siRNA抑制α乙酰輔酶A羧化酶基因表達(dá)促進(jìn)前列腺癌干細(xì)胞凋亡＊

楊 波，趙德明，劉 輝，劉 峰，郝繼東，王偉峰，萬建?。?上海市浦東新區(qū)周浦醫(yī)院 038；.上海市第七人民醫(yī)院 038）

目前的研究證實，前列腺癌起源于前列腺癌干細(xì)胞，前列腺癌干細(xì)胞在前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中具有至關(guān)重要的作用［1－3］。聯(lián)合應(yīng)用傳統(tǒng)腫瘤放化療和腫瘤干細(xì)胞靶向治療藥物將可能從根本上治愈腫瘤，因此腫瘤干細(xì)胞將成為人類癌癥治療的新靶標(biāo)［4］。小干擾RNA（siRNA）通過向細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入長度為21～23的核苷酸序列，高度特異性地降解同源mRNA序列，從而有效地阻止相應(yīng)蛋白質(zhì)的表達(dá)［5－6］。本研究將采用這一技術(shù)對前列腺癌干細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，并且以此為基礎(chǔ)來發(fā)現(xiàn)藥物的潛在靶點。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 前列腺癌干細(xì)胞由本實驗室從DU145細(xì)胞株中篩選來，大腸桿菌DH5α由本實驗室保存，PsilencerTM4.1－CMV neo真核表達(dá)載體購自Ambion公司，質(zhì)粒抽提純化試劑盒和T4DNA連接酶購自Takara公司，真核轉(zhuǎn)染試劑lipofectamineTM2000和Trizol購自Invitrogen公司，cDNA合成試劑盒購自MBI公司，G418購自美國Alexis公司，ACC－α二抗購自碧云天生物技術(shù)公司。Hoechst 33342染料購自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 siRNA的合成 使用設(shè)計工具軟件（參見www.ambion.com／techlib／misc／siRNAfinder.html），依據(jù)試劑盒（美國Ambion公司）所提供步驟合成。α乙酰輔酶A羧化酶（ACC－α）siRNA序列為：CAAUGGCAUUGCAGCAGUGdTdT，反義序列：C ACUGCUGC AAUGC－C AUUGdTdT。

1.2.2 特異的siRNA表達(dá)載體的構(gòu)建及序列測定 取PsilencerTM4.1－CMV neo與退火后的雙鏈siRNA模板混合，在T4DNA連接酶的作用下，22℃1h，65℃10min，形成重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒和Ambion公司試劑盒提供的陽性對照質(zhì)粒和陰性對照轉(zhuǎn)染至感受態(tài)細(xì)胞DH5α。感受態(tài)細(xì)菌制備和轉(zhuǎn)化參照文獻(xiàn)。挑取陽性克隆擴(kuò)增培養(yǎng)后，抽提并純化質(zhì)粒，由上海生工生物工程公司測序并鑒定陽性克隆。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 前列腺癌干細(xì)胞用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前1d胰酶消化細(xì)胞并計數(shù)，細(xì)胞鋪板，使其在轉(zhuǎn)染日密度達(dá)到90%。轉(zhuǎn)染步驟按LlipofectamineTM2000說明書進(jìn)行，約6～8 μg的 ACC－αsiRNA 質(zhì)粒、P75 2－siRNA 質(zhì)粒、P75 3－siRNA 質(zhì)粒，分別用15μL LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染至SKBR3細(xì)胞，空白對照以雙蒸水替代質(zhì)粒。

1.2.4 Western blot檢測 ACC－α表達(dá) 分為空白對照組、ACC－α－siRNA轉(zhuǎn)染組，分別于處理24、72、96h后提取蛋白，定量并進(jìn)行SDS－PAGE電泳，120伏電泳90min，然后200mA 2 h電轉(zhuǎn)印于PVDF膜上。用封閉液（1×TBST，5%脫脂奶粉）室溫振搖封閉2h，洗膜。加入免抗人P75一抗（1∶200），室溫孵育2h，洗膜，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG（1∶2 000）室溫孵育1.5h，洗膜。最后用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測雜交信號，在Bio－Rad凝膠儀上成像。

