哈茨木霉VT9-3r和枯草芽孢桿菌VT4-1x對(duì)3株馬鈴薯致病菌的抑制作用效果

潘瀟涵 常瑞雪 慕康國(guó) 陳 清

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境學(xué)院，北京 100193；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，北京 100193；3.農(nóng)田土壤污染防控與修復(fù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193)

馬鈴薯是我國(guó)的第四大糧食作物，在我國(guó)的農(nóng)業(yè)種植結(jié)構(gòu)調(diào)整、保障糧食安全生產(chǎn)、促進(jìn)農(nóng)民增收等方面具有重要的作用。近年來(lái)隨著馬鈴薯種植面積逐漸擴(kuò)大，重茬種植較為普遍，由此帶來(lái)的連作障礙和土傳病害問題，影響了馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的生產(chǎn)效益。防治馬鈴薯土傳病害，多采用化學(xué)農(nóng)藥防治結(jié)合農(nóng)藝措施調(diào)控，這些措施雖能在一定程度上抑制病害的產(chǎn)生與傳播，但由于施用不當(dāng)引起農(nóng)藥殘留從而污染環(huán)境，因此亟需尋求綠色安全的作物病害防治方法[1]。

通過向土壤中接種生防菌劑進(jìn)行生物防治，可以抑制病原菌繁殖，從而預(yù)防或減輕土傳病害[2]。已報(bào)道的生防菌種類繁多、拮抗機(jī)制多樣，防治效果也參差不齊[3]。已有研究表明木霉的主要抗病機(jī)制為：分泌細(xì)胞壁降解酶和抗生素破壞寄主真菌的正常生長(zhǎng)，同時(shí)通過靶向性纏繞菌絲和寄主真菌競(jìng)爭(zhēng)空間和營(yíng)養(yǎng)，從而達(dá)到對(duì)其他病原菌的拮抗作用[4-5]。芽孢桿菌則能分泌多種具有生防功能的酶和抗生素，同時(shí)因其能產(chǎn)生耐熱抗旱、耐紫外線和抗生素的內(nèi)生孢子，并且生長(zhǎng)速度快、營(yíng)養(yǎng)需求簡(jiǎn)單，非常易于定殖，是一種能直接應(yīng)用于生產(chǎn)的理想生防菌[6-7]。

目前關(guān)于馬鈴薯病害的研究大多只針對(duì)某種單一病原菌來(lái)展開，然而，自然生產(chǎn)環(huán)境下，馬鈴薯發(fā)病通常是受到多種植物病原菌共同侵染的結(jié)果。立枯絲核菌Rhizoctoniasolani、尖孢鐮刀菌Fusariumoxysporum和茄鏈格孢菌Alternariasolani侵染遍及世界馬鈴薯產(chǎn)區(qū)，且發(fā)病部位主要是塊莖和地下莖，較難防治[8-10]。因此本研究擬以上述3 種病原真菌為靶標(biāo)菌株，以其研究廣泛、生防效果較好的哈茨木霉和枯草芽孢桿菌為研究對(duì)象，探究哈茨木霉菌、枯草芽孢桿菌及其次生代謝產(chǎn)物對(duì)這3 株馬鈴薯土傳病原菌的拮抗作用。R.solani導(dǎo)致的馬鈴薯黑痣病，在馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)內(nèi)蒙古等地發(fā)病普遍[11]，因該菌可以微菌核的形態(tài)潛伏于塊莖和土壤中，經(jīng)由帶病種薯和土壤2種方式進(jìn)行傳播，防治難度進(jìn)一步加大[12]，因此通過R.solani盆栽試驗(yàn)判斷2株生防菌發(fā)酵液及其混合施用對(duì)該病害的防治效果，為進(jìn)一步合理利用微生物資源、開發(fā)多功能菌肥提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌種

供試病原菌為立枯絲核菌R.solani、尖孢鐮刀菌F.oxysporum和茄鏈格孢菌A.solani，分別分離自馬鈴薯真菌病害，由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院吳學(xué)宏教授課題組提供。

供試生防菌為哈茨木霉菌TrichodermaharzianumVT9-3r和枯草芽孢桿菌BacillussubtilisVT4-1x，由北京沃土天地生物科技有限公司提供。

