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    重疊PCR克隆Exendin-4的基因及序列分析

    2013-10-17 05:27:42王俊紅郭永紅楊廣笑王全穎
    中國醫(yī)藥導(dǎo)報 2013年15期
    關(guān)鍵詞:瓊脂糖克隆質(zhì)粒

    王俊紅 郭永紅 張 靜 徐 靜 謝 璇 楊廣笑 王全穎 王 楓

    1.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科,陜西西安 710004;2.第四軍醫(yī)大學(xué)營養(yǎng)與食品衛(wèi)生教研室,陜西西安 710032;3.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院感染科,陜西西安 710004;4.西安華廣生物工程有限公司,陜西西安 710025

    Exendin-4是胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)受體長效激動劑,具有與GLP-1相似的降血糖活性,目前已研發(fā)成為首個 “模仿腸降血糖素”治療2型糖尿病的藥物——Exenatide[1-2]。但是Exenatide需每日注射,對糖尿病患者的治療很不方便[3],并且天然Exendin-4的提取成本高,難以滿足臨床應(yīng)用需要[4],用基因工程方法生產(chǎn)前景廣闊。由于Exendin-4缺乏模板,本實驗利用重疊延伸PCR技術(shù)擴(kuò)增出Exendin-4目的基因編碼區(qū)DNA片段,成功構(gòu)建了Exendin-4表達(dá)載體,為進(jìn)一步利用腺相關(guān)病毒載體構(gòu)建表達(dá)Exendin-4及研究其在糖尿病治療過程中的分子作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 質(zhì)粒與菌株

    克隆載體 pGEM-T-Easy質(zhì)粒(50 ng/μL)購自 Promega公司;大腸桿菌TOP10、E.coli DH5α菌株由西安華廣生物工程公司提供。

    1.2 工具酶和主要試劑

    限制性內(nèi)切酶NaeⅠ、BamHⅠ、EcoRⅠ及TaqDNA聚合酶、T4 DNA連接酶等試劑購自華美生物工程公司;質(zhì)粒小提試劑盒、PCR純化試劑盒、DNA回收試劑、Marker等均購自北京天根公司;引物合成及測序由上海生物工程有限公司完成;其他試劑及全部實驗設(shè)備均由西安華廣生物工程公司提供。

    1.3 方法

    1.3.1 重疊延伸PCR擴(kuò)增Exendin-4 cDNA[3]根據(jù)美國專利檢索到Exendin-4氨基酸序列是39個氨基酸(sequence 1 from patent US 5424286 39aa),應(yīng)用 DNASIS 計算機(jī)軟件分析Exendin-4的開放閱讀框(ORF)和它的編碼子,截取39肽的編碼cDNA,設(shè)計正、負(fù)向引物/模板鏈,正向引物的5′端設(shè)計加入NaeⅠ酶切位點(diǎn),負(fù)向引物的5′端加入終止子和BamHⅠ酶切位點(diǎn)。通過非對稱互補(bǔ)引物/模板(重疊)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法獲得完整的Exendin-4,首先P1和P2互為引物和模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增Exendin-4 cDNA核心區(qū),以第1次PCR產(chǎn)物為模板,P3、P4為引物合成完整的Exendin-4,且分別在引物P3、P4中引入NaeⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)和終止子。引物序列見表1。PCR反應(yīng)體系:在 100 μL 反應(yīng)總體積中,加入 1 μL(0.1 mg/L)DNA模板,1 μL(50 μmol/L)上游引物,1 μL(50 μmol/L)下游引物,2 μL(10 mmol/L) dNTPs,10 μL 10×Taq DNA 聚合酶緩沖液,80 μL消毒去離子水,最后在體系表面加50 μL石蠟油;沸水中煮 5 min 后,立即冰浴 2 min,加 1 μL(1 U/μL)TaqDNA聚合酶入反應(yīng)體系。擴(kuò)增條件如下:94℃預(yù)變性1 min,進(jìn)入 94℃ 30 s,60℃ 30 s,72℃ 30 s,72℃延伸 5 min,32個循環(huán);取擴(kuò)增產(chǎn)物10 μL進(jìn)行1%瓊脂糖電泳,觀察電泳結(jié)果。PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳法回收,正丁醇濃縮,酚∶氯仿抽提,無水乙醇沉淀;將沉淀溶于 20 μL TE(pH 8.0),4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.3.2 Exendin4 cDNA的T載體克隆和序列測定 將PCR產(chǎn)物連接到線性克隆載體pGEM Teasy中,轉(zhuǎn)化Top10受體菌,氨基芐青霉素篩選陽性克隆,堿裂解法小量提取質(zhì)粒,限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ酶切圖譜鑒定。連接反應(yīng)體系如下:①用T4 DNA連接酶連接質(zhì)粒pGEM-Teasy和PCR產(chǎn)物,10 μL 反應(yīng)體積中加入 1 μL(50 mg/L)載體 DNA,3 μL(0.5 g/L) PCR 產(chǎn)物,5 μL 2×T4 DNA 連接酶緩沖液,60℃水浴 5 min,冰浴 2 min,再加入 1 μL(3 U/μL) T4 DNA 連接酶,4℃水浴過夜。②用CaCl2法制備感受態(tài)大腸桿菌DH5α。③連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞,并將轉(zhuǎn)化菌在表面涂有X-gal和IPTG的瓊脂平板(Amp+)上進(jìn)行培養(yǎng)。④挑選單個白色菌落,接種于10 mL LB培養(yǎng)液,37℃振搖培養(yǎng)16 h。⑤用堿裂解法提質(zhì)粒,限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ酶切分析法篩選陽性克隆,篩選到的重組子命名為pGEM-T/Exn-4。

