桉油精的抗菌抗炎作用研究

張麗佳，薛 銀，張岑容，胡松華

(浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)系，杭州 310058)

奶牛子宮內(nèi)膜炎多數(shù)是由產(chǎn)后子宮感染細(xì)菌引起的一種炎癥反應(yīng)，該病可造成奶牛妊娠推遲，繁殖率下降，甚至不孕［1］。據(jù)報(bào)道，從患病奶牛子宮內(nèi)分離到的細(xì)菌主要有葡萄球菌、鏈球菌、大腸桿菌、棒狀桿菌、糞腸球菌、芽孢桿菌、變形桿菌、克雷伯氏菌、沙門氏桿菌等［1－3］。奶牛子宮內(nèi)膜炎常用在子宮內(nèi)灌注抗菌藥物的方法進(jìn)行治療?？股刂委煹囊粋€(gè)直接后果是造成牛奶中藥物殘留，危害食品衛(wèi)生［4－5］。為了減免抗生素對(duì)牛奶的污染，我國(guó)一些奶牛場(chǎng)采用中草藥或其提取物防治奶牛子宮內(nèi)膜炎，其中以桉油精及其制劑比較常見。桉油精為一種味似樟腦的無色液體，屬單萜類化合物，主要存在于桉葉、迷迭香、番石榴等植物揮發(fā)油中［6］，具有抗菌、抗炎、殺蟲、鎮(zhèn)痛、促進(jìn)透皮吸收等作用［7－9］。桉油精可作為皮膚滲透增強(qiáng)劑、鼻血管收縮劑、鎮(zhèn)咳劑、消毒劑、殺蟲劑、芳香劑等應(yīng)用于醫(yī)藥、工業(yè)、香料行業(yè)中［10－11］。由于奶牛子宮內(nèi)膜炎主要是由細(xì)菌感染引起的一種炎癥反應(yīng)，在治療時(shí)需考慮殺滅病原和促進(jìn)炎癥消散兩個(gè)方面。本文研究了桉油精對(duì)37株子宮內(nèi)膜炎臨床分離菌株的體外抗菌作用及其對(duì)人工致炎癥作用的影響，為臨床上采用桉油精治療奶牛子宮內(nèi)膜炎提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1．1 藥品 桉油精，浙江金大康動(dòng)物保健有限公司產(chǎn)品，批號(hào)20120409;地塞米松磷酸鈉注射液，河南龍?jiān)此帢I(yè)股份有限公司，批號(hào)11083001。

1．2 細(xì)菌 在2010～2011年期間從奶牛子宮內(nèi)膜炎病例分離到的分離株，其中大腸桿菌9株、金黃色葡萄球菌8株、凝固酶陰性葡萄球菌(CNS)6株、停乳鏈球菌4株、無乳鏈球菌4株、乳房鏈球菌4株、沙門氏菌2株。以上細(xì)菌保存于浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院中獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室。

1．3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 ICR小鼠，清潔級(jí)，體重25～30 g，雄性，購(gòu)自上海西普爾－必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1．4 試劑及儀器 MH肉湯、MH瓊脂，杭州微生物試劑有限公司;依文思蘭(Evans blue)，F(xiàn)luka進(jìn)口分裝，上?；瘜W(xué)試劑采購(gòu)供應(yīng)站經(jīng)銷;吐溫－80，浙江省溫州清明化工有限公司;瓊脂粉、二甲苯，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;恒溫培養(yǎng)搖床，QYC－200型，上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;立式壓力蒸汽滅菌器，LS－B50L型，上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司;潔凈工作臺(tái)，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;酶標(biāo)儀，Multiskan，MK3，美國(guó) Thermo 公司;獨(dú)立送風(fēng)飼養(yǎng)籠具，IVC－II型，蘇州市馮氏實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)備有限公司。

2 方法

2．1 抗菌作用研究

2．1．1 細(xì)菌培養(yǎng) 將上述7種細(xì)菌分別接種于MH肉湯中，37℃孵育6～8 h。用生理鹽水校正濃度至0．5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)，約含1×108CFU/mL。

2．1．2 最小抑菌濃度(MIC)測(cè)定 參照文獻(xiàn)［12］，取試管12支，編號(hào)。第1管中加入MH肉湯1．6 mL，2～10管每管加入1 mL，再在第1管加入桉油精0．4 mL(372 mg)混勻，然后吸取1 mL至第2管，混勻后再吸取1 mL至第3管，如此連續(xù)倍比稀釋至第10管;1～10管分別加入菌液10μL，使每管的菌液濃度為1×106CFU/mL;第11號(hào)管加入MH肉湯2 mL和菌液10μL作為陽(yáng)性對(duì)照;第12管加入MH肉湯2 mL和桉油精10μL作為陰性對(duì)照。將接種后的試管置于37℃培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果，以肉眼未見細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度為受試菌的MIC。