1.2 平板對(duì)峙培養(yǎng)與掃描電鏡觀察

平板對(duì)峙培養(yǎng)：采用對(duì)峙培養(yǎng)法測(cè)定2株生防菌對(duì)供試病原菌菌絲生長(zhǎng)的拮抗作用。用打孔器將生長(zhǎng)良好的哈茨木霉、枯草芽孢桿菌和病原菌分別制成直徑4 mm的菌碟，并將生防菌和病原菌兩兩對(duì)峙，反貼接種于PDA培養(yǎng)基相對(duì)2側(cè)，以單獨(dú)接種病原菌為對(duì)照，每組重復(fù)3次，28 ℃恒溫倒置培養(yǎng)3～5 d，觀察生防菌株拮抗病原菌菌落以及抑菌帶的形成情況。

掃描電鏡觀察：從各對(duì)峙培養(yǎng)的平板中，切取分別與哈茨木霉菌和枯草芽孢桿菌相接觸的立枯絲核菌和尖孢鐮刀菌菌絲的方形PDA瓊脂片(6 mm×6 mm)，經(jīng)戊二醛固定2 h，磷酸緩沖液漂洗，再經(jīng)鋨酸固定2 h，磷酸緩沖液漂洗后，使用乙醇進(jìn)行梯度脫水，浸泡包埋、聚合和切片CO2臨界點(diǎn)干燥、噴金，在掃描電鏡下觀察病原菌菌絲生長(zhǎng)及與生防菌相互作用的情況，以單獨(dú)培養(yǎng)的病原菌菌絲制片為對(duì)照，進(jìn)行觀察對(duì)比。

1.3 哈茨木霉VT9-3r和枯草芽孢桿菌VT4-1x發(fā)酵液對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響

挑取已活化的哈茨木霉和枯草芽孢桿菌菌株，分別接入盛有適量PDB培養(yǎng)基的三角瓶中，哈茨木霉置于28 ℃、180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)5 d、枯草芽孢桿菌同樣條件下振蕩培養(yǎng)2 d后，各自得到其菌株發(fā)酵液。取部分發(fā)酵液于10 000 r/min 離心 30 min 收集上清液，上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾即為無(wú)菌代謝液。將發(fā)酵液和代謝液均置于4 ℃冰箱保存，待用。

為進(jìn)一步研究枯草芽孢桿菌與哈茨木霉的抑菌機(jī)制，探究其代謝產(chǎn)物的抑菌性能，采用含毒介質(zhì)培養(yǎng)法測(cè)定2 株生防菌的代謝液對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響。將代謝液與冷卻至約45 ℃的PDA培養(yǎng)基混勻，倒板制成體積分?jǐn)?shù)1%、5%、10%、20%、25%的平板。在平板中央置入直徑4 mm的供試病原菌菌塊。28 ℃下恒溫倒置培養(yǎng)3～5 d，觀察并計(jì)算生長(zhǎng)抑制率。

1.4 哈茨木霉VT9-3r和枯草芽孢桿菌VT4-1x發(fā)酵液對(duì)馬鈴薯黑痣病的防效

1.4.1供試作物及預(yù)處理

供試作物為馬鈴薯，品種為費(fèi)烏瑞它，用0.1%的NaClO溶液消毒無(wú)病種薯，經(jīng)無(wú)菌水清洗后置于暗室使其萌發(fā)2 周，挑選長(zhǎng)約5 cm、飽滿均勻的幼芽進(jìn)行抗病性盆栽試驗(yàn)。

1.4.2供試土壤與滅菌處理

供試土壤采自北京市房山，土壤基本理化性狀為：pH 7.8，EC 166 μs/cm，有機(jī)質(zhì) 9.70 g/kg，全氮 0.85 g/kg，速效磷 231 mg/kg，速效鉀 246 mg/kg。將土壤曬干、過篩，與蛭石1∶1(V/V)混勻，160 ℃下干熱滅菌6 h，備用。

1.4.3盆栽土壤接種

將滅菌的小麥粒散落于培養(yǎng)3 d的立枯絲核菌菌落上方，繼續(xù)培養(yǎng)5～8 d，作為接種體。選用一次性塑料盆上開口下封底，底部鋪雙層紗布2 層，每盆裝土約2.5 kg。馬鈴薯薯塊芽朝上置于約2 cm厚的無(wú)菌土上，然后用無(wú)菌土覆蓋并超出芽約1 cm厚，在馬鈴薯幼芽正上方的土層上擺放1 粒接種體，最后以無(wú)菌土覆蓋。試驗(yàn)設(shè)5 個(gè)處理，具體如下：

