氯睪酮人工抗原的合成與鑒定

王方明,鄒小娟,程亮,姜金慶

（1.新鄉(xiāng)市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所,河南新鄉(xiāng)453000；2.河南科技學(xué)院,河南新鄉(xiāng)453003）

氯睪酮（clostebol,CLO）又名氯司替勃,是一種蛋白同化激素甾體藥物,具有蛋白同化激素活性,能增加畜禽瘦肉增長(zhǎng),降低脂肪貯積能力,進(jìn)而提高飼料轉(zhuǎn)化能力和瘦肉生產(chǎn)率,19世紀(jì)50年代以后在畜禽養(yǎng)殖領(lǐng)域曾被大量使用[1].體育運(yùn)動(dòng)員服用氯睪酮及其代謝物后,可提高體內(nèi)雄性激素荷爾蒙的含量,進(jìn)而在比賽中獲得不正當(dāng)?shù)母?jìng)技成績(jī)[2].19世紀(jì)70年代和80年代,一系列食品安全事故的出現(xiàn),使肉制品中激素殘留問(wèn)題和人類(lèi)健康聯(lián)系起來(lái).研究表明,這些蛋白同化雄性激素會(huì)影響人的肝臟功能,損害心血管系統(tǒng),甚至造成生殖系統(tǒng)障礙、內(nèi)分泌機(jī)能功能受損等毒副作用.因此,自1986年開(kāi)始,歐盟委員會(huì)就禁止畜禽育肥時(shí)使用蛋白同化激素類(lèi)藥物,我國(guó)農(nóng)業(yè)部2002年發(fā)布的《食品動(dòng)物禁用的獸藥及其他化合物清單》中也明確規(guī)定,性激素類(lèi)原料藥及其單方、復(fù)方制劑不準(zhǔn)以提高飼料報(bào)酬、促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)為目的而在畜禽生產(chǎn)過(guò)程中使用[3].

目前,國(guó)內(nèi)外尚未有公開(kāi)發(fā)表的穩(wěn)定、可靠的氯睪酮?dú)埩裘庖邔W(xué)檢測(cè)方法.氯睪酮的相對(duì)分子質(zhì)量為322.87,屬于半抗原生物小分子,不能直接刺激動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體,只有與載體蛋白偶聯(lián)后才具有免疫原性.本研究采用碳化二亞胺法（EDC）制備氯睪酮人工抗原,并進(jìn)行性能和質(zhì)量鑒定,為免疫學(xué)檢測(cè)方法的建立和研制氯睪酮?dú)埩鬍LISA試劑盒奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

氯睪酮（CLO）標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自德國(guó)Dr公司；弗氏完全佐劑（FCA）、弗氏不完全佐劑（FIA）、碳化二亞胺（EDC）為Pierce產(chǎn)品；琥珀酸酐、牛血清白蛋白（BSA）、雞卵清蛋白（OVA）為Sigma公司產(chǎn)品；N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）購(gòu)自日本株式會(huì)社；羊抗鼠酶標(biāo)二抗（GaMIgG-HRP）購(gòu)自華美生物工程有限公司；透析袋（8000-14000）為Solarbio產(chǎn)品；96孔聚乙烯酶標(biāo)板購(gòu)自海門(mén)博陽(yáng)實(shí)驗(yàn)器材廠；四甲基聯(lián)苯胺（TMB）、非那西丁、過(guò)氧化脲等為Sigma產(chǎn)品.其他所有試劑和溶質(zhì)均為分析純,特殊說(shuō)明除外.

1.2 儀器與設(shè)備

Multiskan MK3酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；DU800核酸蛋白分析儀購(gòu)自美國(guó)Beckman-Coulter公司；TENSOR27紅外光譜儀為德國(guó)BRUKER公司產(chǎn)品；SZ-97自動(dòng)三重蒸餾水器購(gòu)自上海雅榮生化儀器有限公司；eLINE微量移液器為芬蘭百得公司產(chǎn)品.

