小鼠主動脈平滑肌細胞Robo4膜蛋白的提取＊

倪 偉，劉 濤△，王浩宇，劉小艷，劉麗華，陳桂秀，白亦光，李 ?。?川北醫(yī)學院第二臨床醫(yī)學院南充市中心醫(yī)院心內(nèi)科，四川南充 67000；.川北醫(yī)學院組織工程與干細胞研究所，四川南充 67000；.瀘州醫(yī)學院，四川瀘州 646000）

Roundabout（Robo）蛋白屬于神經(jīng)細胞黏附分子，是神經(jīng)軸突導向分子家族Slit蛋白的單次跨膜受體［1］。Robo蛋白在神經(jīng)系統(tǒng)已被確認具有重要的軸突導向功能，但是，它們在哺乳動物血管系統(tǒng)的作用并不是很明確［2］。研究證實，血管內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞上均有Robo4膜蛋白的表達［3］，Robo4可抑制內(nèi)皮細胞遷移、病理性血管新生和內(nèi)皮高滲透性，但Robo4在平滑肌細胞上的作用卻知之甚少［4］。為此，本文通過體外培養(yǎng)小鼠主動脈平滑肌細胞（MASMCs），優(yōu)化MASMCs膜蛋白提取方法，獲取高純度的Robo4膜蛋白，為后續(xù)實驗研究Robo4膜蛋白在MASMCs上的作用提供重要的技術支持，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料來源

1.1.1 實驗動物 ICR小鼠3～4只，雌雄不限，8周齡以上，購于川北醫(yī)學院實驗動物中心。

1.1.2 主要試劑 DMEM／F12培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶（HYCLONE公司），Ⅰ型膠原酶、二甲基亞砜（Sigma公司），青霉素、鏈霉素（索萊寶公司），兔抗α－SMA多克隆抗體（博奧森公司），羊抗Robo4多克隆抗體（Santa Cruz公司），羊抗GAPDH多克隆抗體（Genscript公司），山羊抗兔FITC標記IgG二抗（中衫金橋公司），HRP標記兔抗山羊IgG（H＋L）（RARTH公司），膜蛋白提取試劑盒、BCA蛋白含量檢測試劑盒、預染彩色蛋白分子量Marker（凱基生物公司），脫脂奶粉（SCIENTIFIC RESEARCH SPECIAL公司 ），高敏發(fā)光ECL試劑盒（Millipore公司）。

1.1.3 主要儀器 CO2培養(yǎng)箱、臺式高速冷凍離心機、－80℃冰箱（Thermo公司），微量移液器（Eppendorf公司），熒光倒置顯微鏡（Nikon公司），倒置生物顯微鏡（上海萬衡精密儀器公司），T－25細胞培養(yǎng)瓶、離心管（Corning公司），垂直電泳槽、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)（BIO－RAD公司）。

1.2 方法

1.2.1 原代細胞培養(yǎng) 頸椎脫臼法處死ICR小鼠，將整個小鼠浸泡于75%乙醇中消毒約5min。在無菌狀態(tài)下，逐層剪開胸腔，分離取出主動脈，放入含有無菌磷酸鹽緩沖液（PBS）的培養(yǎng)皿中。用眼科剪、眼科鑷盡量去除血管外膜的脂肪和纖維組織，再用含抗菌藥物的PBS清洗血管的外表面及血管腔內(nèi)的血凝塊3次，將主動脈放入另一無菌培養(yǎng)皿中，用眼科剪縱向剪開血管，再剪成小段，收集到15mL離心管中。用0.1%的胰蛋白酶和0.1%的Ⅰ型膠原酶消化組織塊（置37℃水?。┘s40～50min。然后進行鏡檢，終止消化時加入含10%胎牛血清的DMEM／F12培養(yǎng)液，200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾去除大的組織。1 200r／min離心5min，倒掉上清液，沉淀用培養(yǎng)基懸浮，接種25cm2培養(yǎng)瓶。最后放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后，觀察細胞是否貼壁，大量貼壁后，更換1次培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，3～4d更換1次培養(yǎng)液，7～9d MVSMCs可鋪滿T－25細胞培養(yǎng)瓶，用0.125%胰蛋白酶消化后進行傳代培養(yǎng)。