空白對(duì)照組(CK)，不接種任何菌；

馬鈴薯黑痣病組(R.solani，RS)，滅菌馬鈴薯根際土壤接種馬鈴薯致病菌立枯絲核菌；

枯草芽孢桿菌組 (B.subtilis，BS)，滅菌馬鈴薯根際土壤接種立枯絲核菌，同時(shí)以枯草芽孢桿菌發(fā)酵液(活菌數(shù)為2×107CFU/mL)澆灌根(芽)處理；

哈茨木霉菌組 (T.harzianum，TH)，接種立枯絲核菌，同時(shí)以哈茨木霉菌發(fā)酵液(分生孢子數(shù)為106CFU/mL)澆灌根(芽)處理；

復(fù)合菌劑組 (BS+TH)：接種立枯絲核菌，同時(shí)以上述生防菌發(fā)酵液1∶1(V/V)的復(fù)合菌劑澆灌根(芽)處理。

每個(gè)處理4 個(gè)重復(fù)，每盆2 株，放置20～30 ℃ 的溫室中。定植當(dāng)天即澆灌上述各處理的生防菌發(fā)酵液100 mL(復(fù)合菌劑總體積100 mL)，并于播種后15、30 d進(jìn)行追施，將各處理的發(fā)酵液澆于植株的根部，每盆每次100 mL。根據(jù)盆栽中土壤的含水量平均5 d澆一次水，40 d之后挖出馬鈴薯植株。

1.5 指標(biāo)測(cè)定

采用十字交叉法分別測(cè)量處理病原菌和對(duì)照病原菌的菌落直徑。病原菌生長(zhǎng)抑制率RI,計(jì)算公式如下：

RI=[(對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對(duì)照菌落直徑-菌餅直徑)]×100%

根據(jù)馬鈴薯黑痣病病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，統(tǒng)計(jì)盆栽馬鈴薯病情指數(shù)。計(jì)算公式如下：

病情指數(shù)=[(各級(jí)病株數(shù)×各級(jí)代表值)/(調(diào)查總株數(shù)×最高級(jí)代表值)]×100%

防效=[(對(duì)照病情指數(shù)-處理病情指數(shù))/對(duì)照病情指數(shù)]×100%

病害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0 級(jí)，健康；1 級(jí)，潰瘍面積<10%；2 級(jí)，潰瘍面積10%～50%；3 級(jí)，潰瘍面積>50%；4 級(jí)，植株死亡。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用 Microsoft Excel 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及作圖，采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 哈茨木霉VT9-3r和枯草芽孢桿菌VT4-1x對(duì)3 株病原菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用

哈茨木霉VT9-3r和枯草芽孢桿菌VT4-1x對(duì)3 株病原菌抑制作用的結(jié)果見表1和圖1。哈茨木霉VT9-3r菌落生長(zhǎng)速度快，對(duì)峙培養(yǎng)2 d迅速覆蓋平板面積2/3以上；3 d后3 株病原菌菌落被哈茨木霉菌包圍，菌落間對(duì)峙局面隨即形成，病原菌菌落幾乎不再生長(zhǎng)，此時(shí)，哈茨木霉VT9-3r對(duì)尖孢鐮刀菌的抑制率最強(qiáng)，達(dá)到64.0%(圖1)，對(duì)立枯絲核菌和茄鏈格孢菌的抑制率分別為63.6%和60.2%(表1)。繼續(xù)培養(yǎng)后，對(duì)立枯絲核菌和茄鏈格孢菌，哈茨木霉菌部分分布于病原菌菌落之上，不完全覆蓋其菌落；對(duì)尖孢鐮刀菌，哈茨木霉菌可繼續(xù)向前生長(zhǎng)，并部分覆蓋于尖孢鐮刀菌菌落之上，溶解部分菌絲，最終并沒有完全覆蓋病原菌菌落(圖1)。上述結(jié)果說(shuō)明在對(duì)峙培養(yǎng)中，哈茨木霉菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)和空間的競(jìng)爭(zhēng)能力優(yōu)于供試病原菌。

