ω－3不飽和脂肪酸和谷氨酰胺抗壓力性氧化損傷的實(shí)驗(yàn)研究

王艷，高金華，周守鳳，陳慧敏，鄭國榮，刁波

（1.廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院 消化內(nèi)科，湖北 武漢 430070；2.廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院神經(jīng)外科研究所 醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心）

目前許多研究者發(fā)現(xiàn)，氧自由基是引起機(jī)體衰老和疾病的致病因素［1］。自由基損傷所造成的組織氧化應(yīng)激是造成壓瘡的重要原因之一［2］。提高體內(nèi)抗氧化酶活力是消除氧自由基的最佳途徑，尋找一種有效的抗氧化營養(yǎng)物質(zhì)已成為預(yù)防老年壓瘡的研究熱點(diǎn)。ω－3不飽和脂肪酸（polyunsaturated fattyacids，ω－3PUFAs）和谷氨酰胺（glutalnin，Gln）是近年來研究較多且獲得公認(rèn)的有效的免疫調(diào)理營養(yǎng)素，不但可以在體內(nèi)氧化供能，而且還可以通過穩(wěn)定生物膜減少氧自由基的攻擊，同時(shí)可以促進(jìn)蛋白合成和細(xì)胞生長(zhǎng)，具有組織修復(fù)及增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的作用［3］。本研究通過復(fù)制老年大鼠壓瘡模型，觀察ω－3PUFAs和Gln的抗壓力性氧化損傷作用，并探討其可能的機(jī)制，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 藥品 Gln購自美國Amresco公司；ω－3PUFAs購自南京森海生物油脂有限公司；雙蒸水為實(shí)驗(yàn)室自制。實(shí)驗(yàn)時(shí)分別將7.41gω－3PUFAs粉劑、11.7g Gln粉劑用蒸餾水稀釋至27ml，配制成濃度為1.6g／（kg·d）和3.2g／（kg·d）的營養(yǎng)素灌胃液。

1.2 試劑 超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）及一氧化氮（nitricoxide，NO），試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供。

1.3 動(dòng)物 SPF級(jí)雄性老年SD大鼠由湖北省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)合格證號(hào)：SCXK（鄂）2008－0004。

1.4 方法

1.4.1 實(shí)驗(yàn)分組 將喂養(yǎng)16個(gè)月的老年SD大鼠28只按隨機(jī)數(shù)字表法分成4組。對(duì)照組（6只）、模型組（6只）、ω－3PUFAs干預(yù)組（A 組，8只），Gln干預(yù)組（B組，8只）。各組分別做好標(biāo)記，對(duì)照組和模型組大鼠采用普通飼料自由采食和飲水方式喂養(yǎng)。A、B組大鼠分別采用普通飼料加配制好的ω－3PUFAs、Gln灌胃液連續(xù)喂養(yǎng)20d。動(dòng)物飼養(yǎng)室的溫度為22℃，濕度為50%。在實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)動(dòng)物處置符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.4.2 動(dòng)物模型的制備 28只老年SD大鼠均禁食12h，用10%水合氯醛按300mg／kg腹腔注射麻醉。對(duì)照組不造模，直接頸動(dòng)脈取血后處死。另3組大鼠仰臥于設(shè)計(jì)好的簡(jiǎn)易加壓裝置上，造模參照作者以往文獻(xiàn)［4］的方法和參數(shù)實(shí)施。

1.4.3 組織形態(tài)學(xué)觀察 將切下來的受壓部位皮膚和肌肉組織標(biāo)本用10%甲醛固定后石蠟包埋，切片、H－E染色，用 HMIAS－2000彩色圖文分析系統(tǒng)采集圖像，DP70光學(xué)顯微鏡下觀察其結(jié)構(gòu)及細(xì)胞浸潤等特征改變。

1.4.4 10%肌肉勻漿液的制備 實(shí)驗(yàn)完成后放松2h，頸動(dòng)脈去血，取受壓部位肌肉組織于－70℃保存。凍存的樣品于同一天以生理鹽水配制成10%肌肉勻漿，分裝并保存于－70℃條件下。

1.4.5 SOD活力的測(cè)定 黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子自由基（），后者氧化羥胺形成亞硝酸鹽，在顯示劑下呈紫紅色，當(dāng)樣品中含有SOD時(shí)，則對(duì)有專一性的抑制，顏色變淺，通過公式計(jì)算SOD的活力。具體操作參照SOD試劑盒說明書。