1.3 人工抗原的合成

[4],采用優(yōu)化的EDC兩步法合成氯睪酮（CLO）人工抗原（見(jiàn)圖1）.用電子天平準(zhǔn)確稱(chēng)取CLO 58 mg溶于3 mL無(wú)水吡啶,充分溶解后加入90 mg琥珀酸酐,室溫條件下,避光振蕩反應(yīng)24 h.然后用氮吹儀吹干吡啶,制得淡黃色油脂狀化合物.將脂狀物用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的NaHCO3溶液溶解,乙醚洗滌,再用H2SO4酸化后離心.棄上清液,殘留物用無(wú)水硫酸鈉干燥,將溶劑揮發(fā)干凈后,得到淡黃色固體狀物,即為氯睪酮琥珀酸酯.將40 mg氯睪酮琥珀酸酯用3 mLN,N-二甲基甲酰胺（DMF）溶解后,加入38 mg EDC和12 mg NHS,37℃條件下避光,搖床振蕩反應(yīng)24 h.反應(yīng)結(jié)束后離心,取上清液逐滴加入到5 mL含66 mg BSA（或40 mg OVA）的磷酸鹽緩沖液（PBS）中,轉(zhuǎn)子攪拌反應(yīng)6 h.反應(yīng)完成后,將液體裝入透析袋,先用蒸餾水透析3 d,再用PBS透析3 d.結(jié)束后,凍干保存制備的氯睪酮免疫原（CLO-BSA）及氯睪酮檢測(cè)抗原（CLO-OVA）.

1.4 人工抗原的鑒定

1.4.1 紫外掃描鑒定 用含8%甲醇的PBS緩沖液配制CLO與BSA標(biāo)準(zhǔn)品.接著取0.5 mg的CLO-BSA免疫原溶于PBS中,用紫外分光光度法測(cè)定BSA的濃度和特征吸收峰,并調(diào)節(jié)CLO-BSA免疫原的蛋白質(zhì)濃度與BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液一致,在220—400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外全掃描,根據(jù)吸收峰的變化特點(diǎn)判斷偶聯(lián)是否成功,并計(jì)算蛋白質(zhì)與CLO的分子結(jié)合比[5-6].

1.4.2 紅外光譜法鑒定 徹底透析后的CLO-BSA免疫原、BSA、CLO半抗原作紅外光譜檢測(cè).取樣品2 mg,加入干燥的KBr置于瑪瑙乳缽中,在紅外燈照射下研磨、混勻,裝壓片模具,在8 000 N壓力下加壓10 min,制得厚度1 mm的透明KBr樣品晶片,上機(jī)檢測(cè)[7].

1.4.3動(dòng)物免疫試驗(yàn) 選擇6～8周齡雌性Balb/C小鼠5只,進(jìn)行人工抗原免疫試驗(yàn).免疫劑量為60 μg/只,注射體積為0.2 mL,采用頸背部皮下多點(diǎn)注射法.首免使用PBS緩沖液稀釋CLO-BSA免疫原,然后與等體積的FCA完全乳化；以后每隔3周注射1次,乳化劑更換為FIA,總計(jì)強(qiáng)化免疫4次.每次免疫后10 d,小鼠尾部采血分離血清,用間接ELISA和間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA（icELISA）進(jìn)行抗體效價(jià)和靈敏度測(cè)定[8].

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外掃描鑒定結(jié)果

氯睪酮半抗原、載體蛋白BSA及免疫原CLO-BSA的紫外光譜見(jiàn)圖2.

由圖2可知,CLO半抗原在285 nm和345 nm處有典型吸收,BSA在275 nm及280 nm處有最大吸收峰,而CLO-BSA免疫原的最大吸收峰則位于274 nm及278 nm處,這說(shuō)明氯睪酮人工抗原偶聯(lián)物最大吸收峰左移,并與其前體物質(zhì)有不同的紫外吸收特征,初步表明偶聯(lián)成功.根據(jù)公式計(jì)算出BSA與CLO的分子結(jié)合比為16.5∶1.

2.2 人工抗原的紅外光譜分析

氯睪酮標(biāo)準(zhǔn)品、BSA和免疫原紅外鑒定結(jié)果見(jiàn)圖3.