枯草芽孢桿菌通過分泌代謝物質(zhì)對(duì)各供試病原菌均產(chǎn)生抑制作用，病原菌與枯草芽孢桿菌相接觸的部位產(chǎn)生了明顯的抑菌帶(圖1)?？莶菅挎邨U菌對(duì)3 種病原菌的抑制率為立枯絲核菌>尖孢鐮刀菌>茄鏈格孢菌，分別為55.4%、51.3%和48.1%(表1)。同時(shí)觀察到枯草芽孢桿菌菌株在PDA平板上形成的菌落很大，該菌株不僅可以分泌抗菌物質(zhì)對(duì)病原菌形成抑制作用，而且其生長(zhǎng)繁殖能力強(qiáng)，對(duì)病原菌也有一定程度的競(jìng)爭(zhēng)作用(圖1)。

表1 枯草芽孢桿菌和哈茨木霉對(duì)病原菌生長(zhǎng)的抑制作用

(a)、(b)和(c)分別為哈茨術(shù)霉菌與立枯絲核菌、尖孢鐮刀菌、茄鏈格孢菌對(duì)峙培養(yǎng)情況；(d)、(e)和(f)：分別表示枯草芽孢桿菌與立枯絲核菌、尖孢鐮刀菌、茄鏈格孢菌對(duì)峙培養(yǎng)情況。

2.2 哈茨木霉VT9-3r和枯草芽孢桿菌VT4-1x代謝液對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用

哈茨木霉VT9-3r菌株無(wú)菌代謝液對(duì)3 株病原菌均不存在明顯的抑制作用。該菌株代謝液對(duì)立枯絲核菌的抑制效應(yīng)最強(qiáng)，含無(wú)菌發(fā)酵液25%的平板對(duì)立枯絲核菌的抑制率為26.2%，因此該菌株對(duì)病原菌的抑制作用主要來(lái)自于其活菌菌體的競(jìng)爭(zhēng)作用，而非菌體代謝液作用。

枯草芽孢桿菌VT4-1x對(duì)3 株病原菌抑制作用的結(jié)果見圖2：不同濃度的枯草芽孢桿菌代謝液對(duì)馬鈴薯致病菌均產(chǎn)生抑制作用，且對(duì)于不同菌株的抑制率在不同濃度間存在顯著差異。在試驗(yàn)設(shè)置濃度范圍內(nèi)，隨著代謝產(chǎn)物濃度升高，病原菌菌落直徑減小，生長(zhǎng)速率減慢?？莶菅挎邨U菌粗提代謝物對(duì)茄鏈格孢菌的抑制效果最強(qiáng)，代謝液體積分?jǐn)?shù)為20%時(shí)，對(duì)茄鏈格孢菌、立枯絲核菌和尖孢鐮刀菌的抑制率分別為69.4%、62.9%和54.0%(圖2(a))。觀察病原菌菌落生長(zhǎng)發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照相比，枯草芽孢桿菌代謝粗提物顯著抑制了病原菌在培養(yǎng)基上的擴(kuò)展，削弱了其色素等代謝物質(zhì)的分泌，減輕了立枯絲核菌菌落表面微菌核的形成(圖2(b))。

不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。

2.3 哈茨木霉VT9-3r和枯草芽孢桿菌VT4-1x對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)及形態(tài)影響觀察

哈茨木霉VT9-3r菌株對(duì)立枯絲核菌菌絲生長(zhǎng)影響的電鏡觀察結(jié)果見圖3：正常生長(zhǎng)的立枯絲核菌菌落密集，菌絲飽滿、表面光滑且生長(zhǎng)良好(圖3(a))。與哈茨木霉VT9-3r對(duì)峙培養(yǎng)，木霉菌大量覆蓋于病原菌表面圖3((b))，菌絲緊貼立枯絲核菌菌絲生長(zhǎng)(圖3(c))，并在其菌絲上產(chǎn)生分支，緊緊纏繞住該菌絲，致使病原菌原生質(zhì)泄露、菌絲皺縮變形(圖3(d))，同時(shí)木霉菌絲產(chǎn)生吸器伸入到立枯絲核菌菌絲內(nèi)，對(duì)立枯絲核菌產(chǎn)生寄生作用(圖3(e))，抑制病原菌生長(zhǎng)?？莶菅挎邨U菌VT4-1x菌株對(duì)立枯絲核菌菌絲生長(zhǎng)影響的電鏡觀察結(jié)果見圖4：枯草芽孢桿菌VT4-1x分泌次生代謝物質(zhì)，使立枯絲核菌菌落稀疏，菌絲變形，出現(xiàn)不規(guī)則褶皺縊縮、扭曲、折疊，原生質(zhì)泄露，菌絲相互纏繞的現(xiàn)象(圖4(b))。同時(shí)，次生代謝物質(zhì)使立枯絲核菌牙管尖端發(fā)生膨大或扭曲變形、原生質(zhì)泄露現(xiàn)象(圖4(c))。