1.2.5 細(xì)胞增殖作用的影響 實驗分兩組：空白對照組，siRNA轉(zhuǎn)染組。按2×104／mL接種于96孔板，細(xì)胞貼壁后更換無血清DMEM培養(yǎng)液，37℃、5%CO2中培養(yǎng)6h，細(xì)胞同步化后用含10%小牛血清的DMEM 培養(yǎng)液100μL（含100 ng／μL NGF）［3］，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72h，然后每孔加20μL MTT繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄培養(yǎng)液，加入二甲亞砜（DMSO）100 μL，振蕩使結(jié)晶完全溶解，30min后用酶標(biāo)儀檢測490nm處的吸光度值［A（490）］，每組平均5個復(fù)孔，重復(fù)3次。

1.2.6 熒光染色觀察 轉(zhuǎn)染96h后在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入Hoechst 33342染料，培養(yǎng)2h后使用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞核的形態(tài)變化。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Western Blot檢測siRNA轉(zhuǎn)染效果 細(xì)胞系轉(zhuǎn)染siRNA后的24、72h和96h后提取細(xì)胞總蛋白經(jīng)Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，ACC－α的表達(dá)在轉(zhuǎn)染后的96h明顯下調(diào)，說明siRNA轉(zhuǎn)染成功抑制了ACC－α的表達(dá)。

圖1 Western Blot檢測結(jié)果

2.2 細(xì)胞增殖檢測 使用MTT染色檢測siRNA干擾ACC－α表達(dá)對細(xì)胞增殖和存活率的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，空白對照組細(xì)胞增殖狀態(tài)良好；在轉(zhuǎn)染后72h時，轉(zhuǎn)染組的活細(xì)胞數(shù)目開始低于對照組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），在轉(zhuǎn)染96h后，轉(zhuǎn)染組的活細(xì)胞數(shù)目開始大幅度降低，與空白對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖2 細(xì)胞增殖MTT檢測結(jié)果

圖3 細(xì)胞凋亡檢測

2.3 熒光染色檢測細(xì)胞凋亡 經(jīng)熒光染色發(fā)現(xiàn)，ACC－αsiRNA轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞存在明顯的核碎裂和染色質(zhì)凝聚，這是細(xì)胞凋亡的典型標(biāo)志，見圖3A。在空白對照組內(nèi)只發(fā)現(xiàn)較低水平的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，見圖3B。

3 討 論

目前在很多腫瘤中都發(fā)現(xiàn)了脂類合成酶表達(dá)的增強(qiáng)。脂肪合成酶（FAS）是一類重要的脂類合成酶在長鏈脂肪酸的生物合成中起重要的催化作用，現(xiàn)已證明其在腫瘤早期的發(fā)生中起重要作用［7－8］。在許多癌癥中，F(xiàn)AS也參與腫瘤后期的發(fā)生和發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)在前列腺癌中，ACC－α也具有同樣的作用，ACC－α是脂肪合成過程中的限制酶，主要催化乙酰輔酶A和CO2反應(yīng)生成丙二酰輔酶A［9］。

眾多研究都發(fā)現(xiàn)，在所有良性成體瘤組織中脂類合成的水平都非常低，然而在惡性腫瘤中脂類合成水平卻非常高。這提示腫瘤細(xì)胞內(nèi)源性脂類物質(zhì)的合成或許可以作為癌癥治療的潛在靶點［10］。迄今為止，所有的相關(guān)研究都圍繞FAS展開，化學(xué)FAS抑制劑和特異性更高的生物學(xué)方法，如FAS siRNA干擾等都具有抑制癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的效果［11］。在本研究中針對脂類合成過程中的ACC－α進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)通過siRNA干擾手段抑制ACC－α的表達(dá)后也對前列腺癌干細(xì)胞起到了較好的抑制作用。研究中還發(fā)現(xiàn)ACC－αsiRNA干擾與目前廣泛報道的FAS siRNA干擾所起到的效果基本類似，這提示ACC－α基因可能會成為前列腺癌治療的新型靶點。