1.2.2 膜蛋白的提取 收集不少于1×107細胞，用冷PBS（pH＝7.4）洗滌細胞2次（每次3 000r／min，離心5min）；在細胞標本中加入1mL Lysis Buffer（使用前，每1毫升Lysis Buffer加入1μL蛋白酶抑制劑和1μL 1mmol／L DTT），置玻璃均漿器冰中均質(zhì)30～50次，置于冰上冷卻。均質(zhì)或超聲破碎細胞后鏡檢，細胞破碎率不小于90%；將均漿液轉(zhuǎn)移至冷的離心管中，于4℃，3 000r／min離心10min，棄沉淀；取上清液轉(zhuǎn)移至新冷離心管中，于4℃，14 000r／min離心30min，所得上清液轉(zhuǎn)至新管中，即為胞漿蛋白，分裝冷凍保存；取沉淀，加入1 mL冷的抽提Buffer，渦旋振蕩混勻后，4℃放置10～15min；于4℃，3 000r／min離心5min，取上清液轉(zhuǎn)移至新管，進行下步提??；置于37℃水浴10min；于室溫，13 000r／min離心5min，標本分成上層和下層，最終得到的下層即為膜蛋白提取物。

1.2.3 BCA法測定總膜蛋白含量 按照BCA蛋白含量檢測試劑盒制作標準曲線，稀釋待測標本至合適濃度，使標本稀釋液總體積為20μL，加入BCA工作液200μL，充分混勻，37℃放置30min后，在562nm波長下比色，記錄吸光值。根據(jù)所測標本吸光值，在標準曲線上查得相應蛋白含量，除以稀釋液總體積，乘以標本稀釋倍數(shù)，即為標本試劑濃度（μg／μL）。

1.2.4 Western－Blot檢測 根據(jù) Robo4蛋白相對分子量約150×103，配制8%SDS－GAGE分離膠和5%SDS－PAGE濃縮膠進行灌膠，根據(jù)標本蛋白濃度調(diào)整上樣體積，加入5×SDS上樣至終濃度為1×，上樣總體積不超過20μL，上樣前將標本于沸水中煮5min使蛋白變性。上樣后，開始電泳，預染Marker監(jiān)測蛋白電泳情況，設置GAPDH內(nèi)參。積層膠電壓40V，20min，到達界面后提至120V，電泳90min，電泳結(jié)束后，進行蛋白質(zhì)半干轉(zhuǎn)，20V，20min。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，用5%脫脂奶粉搖床封閉1h。封閉結(jié)束后，加入1∶100稀釋的Robo4抗體，室溫孵育1.5h。用含0.05%吐溫20的磷酸鹽溶液（PBST）洗膜4×10min。加入1∶5 000稀釋的辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育1h，PBST洗膜4次。按說明書進行增強的化學發(fā)光（ECL）顯色。

2 結(jié) 果

2.1 膜蛋白的濃度 根據(jù)蛋白標準品及其對應吸光度A值，計算出標準曲線（圖1），測得標本平均吸光度A值為0.259，由此推算出總膜蛋白濃度為1.47μg／μL。

圖1 BCA法測定蛋白濃度標準曲線

2.2 Western－Blot檢測目的蛋白條帶 在MASMCs上檢測到Robo4膜蛋白的表達，蛋白相對分子質(zhì)量約150×103（圖2）。

圖2 膜蛋白Robo4及GAPDH在MASMCs上的表達

3 討 論

細胞膜蛋白的提取原理是裂解細胞后，先離心分離出質(zhì)膜粗提物，再利用特殊的抽提Buffer，選擇性地分離提取膜蛋白，抽提Buffer含一種特殊的去污劑，在4℃時所有的蛋白質(zhì)均可都溶于抽提Buffer，但在37℃時，抽提Buffer分為水相和去污相；此時親水性蛋白溶于水相，疏水的膜蛋白溶于去污劑相中，根據(jù)該性質(zhì)分離出膜蛋白。產(chǎn)物不僅含細胞膜蛋白，也含胞器質(zhì)膜蛋白。該方法提取膜蛋白成功的關鍵還在于：（1）保證足量的蛋白來源，細胞不少于1×107個，組織標本200～300 mg，且盡量去除脂肪組織和結(jié)締組織等非目的組織。（2）膜蛋白的提取需要在冰上進行，盡量減少蛋白流失，提取蛋白所需的玻璃器具、離心管需預冷，玻璃均漿器冰上均質(zhì)30～50次，通過鏡檢，細胞破碎率要達到90%以上。（3）膜蛋白的分離提取需要在高速低溫的條件下進行，離心機轉(zhuǎn)速13 000r／min以上，且離心機需預冷至4℃。（4）進行膜蛋白的提取最好使用進口透明性較好的微量離心管，以利于下層膜蛋白有機相的觀察，因為上下兩層液體為透明，只在交界處有一折光線，需仔細觀察才可見到，室溫靜置30min至1h亦可見分層。（5）若需提取更高純度的膜蛋白，可在獲得的下層膜蛋白有機相中加入500μL冰冷滅菌水，置于4℃5min，置于37℃10min；室溫下13 000r／min，離心5min，標本分成上層和下層（含膜蛋白），重復該步驟2次，獲得純度更高的膜蛋白。（6）若目的膜蛋白本身表達豐度較低，BCA法測得總膜蛋白濃度小于1μg／μL，可在SDS－PAGE電泳前進行蛋白濃縮：每100微升膜蛋白提取物，加入約300μL溶解Buffer和100μL三氯乙酸（TCA）試劑，混勻置冰上20～30min后，13 000r／min離心15min，盡可能除去上清液；沉淀加入1mL丙酮，室溫靜置10min后，13 000r／min離心15min；棄上清液，沉淀真空旋干或置冰上干燥約10min（敞開離心管蓋），加入適當體積的Loading Buffer，煮沸3～5min，上樣進行電泳。