哈茨木霉VT9-3r和枯草芽孢桿菌VT4-1x菌株對(duì)尖孢鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)影響的電鏡觀察結(jié)果見圖5：正常生長(zhǎng)的尖孢鐮刀菌菌落密集，菌絲均勻呈長(zhǎng)直狀，表面光滑且生長(zhǎng)良好。受哈茨木霉菌抑制的尖孢鐮刀菌菌絲發(fā)生了畸變，主要表現(xiàn)為菌絲體相互纏繞、穿插、折疊變形、粗細(xì)不均，甚至出現(xiàn)了菌絲斷裂溶解的現(xiàn)象(圖5(b))。尖孢鐮刀菌與枯草芽孢桿菌對(duì)峙培養(yǎng)，枯草芽孢桿菌分泌次生代謝物質(zhì)，尖孢鐮刀菌菌落稀疏，側(cè)支斷裂，菌絲粗細(xì)不均勻，出現(xiàn)不規(guī)則褶皺縊縮、彎曲、折疊現(xiàn)象，可能受其次生代謝物影響，尖孢鐮刀菌菌絲變得極細(xì)，多個(gè)菌絲融合，黏連或繞纏成一團(tuán)(圖5(c))。

研究中參考Wischmeier等[10]關(guān)于坡長(zhǎng)因子的經(jīng)典算法計(jì)算坡長(zhǎng)因子L值.考慮坡度的不同，對(duì)S因子的求解采用分段計(jì)算[11]，其中，緩坡(坡度<10°)采用McCool公式，陡坡(坡度≥10°)采用Liu等的公式.

(a)單獨(dú)培養(yǎng)作為對(duì)照的立枯絲核菌(550×)。(b)對(duì)峙培養(yǎng)，哈茨木霉菌絲覆蓋于立枯絲核菌(550×)。(c)和(d)哈茨木霉與立枯絲核菌菌絲相互作用(1 900×)。箭頭處表示立枯絲核菌菌絲變形等變化。(e) 哈茨木霉寄生于立枯絲核菌菌絲內(nèi)(3 700×)。

(a)單獨(dú)培養(yǎng)作為對(duì)照的立枯絲核菌(800×)。(b)與枯草芽孢桿菌對(duì)峙，立枯絲核菌菌絲相互纏繞，變形(1 100×)。(c)立枯絲核菌菌絲扭曲變形，原生質(zhì)泄露(1 900×)。

2.5 哈茨木霉VT9-3r和枯草芽孢桿菌VT4-1x菌株發(fā)酵液對(duì)馬鈴薯黑痣病的盆栽防效

盆栽馬鈴薯栽培40 d之后挖出馬鈴薯植株，觀察地下莖部位發(fā)現(xiàn)除空白處理外，各處理均有不同程度的黑痣病癥狀發(fā)生。病原菌處理中出現(xiàn)部分植株死亡或地下莖大面積潰瘍，發(fā)病等級(jí)為2～4 級(jí)。生防菌劑處理中大部分植株生長(zhǎng)良好，發(fā)病等級(jí)在0～1 級(jí)，其中BS+TH 處理的植株抗病性最明顯。復(fù)合菌劑BS+TH處理對(duì)馬鈴薯黑痣病的抑制效果最好，防效達(dá)81.5%，其次為枯草芽孢桿菌處理的防效達(dá)到75.3%，哈茨木霉處理的防效為69.3%。