1.4.6 LDH漏出液測(cè)定 LDH能夠在有輔酶的條件下催化乳酸形成丙酮酸和煙酰胺腺嘌呤二核苷二酸，丙酮酸與2、4－二硝基苯肼反應(yīng)生成丙酮酸二硝基苯腙，在堿性溶液中形成棕紅色，通過比色法檢測(cè)LDH漏出液。具體操作參照LDH試劑盒說明書。

1.4.7 NO含量的測(cè)定 NO化學(xué)性質(zhì)活潑，在體內(nèi)代謝很快轉(zhuǎn)為穩(wěn)定的硝酸根離子亞硝酸鹽（）和硝酸鹽（），本法利用硝酸還原酶特異性將還原為，間接檢測(cè)就能有效反映NO的水平。采用硝酸還原酶化學(xué)比色法測(cè)定NO含量，具體操作參照NO試劑盒說明書。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料用xˉ±s表示，采用單因素方差分析，方差齊性采用LSD法，方差不齊采用 Games－Howell法，以P＜0.05或P＜0.01表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4組大鼠皮膚、肌肉組織的形態(tài)學(xué)改變 對(duì)照組大鼠皮膚上皮組織為復(fù)層鱗狀上皮，上皮結(jié)構(gòu)清晰，真皮層內(nèi)附屬器（如毛囊）較多且清晰可見。肌纖維排列緊密，形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)完整。與對(duì)照組相比，模型組大鼠復(fù)層鱗狀上皮較薄，上皮結(jié)構(gòu)自溶、斷裂；肌纖維有斷裂跡象，輕度水腫，間隙增寬，有蠟樣變性，肌組織萎縮、變性，有自溶現(xiàn)象。與模型組相比，A組大鼠復(fù)層鱗狀上皮結(jié)構(gòu)清晰，真皮層內(nèi)附屬器（如毛囊）清晰可見；肌纖維排列尚緊密，橫紋清晰，輕度水腫，肌組織有輕度萎縮現(xiàn)象。B組大鼠復(fù)層鱗狀上皮較模型組上皮層次清晰，真皮層內(nèi)附屬器（如毛囊）清晰可見；肌纖維有輕度斷裂跡象，水腫，間隙增寬，有蠟樣變性，肌組織有輕度萎縮、自溶現(xiàn)象。

2.2 4組大鼠LDH漏出液及10%肌肉勻漿液中SOD活性及NO含量的變化 與對(duì)照組相比，模型組SOD的活性顯著降低（P＜0.01）；與模型組相比，A組SOD的活性顯著增高（P＜0.01）；B組SOD的活性增高（P＜0.05）。與對(duì)照組相比，模型組NO含量顯著增高（P＜0.01）；與模型組相比，A、B組NO含量顯著降低（P＜0.01）。與對(duì)照組相比，模型組LDH漏出液顯著增多（P＜0.01）；與模型組相比，A組LDH漏出液顯著減少（P＜0.01）；B組LDH漏出液減少（P＜0.05）。見表1。

表1 4組大鼠LDH漏出液及10%肌肉勻漿液中SOD活性及NO含量的比較（）

表1 4組大鼠LDH漏出液及10%肌肉勻漿液中SOD活性及NO含量的比較（）

與模型組比較，a：P＜0.05；b：P＜0.01

組別 只數(shù) SOD［zB／（u·μg－1）］ NO含量［bB／（μmol·g－1）］ LDH（%）對(duì)照組 6 55.67±4.85b 2.28±0.19b 0.15±0.08b模型組 6 22.53±1.28 4.14±0.18 0.67±0.14 A組 8 35.88±5.24b 2.22±0.25b 0.40±0.12b B組 8 31.25±4.37a 2.55±0.32b 0.48±0.12a

3 討論

3.1 自由基引發(fā)的組織氧化應(yīng)激損傷是老年大鼠壓瘡發(fā)生的重要原因之一 壓瘡是臨床常見的并發(fā)癥之一。隨著人口老齡化，臥床老年患者逐漸增多，壓瘡發(fā)生率呈上升趨勢(shì)。相關(guān)研究［5］顯示：住院老年患者的壓瘡發(fā)生率為10%～25%，發(fā)生壓瘡的老年患者病死率較未發(fā)生壓瘡者增加4～6倍。以往實(shí)驗(yàn)［4］證明：皮膚持續(xù)受壓導(dǎo)致的氧化應(yīng)激反應(yīng)在壓瘡發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用。氧化應(yīng)激是指機(jī)體或細(xì)胞內(nèi)以氧自由基為代表的氧化性物質(zhì)的產(chǎn)生與消除失衡，導(dǎo)致氧化性物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)蓄積而引發(fā)的氧化反應(yīng)狀態(tài)。對(duì)于老年機(jī)體，生理狀態(tài)下即有體內(nèi)增齡性自由基（如NO）水平的增高和內(nèi)源性抗自由基防御功能（如SOD等）的下降，使得老年機(jī)體承受氧化應(yīng)激的功能貯備在生理狀態(tài)下較中青年明顯降低［6］，這是老年人在缺血缺氧等氧化應(yīng)激狀態(tài)下更易造成氧自由基產(chǎn)生與清除失衡，從而產(chǎn)生組織細(xì)胞過氧化損傷的內(nèi)在基礎(chǔ)。