在腫瘤細(xì)胞中抑制脂肪生成和可能會導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡，但其具體機(jī)制有待進(jìn)一步調(diào)查。本研究中抑制脂類合成后癌癥干細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，增生減少可能的解釋如下。惡性腫瘤細(xì)胞的基本特征之一是不受控制的細(xì)胞增殖。細(xì)胞增殖的過程中需要合成大量的細(xì)胞膜，而脂類是合成細(xì)胞膜所需的重要成分。腫瘤細(xì)胞大量合成脂類物質(zhì)或許就是用于增殖。細(xì)胞分裂的G1期是合成細(xì)胞膜的階段，通過siRNA干擾，抑制脂類的合成，使腫瘤細(xì)胞無法形成細(xì)胞膜，擾亂器細(xì)胞周期，從而也就相應(yīng)的抑制了腫瘤細(xì)胞分裂和增殖［12］。此外，細(xì)胞膜上還分布眾多蛋白質(zhì)，比如受體，這些分子在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起關(guān)鍵作用。細(xì)胞膜合成受阻，腫瘤細(xì)胞生存和分裂相關(guān)的生理生化過程將受到抑制［13］。這可能是ACC－αsiRNA抑制腫瘤細(xì)胞分裂增殖的潛在機(jī)制。

［1］De Bono J S，Logothetis C J，Molina A，et al.Abiraterone and increased survival in metastatic prostate cancer［J］.N Engl J Med，2011，364（21）：1995－2005.

［2］Schrder FH，Hugosson J，Roobol MJ，et al.Screening and prostate－cancer mortality in a randomized European study［J］.N Engl J Med，2009，360（13）：1320－1328.

［3］Liu C，Kelnar K，Liu B，et al.The microRNA miR－34ainhibits prostate cancer stem cells and metastasis by directly repressing CD44［J］.Nat Med，2011，17（2）：211－215.

［4］Andriole GL，Crawford ED，Grubb RL，et al.Mortality results from a randomized prostate－cancer screening trial［J］.N Engl J Med，2009，360（13）：1310－1319.

［5］Taylor BS，Schultz N，Hieronymus H，et al.Integrative genomic profiling of human prostate cancer［J］.Cancer cell，2010，18（1）：11－22.

［6］Li C，Penet MF，Wildes F，et al.Nanoplex delivery of siRNA and prodrug enzyme for multimodality image－guided molecular pathway targeted cancer therapy［J］.ACS Nano，2010，4（11）：6707－6716.

［7］Anastasiou D，Cantley LC.Breathless cancer cells get fat on glutamine［J］.Cell Res，2012，22（3）：443－446.

［8］Ma L，Corl BA.Transcriptional regulation of lipid synthesis in bovine mammary epithelial cells by sterol regulatory element binding protein－1［J］.J Dairy Sci，2012，95（7）：3743－3755.

［9］Yen CL，Cheong ML，Grueter C，et al.Deficiency of the intestinal enzyme acyl CoA：monoacylglycerol acyltransferase－2protects mice from metabolic disorders induced by high－fat feeding［J］.Nat Med，2009，15（4）：442－446.

［10］Lang SH，F(xiàn)rame FM，Collins AT.Prostate cancer stemcells［J］.J Pathol，2009，217（2）：299－306.

［11］Wong RH，Sul HS.Insulin signaling in fatty acid and fat synthesis：a transcriptional perspective［J］.Curr Opin Pharmacol，2010，10（6）：684－691.

［12］Escande C，Chini CC，Nin V，et al.Deleted in breast cancer－1regulates SIRT1activity and contributes to high－fat diet－induced liver steatosis in mice［J］.J Clin Invest，2010，120（2）：545－558.

［13］Kuemmerle NB，Rysman E，Lombardo PS，et al.Lipoprotein lipase links dietary fat to solid tumor cell proliferation［J］.Mol Cancer Ther，2011，10（3）：427－436.