(a)單獨(dú)培養(yǎng)作為對(duì)照的尖孢鐮刀菌(1 200×)；(b)、(c)，哈茨木霉與尖孢鐮刀菌的對(duì)峙試驗(yàn)，箭頭處表示哈茨木霉與尖孢鐮刀菌菌絲相互作用(4 000×)，使尖孢鐮刀菌菌絲斷裂(6 500×)；(d)、(e)，枯草芽孢桿菌與尖孢鐮刀菌的對(duì)峙試驗(yàn)，箭頭處表示尖孢鐮刀菌的菌絲相互粘連(5 500×)，出現(xiàn)斷裂溶解等現(xiàn)象(1 800×)。

且觀察發(fā)現(xiàn)，病原菌處理的馬鈴薯幼苗長(zhǎng)勢(shì)較弱，病害嚴(yán)重，但是施用生防菌發(fā)酵液的3 個(gè)處理長(zhǎng)勢(shì)較旺，植株粗壯。由表2可知，各處理的病情指數(shù)明顯低于病原菌對(duì)照，且經(jīng)生防菌發(fā)酵液處理過的馬鈴薯幼苗株高和干重較病原菌對(duì)照有明顯的增加，哈茨木霉發(fā)酵液處理馬鈴薯幼苗的株高和干重分別提高26.0%和70.2%；枯草芽孢桿菌發(fā)酵液處理分別提高37.2%和105.2%；復(fù)合菌劑混施處理分別提高10.7%、和66.9%。

表2 枯草芽孢桿菌和哈茨木霉發(fā)酵液處理對(duì)馬鈴薯植株生長(zhǎng)和感病情況的影響

注：RS，馬鈴薯黑痣病組；BS，枯草芽孢桿菌組；TH，哈茨木霉菌組；BS+TH，復(fù)合菌劑組。每列數(shù)字后上標(biāo)相同字母表示在處理間在P<0.01水平上無(wú)顯著差異。

Notes: RS,Rhizoctoniasolanigroup; BS:Bacillussubtilisgroup; TH,Trichodermaharzianumgroup; BS+TH,B.subtilisandT.harzianumgroup.Values followed by the same letters in each column are not significantly different at 0.05 level from each other.

3 討 論

3.1 哈茨木霉菌和枯草芽孢桿菌對(duì)馬鈴薯黑痣病病原菌的抑制作用

已有研究表明哈茨木霉菌寄生于立枯絲核菌細(xì)胞后，會(huì)消解其細(xì)胞質(zhì)或凝結(jié)菌絲原生質(zhì)，最終使菌絲斷解體，菌體死亡[13-14]。本研究哈茨木霉和枯草芽孢桿菌對(duì)立枯絲核菌的對(duì)峙培養(yǎng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：哈茨木霉菌分泌的代謝物質(zhì)對(duì)立枯絲核菌的抑制效果較弱，掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)哈茨木霉菌絲可寄生于立枯絲核菌菌絲體內(nèi)，通過重寄生和競(jìng)爭(zhēng)作用，可達(dá)到抑制病原菌的效果。枯草芽孢桿菌的代謝物質(zhì)抑制了立枯絲核菌菌落表面微菌核的形成，減少了色素等代謝物質(zhì)的分泌，對(duì)防治該病原菌引起的病害也有較大的應(yīng)用潛力。生防菌防病機(jī)制主要有拮抗、競(jìng)爭(zhēng)、重寄生等作用以及誘導(dǎo)植物系統(tǒng)抗性，不同菌株發(fā)揮的作用機(jī)制不同，且受到防控因子、根際理化條件和環(huán)境的影響，差異較大。

曾華蘭[15]研究表明，哈茨木霉對(duì)不同病原菌的識(shí)別、接觸、纏繞、穿透和寄生的機(jī)理比較復(fù)雜。本研究發(fā)現(xiàn)哈茨木霉與3株病原菌的對(duì)峙培養(yǎng)結(jié)果表明該菌株對(duì)3株供試病原菌均有較好的抑制效果，抑制率均達(dá)60%以上，但其代謝液的抑制效果卻不理想。在掃描電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)其與立枯絲核菌和尖孢鐮刀菌的相互作用情況：哈茨木霉菌可通過緊貼、纏繞等方式作用于立枯絲核菌菌絲外部，或寄生于菌絲內(nèi)抑制其生長(zhǎng)，這屬于重寄生現(xiàn)象；對(duì)尖孢鐮刀菌則主要以拮抗、競(jìng)爭(zhēng)機(jī)制為主，使尖孢鐮刀菌菌絲體發(fā)生纏繞、變形等畸變現(xiàn)象。因此，該哈茨木霉菌株對(duì)供試病原菌的抑制主要通過營(yíng)養(yǎng)和空間競(jìng)爭(zhēng)及重寄生作用來(lái)實(shí)現(xiàn)的，且對(duì)不同病原菌主要抑制機(jī)制不同，這與已有研究結(jié)果一致[15]。