本研究顯示：與對(duì)照組相比，模型組SOD活性顯著下降，NO含量和LDH漏出液顯著增高（P＜0.01）。這可能是由于皮膚持續(xù)遭受22.47kPa壓力2h以上，造成受壓局部皮膚組織缺血缺氧，丙酮酸經(jīng)LDH催化生成大量乳酸，導(dǎo)致細(xì)胞酸中毒。同時(shí)組織中磷酸肌酸和ATP迅速消耗，ATP依賴的離子泵衰竭，細(xì)胞內(nèi)鈣超載，黃嘌呤氧化酶系統(tǒng)活化，花生四烯酸所引起的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)激活，產(chǎn)生大量的自由基。NO也稱氮氧自由基.，它在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，與SOD有力地競(jìng)爭(zhēng)，而形成強(qiáng)氧化劑過氧亞硝基陰離子，造成細(xì)胞內(nèi)許多重要的蛋白質(zhì)或酶失活，破壞線粒體結(jié)構(gòu)，使DNA鏈斷裂，同時(shí)啟動(dòng)脂質(zhì)過氧化，導(dǎo)致組織損傷［7］。LDH的釋放能間接地反映細(xì)胞的損傷情況。

3.2 ω－3PUFAs和Gln的早期應(yīng)用對(duì)老年大鼠受壓組織氧化應(yīng)激損傷的干預(yù)作用 從研究結(jié)果可見，與模型組相比，A組SOD活性顯著增高，NO含量和LDH漏出液顯著減少（P＜0.01）；B組SOD活性增高、LDH漏出液及NO含量顯著減少（P＜0.01，P＜0.05）。結(jié)合光鏡下觀察結(jié)果，提示我們：ω－3PUFAs和Glu具有抗氧化、清除自由基、增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)SOD活性、抑制NO的釋放等作用。經(jīng)ω－3 PUFAs和Glu早期干預(yù)后，可有效降低氧化應(yīng)激反應(yīng)，減輕組織損傷，尤其以不飽和脂肪酸作用顯著。這是由于ω－3PUFAs能有效上調(diào)抗氧化酶的基因表達(dá)，合成大量抗氧化酶如SOD、過氧化氫酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽（glutataione，GSH）等參與氧自由基的清除，減少活性氧（reactive oxygen species，ROS）的生成。另一方面，由于ω－3PUFAs是一種多不飽和脂肪酸，而氧自由基正是與細(xì)胞膜上的不飽和脂肪酸發(fā)生過氧化，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的損害。因此，ω－3PUFAs也可能作為一種氧自由基清除劑直接與氧自由基發(fā)生反應(yīng)，保護(hù)了細(xì)胞膜及亞細(xì)胞器膜的結(jié)構(gòu)和功能［8］。

而Gln作為體內(nèi)含量最豐富的游離氨基酸，對(duì)細(xì)胞膜的穩(wěn)定性具有廣泛的保護(hù)作用，它主要通過提高GSH合成速度而增加細(xì)胞GSH的儲(chǔ)量，GSH系統(tǒng)是減輕氧化應(yīng)激的主要機(jī)制之一。GSH是生物體內(nèi)最重要的非蛋白巰基化合物，直接或間接參與許多生物功能，保護(hù)細(xì)胞免受毒物的損害，并能提高機(jī)體解毒及增強(qiáng)氧化的能力。Gln作為GSH的前體物，在組織受損或缺血缺氧時(shí)保證GSH正常水平，使組織免受損傷［9］；但其抗氧化損傷作用稍遜于ω－3PUFAs。

4 小結(jié)

皮膚組織持續(xù)遭受2h以上22.47kPa壓力，可誘導(dǎo)老年大鼠受壓組織產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，產(chǎn)生大量氧自由基，導(dǎo)致機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)對(duì)氧自由基的清除能力下降，造成組織損傷。ω－3PUFAs和Gln早期干預(yù)均能提高受壓組織抗氧化能力，尤其是ω－3PUFAs對(duì)增強(qiáng)老年機(jī)體的抗壓力性損傷作用較強(qiáng)。

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