Robo屬于神經(jīng)細胞黏附分子，是Slit蛋白的單次跨膜受體，包括4種亞型（Robo1～4），Robo1、Robo2和Robo3胞外區(qū)域相同，包含5個免疫球蛋白（Ig）樣結(jié)構(gòu)域和3個Ⅲ型纖維連接蛋白重復序列，胞內(nèi)尾區(qū)含有4個保守區(qū)基序，即CC0、CC1、CC2和CC3。但Robo4胞外區(qū)域只含2個免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域和Ⅲ型纖維連接蛋白重復序列，胞內(nèi)只含CC0、CC2基因序列，其蛋白相對分子質(zhì)量約在150×103［5］。目前的研究認為，Robo4能夠調(diào)控內(nèi)皮細胞的遷移及血管新生，參與血管生長因子的信號轉(zhuǎn)導，在血管穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用［2，6］。最近研究發(fā)現(xiàn)，Robo4也表達在血管平滑肌細胞，但Robo4在血管平滑肌細胞上的作用并未見相關報道［3］。因此，研究Robo4膜蛋白在MASMCs生理和病理狀態(tài)下的表達及意義［7］，對于揭示動脈粥樣硬化、冠狀動脈血管再通術后再狹窄等心血管疾病的發(fā)病機制具有重要意義。作者希望通過建立一種穩(wěn)定、便捷的膜蛋白提取方法，獲得高純度的Robo4膜蛋白，進而為研究Robo4膜蛋白在MASMCs生理和病理狀態(tài)下的表達及意義奠定基礎。該膜蛋白提取方法，所獲得的總膜蛋白經(jīng)BCA法測定濃度為1.47μg／μL，可直接用于SDS－PAGE電泳，經(jīng) Western－Blot法檢測到目的蛋白Robo4的表達。

綜上所述，該膜蛋白提取方法簡單，可靠，快速，獲得的膜蛋白純度較高，可直接用于SDS－PAGE電泳及 Western－Blot等后續(xù)試驗，為研究Robo4膜蛋白在MASMCs上的生物學功能提供了技術保障。

［1］Huminiecki L，Gorn M，Suchting S，et al.Magic roundabout is a new member of the roundabout receptor family that is endothelial speci？c and expressed at sites of active angiogenesis［J］.Genomics，2002，79（4）：547－552.

［2］Jones CA，London NR，Chen H，et al.Robo4stabilizes the vascular network by inhibiting pathologic angiogenesis and endothelial hyperpermeability［J］.Nat Med，2008，14（4）：448－453.

［3］Zhang B，Dietrich UM，Geng JG，et al.Repulsive axonguidance molecule Slit3is a novel angiogenic factor［J］.Blood，2009，114（19）：4300－4309.

［4］Park KW，Morrison CM，Sorensen LK，et al.Robo4is a vascular specific receptor that inhibits endothelial migration［J］.Dev Biof，2003，261（1）：251－267.

［5］Seth P，Lin Y，Hanai J，et al.Magic roundabout，a tumer endothelial marker：expression and signaling［J］.Biochem Biophys Res Commun，2005，332（2）：533－541.

［6］Jones CA，Nishiya N，London NR，et al.Slit2－Robo4signaling promotes vascular stability by blocking Arf6activity［J］.Nat Cell Biol，2009，11（11）：1325－1331.

［7］魏本，郭富強.Periostin與血管支架內(nèi)再狹窄關系的研究進展［J］.川北醫(yī)學院學報，2012，27（4）：313－317.