    1.3.3 核苷酸序列分析克隆基因序列 鑒定后的陽性重組質(zhì)粒DNA,用T7啟動子和SP6啟動子作為雙向測序引物,雙脫氧末端終止法測定克隆基因序列。

    2 結(jié)果

    2.1 目的基因Exendin-4 cDNA PCR結(jié)果

    以互為模板的引物進(jìn)行PCR,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物,所得產(chǎn)物與PCR Marker比較,在約136 bp處得到一條單一清晰的條帶,與目的片段預(yù)期大小一致。見圖1。

    2.2 重組質(zhì)粒pGEM-T/Exn-4酶切鑒定

    構(gòu)建的重組質(zhì)粒命名為pGEM-T/Exn-4,大小為3015+136 bp。經(jīng)EcoRⅠ酶切后,瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果可見136 bp的目的片段,與理論值相符,說明Exendin-4已重組于pGEM-Teasy內(nèi)。見圖2。

    2.3 Exendin-4的基因克隆測序結(jié)果

    Exendin-4 cDNA測序結(jié)果與數(shù)據(jù)庫序列經(jīng)Blast比較完全一致。見圖3。

    3 討論

    GLP-1不僅具有降糖作用,還可以減輕體重、改善血脂,達(dá)到直接或間接的心血管保護(hù)效應(yīng)[6],但GLP-1分泌后很快被二肽基肽酶Ⅳ(dipeptidyl peptidaseⅣ,DPP-Ⅳ)降解,體內(nèi)半衰期僅為2 min左右,很難應(yīng)用于臨床[7]。Exendin-4是從美國西南部大毒蜥唾液中分泌的天然腸促胰島素擬似物,具有與GLP-1相似的促進(jìn)胰島素分泌功能,其生物活性比GLP-1高5000倍左右,且DPP-Ⅳ對Exendin-4酶解作用弱,因此,Exendin-4被認(rèn)為是理想的治療2型糖尿病的新型藥物。人工合成的Exendin-4(Exenatide,商品名為Byetta)是首個獲準(zhǔn)上市的腸促胰島素擬似物[8-9]。然而,天然Exendin-4的提取成本高,難以滿足臨床應(yīng)用需要。由于Exendin-4是一個只有39個氨基酸的短肽,體內(nèi)半衰期短,穩(wěn)定性差,因此,限制其在臨床應(yīng)用。用基因工程方法直接生產(chǎn)Exendin-4,表達(dá)水平低且容易降解,與載體蛋白融合表達(dá)也存在產(chǎn)量低、分離純化困難等問題。為解決這一難題,本實驗擬將Exendin-4 cDNA導(dǎo)入到分泌表達(dá)生物活性肽的專用載體,分泌表達(dá)目的蛋白Exendin-4,既可保證重組蛋白的活性又可避免原核表達(dá)高昂的生產(chǎn)成本。