由圖3可知,BSA和CLO-BSA免疫原在2 500～3 200 cm-1和1 660～1 500 cm-1的區(qū)域內(nèi)具有相似的吸收峰,這是BSA中氨基酸的特征峰,說(shuō)明合成的免疫原中含有BSA.氯睪酮標(biāo)準(zhǔn)品在3 300 cm-1處有一個(gè)強(qiáng)吸收峰,這是羥基的特征峰,而人工抗原CLO-BSA無(wú)此吸收峰,表明半抗原衍生化成功.同時(shí),CLO-BSA和CLO標(biāo)準(zhǔn)品在2 800 cm-1有相似的吸收峰,而B(niǎo)SA在此處無(wú)吸收峰,證明CLO-BSA中含有CLO.據(jù)此確定CLO-BSA人工抗原偶聯(lián)成功.

2.3 動(dòng)物免疫試驗(yàn)結(jié)果

CLO-BSA免疫Balb/C小鼠,經(jīng)4次加強(qiáng)免疫后,利用CLO-OVA做包被抗原,進(jìn)行間接ELISA測(cè)定小鼠抗血清效價(jià),結(jié)果見(jiàn)表1.

表1 間接ELISA效價(jià)檢測(cè)結(jié)果Tab.1 Titer results by indirect ELISA

由表1可知,3只小鼠均獲得了較高的抗體效價(jià),效價(jià)分別為1.6×104、3.2×104和1.6×104,其中最好的血清抗體為2號(hào)小鼠.采用不同濃度的CLO標(biāo)準(zhǔn)品作競(jìng)爭(zhēng)抑制物,對(duì)2號(hào)小鼠抗血清進(jìn)行間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA試驗(yàn),結(jié)果見(jiàn)表2.

表2 間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)抗體靈敏度Tab.2 Sensitivity ofantibody by indirect competitive ELISA

由表2可知,隨著CLO標(biāo)準(zhǔn)品濃度的增加,ELISA顯色效果逐漸降低,證實(shí)CLO能阻斷上述反應(yīng)的發(fā)生,表明小鼠抗血清中含有針對(duì)CLO的特異性抗體.2號(hào)小鼠血清抗體靈敏度為64 ng/mL.

3 結(jié)論

本研究采用EDC兩步法成功合成了氯睪酮人工抗原,免疫Balb/C小鼠制備出高效價(jià)的抗血清.抗體的親和力強(qiáng)、靈敏度高,可滿(mǎn)足動(dòng)物源性食品中氯睪酮檢測(cè)的監(jiān)管需求.氯睪酮人工抗原的合成為建立動(dòng)物源食品中CLO免疫學(xué)檢測(cè)方法及開(kāi)發(fā)ELISA快速檢測(cè)試劑盒奠定了基礎(chǔ).

參考文獻(xiàn)：

[1]姜金慶,張海棠,王自良,等.19-去甲類(lèi)固醇激素檢測(cè)方法研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通報(bào),2010,12（4）：93-98.

[2]Masayuki Y,Sugako A,Masahiko K,et al.Simultaneous doping analysis ofmain urinary metabolites ofanabolic steroids in horse by ion-trap gas chrtography-tandem mass spectrometry[J].Analytical Sciences,2008,24（9）：1199-1205.

[3]Jiang J Q,Zhang H T,Li G L,et al.Establishment and optimization of monoclonal antibody-based heterologous dcELISA for 19-nortestosterone residue in bovine edible tissue[J].Journal of Food Science,2012,77（4）：63-69.

[4]李超英,姜金慶,李鳳云,等.睪酮多克隆抗體的制備及免疫學(xué)檢測(cè)方法的建立[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2012,51（16）：3554-3556.

[5]李偉嶺,岳永波,李金明,等.沃尼妙林人工抗原的合成與鑒定[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志,2012,48（2）：78-80.

[6]袁利鵬,孫遠(yuǎn)明,雷紅濤,等.沙丁胺醇人工抗原合成及鑒定研究[J].食品科學(xué),2006,27（12）：276-280.

[7]王自良,王建華,張海棠,等.苯巴比妥多克隆抗體的制備及其免疫學(xué)特性鑒定[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志,2006,42（5）：12-14.

[8]包曉瑋,韓海霞,景偉文,等.四環(huán)素全抗原的合成及多克隆抗體的制備[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué),2010（5）：171-173.