期血清及腦脊液中MBP、IL-12、IFN-γ水平均分別顯著高于MS緩解期，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），且MS大鼠其腦脊液 MBP和血清MBP水平呈正相關(guān)（r=0.562，P＜0.01）。見表2。

表2 MS大鼠急性發(fā)作期及緩解期血清及腦脊液MBP水平及血清 IL-12、IFN-γ 水平比較（±s）

表2 MS大鼠急性發(fā)作期及緩解期血清及腦脊液MBP水平及血清 IL-12、IFN-γ 水平比較（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.01；與緩解期比較，#P＜0.01

組別 只數(shù)MBP水平血清（ng/mL）腦脊液（ng/mL）IL-12（pg/mL）IFN-γ（ng/mL）急性發(fā)作期組緩解期組對照組841 0 10.86±1.59*#5.35±1.14*1.52±0.83 17.45±2.82*#8.23±1.44*4.39±1.35 32.60±10.52*#22.50±6.42*16.63±3.13 15.65±3.35*#6.05±2.28*3.01±1.15

2.3 研究組大鼠治療前及治療后的不同時(shí)間血清和腦脊液MBP水平及血清IL-12、IFN-γ水平比較的變化情況比較

12只大鼠予以他克莫司注射后，結(jié)果顯示，治療后的第3天及治療后第7天血清和腦脊液MBP、IL-12、IFN-γ水平均較治療前明顯降低，且腦脊液MBP水平較血清MBP水平降低更明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表3。

表3 MS血清和腦脊液治療前及治療后的不同時(shí)間MBP水平及血清 IL-12、IFN-γ 水平比較的變化情況比較（±s，n=12）

表3 MS血清和腦脊液治療前及治療后的不同時(shí)間MBP水平及血清 IL-12、IFN-γ 水平比較的變化情況比較（±s，n=12）

注：與血清MBP比較，#P＜0.05

治療前 治療后第3天治療后第3天F值 P值血清MBP水平（ng/mL）（ng/mL）7.62±1.74 12.07±3.42 30.25±8.92 8.29±1.31 5.84±1.85#21.78±6.34 3.89±0.1.67±0.2 15.67±4腦脊液MBP水平IL-12（pg/mL）IFN-γ（ng/mL）15.01±4.456.65±2.19 42 3#.10 2.93±1.17 8.253 9.527 7.143 5.647＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01

3 討論

MS是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性脫髓鞘疾病，其病因及病理學(xué)機(jī)制至今仍未完全闡明，但MS自身免疫的發(fā)病機(jī)制已得到證實(shí)和公認(rèn)[5]。各種原因?qū)е滤枨势茐暮螅寤蚰X脊液中的MBP及血清IL-12、IFN-γ濃度增高，因此測定血清IL-12、IFN-γ及血清和腦脊液MBP的水平，可以用于反映中樞神經(jīng)系統(tǒng)有無實(shí)質(zhì)性損害及有無髓鞘脫失[6-7]。

本組研究結(jié)果顯示，研究組大鼠血清和腦脊液中的MBP水平均顯著高于對照組（P＜0.01），提示檢測MBP含量變化是診斷MS的一項(xiàng)有價(jià)值的生化指標(biāo)。表2結(jié)果顯示，研究組急性發(fā)作期及緩解期大鼠血清及腦脊液中MBP水平、血清 IL-12、IFN-γ 分別明顯高于對照組（P ＜ 0.01），說明大鼠活動(dòng)期血清MBP明顯升高，反映了損害的范圍和嚴(yán)重程度，尤其對判斷MS是否處于活動(dòng)期具有重要的臨床意義[8]；說明IL-12、IFN-γ是介導(dǎo)MS始發(fā)免疫反應(yīng)的重要因子，可正向調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫使病情加重，這也與有學(xué)者發(fā)現(xiàn)MS患者體內(nèi)有高水平的循環(huán)IFN-γ的研究結(jié)論一致。

表2顯示研究組12只大鼠，其中急性發(fā)作期 8只，其腦脊液中 MBP、IL-12、IFN-γ 水平最高。 Majewska 等[9-10]研究證實(shí)，MS患者急性期腦脊液MBP與臨床評分關(guān)系密切，提出監(jiān)測腦脊液MBP的變化水平，有利于判斷MS的病情嚴(yán)重程度和預(yù)后。且大鼠腦脊液MBP和血清MBP水平呈正相關(guān)（r=0.562，P＜0.01），說明作為主要自身抗原之一的MBP對MS的發(fā)病敏感性高。有學(xué)者研究顯示，IL-12在穩(wěn)定期的原發(fā)進(jìn)展型MS患者中顯著升高，而血清IFN-γ含量的增高對MS引起病情加重，這說明檢測患者CSF和血清中的MBP、IL-12、IFN-γ水平對于MS的診斷和療效監(jiān)測有重要參考價(jià)值。

他克莫司是一種新型免疫抑制劑，是一種廣泛應(yīng)用于器官移植的大環(huán)內(nèi)酯類免疫抑制藥物，于1984年從日本筑波山土壤中被分離到。他克莫司除了在抑制器官移植排斥反應(yīng)方面具有顯著療效外，還廣泛應(yīng)用于斑禿、銀屑病、魚鱗病、糖尿病、白塞病、變應(yīng)性皮炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎以及MS等自身免疫疾病的治療，在對脊髓損傷的模型中具有保護(hù)神經(jīng)，營養(yǎng)神經(jīng)和促進(jìn)神經(jīng)再生和抑制T細(xì)胞增生、活化的作用。研究組12只大鼠應(yīng)用他克莫司治療后，MBP水平在治療前明顯增加，但治療后的第3天及治療后的第7天的不同時(shí)間顯著下降，血清IL-12、IFN-γ水平也顯著下降。說明MS對他克莫司等激索類藥物的短程療效較好。國內(nèi)外已有學(xué)者將他克莫司應(yīng)用于自身免疫性疾病的研究，其中，Gold等[11]研究證實(shí)，他克莫司通過免疫抑制和神經(jīng)保護(hù)作用顯著改善小鼠的髓鞘脫失和軸突損傷。

綜上所述，通過檢測周圍血和腦脊液MBP的水平，并動(dòng)態(tài)觀察應(yīng)用他克莫司治療前及治療后MBP、IL-12、IFN-γ的變化情況，一方面對判斷MS預(yù)后、病情嚴(yán)重程度和臨床診斷具有重要的臨床意義，另一方面可能為預(yù)防多發(fā)性硬化的臨床復(fù)發(fā)提供一種有效的新藥提供指導(dǎo)依據(jù)，但由于樣本量過小，仍需日后在擴(kuò)大樣本量的基礎(chǔ)上對其進(jìn)一步深入研究。

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