枯草芽孢桿菌主要通過分泌次生代謝物質(zhì)抑制病原菌生長(zhǎng)，因此可用于防控絲狀真菌的植物病害。本研究采用的枯草芽孢桿菌菌株對(duì)供試病原菌的對(duì)峙抑菌率為50%左右，高濃度的代謝液對(duì)病原菌的抑制率更是高達(dá)60%～90%，掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)代謝物質(zhì)消解了病原菌的菌絲體，使菌絲發(fā)生斷裂、畸形等現(xiàn)象，為抗生溶菌作用。目前已明確的枯草芽孢桿菌次生代謝產(chǎn)物主要有幾丁質(zhì)酶、蛋白酶等多種酶及抗菌多肽、脂肽類物質(zhì)[16-17]，具有抑菌譜廣、環(huán)境安全等優(yōu)勢(shì)[18]。

3.2 哈茨木霉菌和枯草芽孢桿菌及其協(xié)同作用對(duì)馬鈴薯黑痣病病原菌的抑制作用

李衛(wèi)平等[19]在研究綠色木霉對(duì)蔬菜苗期病害的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，在用木霉處理后，黃瓜葉片濃綠、色深、生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)、苗高顯著增加。喬俊卿等[20]報(bào)道，枯草芽孢桿菌PTS-394菌株灌根番茄后，可以觸發(fā)番茄植株系統(tǒng)性的抗病性，植株防御酶系活性顯著提高，增強(qiáng)植株免疫能力。本研究通過盆栽試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)哈茨木霉VT9-3r和枯草芽孢桿菌VT4-1x菌株發(fā)酵液處理的馬鈴薯幼苗生長(zhǎng)指標(biāo)和生物量均有提高。2株菌不僅直接作用與標(biāo)靶病原菌，而且能夠通過調(diào)節(jié)植物自身的防衛(wèi)和代謝系統(tǒng)產(chǎn)生免疫反應(yīng)，也是生防菌發(fā)揮抗病作用的重要機(jī)制之一。

將2 種不同抑菌機(jī)制的生防菌進(jìn)行混合施用，更易適應(yīng)土壤復(fù)雜的環(huán)境條件，但其生防菌協(xié)同作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究；另一方面，本研究發(fā)現(xiàn)連續(xù)追施生防菌發(fā)酵液有利于促進(jìn)植物生長(zhǎng)，馬鈴薯植株的表觀生長(zhǎng)指標(biāo)和生物量均有明顯提高。

4 結(jié) 論

對(duì)峙培養(yǎng)試驗(yàn)表明：枯草芽孢桿菌通過菌體和代謝物質(zhì)共同作用，顯著抑制了3種土傳病原菌的生長(zhǎng)，室內(nèi)拮抗抑菌率由大到小依次為A.solani(55.4%)>R.solani(51.3%)>F.oxysporum(48.1%)，枯草芽孢桿菌的代謝液也能顯著抑制病原菌生長(zhǎng)，在設(shè)置濃度范圍內(nèi)，抑制率隨濃度升高而增強(qiáng)。哈茨木霉通過營(yíng)養(yǎng)和空間位點(diǎn)的競(jìng)爭(zhēng)強(qiáng)烈抑制病原菌的生長(zhǎng)，抑菌率均達(dá)到60%以上，且抑制率F.oxysporum(64.0%)>R.solani(63.6%)>A.solani(60.2%)，掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，其菌絲可以通過識(shí)別、吸附和纏繞完成對(duì)立枯絲核菌的重寄生作用。

馬鈴薯黑痣病盆栽試驗(yàn)表明：哈茨木霉和枯草芽孢桿菌發(fā)酵液均可促進(jìn)馬鈴薯幼苗生長(zhǎng)，同時(shí)有效抑制馬鈴薯黑痣病的發(fā)生，且施用復(fù)合菌劑的盆栽防效高于2個(gè)單一菌劑的防效，二者配合施用對(duì)馬鈴薯病害防治具有協(xié)同增效的作用。