    表1 P1、P2、P3、P4 引物序列

    重疊延伸PCR技術(shù)(gene splicing by overlap extension PCR,SOE-PCR)是采用具有互補(bǔ)末端的引物,使PCR產(chǎn)物形成了重疊鏈,從而在隨后的擴(kuò)增反應(yīng)中通過重疊鏈的延伸,將不同來源的擴(kuò)增片段重疊拼接起來[10]。重疊延伸PCR在基因的定點(diǎn)突變、融合基因的構(gòu)建、長片段基因的合成、基因敲除以及目的基因的擴(kuò)增等方面有其廣泛而獨(dú)特的應(yīng)用。此技術(shù)利用PCR技術(shù)能夠在體外進(jìn)行有效的基因重組,技術(shù)成功的關(guān)鍵是重疊互補(bǔ)引物的設(shè)計。本研究依據(jù)美國專利檢索到Exendin-4為39aa,序列如下:hgegtftsdl skqmeeeavr lfiewlkngg pssgappps。使用DNAsis軟件分析Exendin-4的ORF和它的編碼子,截取編碼39肽的cDNA,編輯完整的Exendin-4表達(dá)盒并使用DNAsis軟件分析。由于Exendin-4是從美國西南部大毒蜥唾液中分泌的物質(zhì),沒有現(xiàn)成的模板行PCR擴(kuò)增,因此本實驗利用重疊PCR技術(shù)擴(kuò)增出Exendin-4目的基因,并成功構(gòu)建了Exendin-4重組載體,用T7啟動子和SP6啟動子脫氧末端終止法測定了克隆基因序列,DNA序列測定的結(jié)果與Gen-Bank提供的已知序列比較完全一致,為進(jìn)一步構(gòu)建重組質(zhì)粒分泌表達(dá)Exendin-4蛋白奠定了實驗基礎(chǔ)。本文方法簡單可行,其結(jié)果將為利用基因工程的方法大量生產(chǎn)和純化高純度的Exendin-4提供良好基礎(chǔ)。

    [1]Nathan DM,Buse JB,Davidsen MB,et al.Medical management of hyperglycemia in type 2 diabetes:a consensus algorithm for the initiation and adjustment of therapy:a consensus statement of the American Diabe tes Association and the European Association for the study of Diabetes[J].Diabetes Care,2009,32:193-203.

    [2]Parkes DG,Mace KF,Trautmann ME.Discovery and development of exenatide:the first antidiabetic agent to leverage the multiple benefits of the incretin hormone,GLP-1 [J].Expert Opin Drug Discov,2013,8(2):219-244

    [3]Goke R,F(xiàn)ehmann HC,Linn T,et al.Exendin-4 is a high potency agonist and truncated exendin-(9-39)-amide an antagonist at the glucagon-like peptide 1-(7-36)-amide receptor of insulin secreting beta-cells[J].J Biol Chem,1993,268(26):19650-19655.

    [4]Niclsen LL,Young AA,Parkes DG.Pharmacology of exenatide(synthetic exendin-4):a potential therapeutic for improved glycemic control of type 2 diabetes[J].Regul Pept,2004,117(2):77-88.

    [5]Sambrook J,F(xiàn)ritsch EF,Maniatis T.Molecular cloning: a laboratory manual[M].北京:科學(xué)出版社,1999:34-66,237-325.

    [6]劉琳,嚴(yán)宗遜.胰高血糖素樣肽-1對心血管系統(tǒng)的保護(hù)效應(yīng)[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報,2011,8(21):5-7.

    [7]呂曉川,王偉夫.二肽基肽酶Ⅳ抑制劑治療2型糖尿病的臨床研究進(jìn)展[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報,2008,5(29):21-22.

    [8]Guerci B,Martin CS.Exenatide:its position in the treatment of type 2 diabetes[J].Ann Endocrinol(Paris),2008,69(3):201-209.

    [9]Defrono RA,Triplitt C,Qu Y,et al.Effects of Exenatide plus rosiglitazone on beta cell function and insulin sensitivity with type 2 diabetes on metformin[J].Diabetes Care,2010,33(5):951-957.

    [10]Horton RM,Pulien JK,Pease IR,et al.Site-directed mutagenesis by overlap extension using the polymerase chain reaction [J].Gene,1989,77(1):51-59.

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