2．1．3 最低殺菌濃度(MBC)測(cè)定 參照文獻(xiàn)［13］，從以上未見細(xì)菌生長(zhǎng)的試管中每管取100μL接種于MH瓊脂平板，涂布均勻，37℃培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果，以未見細(xì)菌生長(zhǎng)的最低含藥濃度為MBC。

2．2 抗炎作用研究

2．2．1 小鼠耳腫脹實(shí)驗(yàn) 參照文獻(xiàn)［14］，取雄性ICR小鼠40只，稱重，體重25～30 g，隨機(jī)分成5組:三個(gè)桉油精處理組，用2%吐溫－80稀釋桉油精，得濃度為100、200、400 mg/mL三種溶液，按照100、200、400 mg/kg三種劑量灌胃給藥;陽(yáng)性藥物對(duì)照組腹腔注射給藥(地塞米松，5 mg/kg);空白對(duì)照組2%吐溫－80灌胃給藥(10 mL/kg)。各組動(dòng)物連續(xù)給藥3 d，每天1次。末次給藥0．5 h后，取二甲苯20μL/只涂布于小鼠右耳前后兩面，每面各10μL，左耳不作處理;0．5 h后，沿耳廓剪下雙耳，用9 mm直徑打孔器在兩耳相同部位打孔，稱重，并計(jì)算腫脹度、腫脹抑制率及耳增重百分比。腫脹度=右耳片重－左耳片重，腫脹抑制率=(空白組腫脹度－給藥組腫脹度)/對(duì)照組腫脹度，耳增重百分比=耳腫脹度/左耳重×100%。

2．2．2 小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性實(shí)驗(yàn) 參照文獻(xiàn)［15］，取雄性ICR小鼠24只，稱重，體重25～30 g，隨機(jī)分成4組:桉油精組(200 mg/kg)、桉油精組(400 mg/kg)、陽(yáng)性組(地塞米松:5 mg/kg)以及空白組(2%吐溫－80);給藥方式同2．2．1項(xiàng)。末次給藥45 min后小鼠尾靜脈注射0．5%依文思蘭0．1 mL/10 g，同 時(shí) 立 即 腹 腔 注 射 0．6% 醋 酸0．2 mL/只;30 min后處死并用5 mL生理鹽水沖洗腹腔，收集腹腔液，3500 r/min離心5 min;取上清，測(cè)定OD630。

2．2．3 統(tǒng)計(jì)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)，采用 SPSS(11．5)統(tǒng)計(jì)軟件中 One－Way ANOVA方差分析，比較不同組之間數(shù)據(jù)的差異性，P＜0．05，即判定為差異性顯著。

3 結(jié)果與分析

3．1 桉油精的抗菌作用 桉油精對(duì)37株供試菌的最小抑菌濃度及最低殺菌濃度結(jié)果見表1。桉油精對(duì)7種細(xì)菌均有一定的抗菌作用，其中對(duì)大腸桿菌的抗菌作用最明顯，MIC和 MBC分別為3．9、6．0 mg/mL;對(duì)金黃色葡萄球菌的抗菌作用最弱，MIC 和 MBC 分別為12．4、18．2 mg/mL。綜合比較7種細(xì)菌的抗菌作用，桉油精的抗菌活性由強(qiáng)到弱分別為:大腸桿菌、乳房鏈球菌、沙門氏桿菌、無乳鏈球菌、CNS、停乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌。

表1 桉油精對(duì)奶牛子宮內(nèi)膜炎分離菌的最小抑菌濃度(M IC)和最低殺菌濃度(MBC) mg/m L

3．2 桉油精對(duì)二甲苯所致小鼠耳腫脹的影響 結(jié)果見表2。給藥組小鼠耳腫脹程度顯著低于空白組，桉油精中、高劑量組及地塞米松陽(yáng)性藥物組的腫脹度極顯著低于空白對(duì)照組;二甲苯引起各組小鼠耳腫脹的程度由高到低依次為空白對(duì)照組＞100 mg/kg桉油精組＞200 mg/kg桉油精組＞地塞米松組＞400 mg/kg桉油精組。

表2 桉油精對(duì)二甲苯所致小鼠耳腫脹度、腫脹抑制率及耳增重百分比

3．3 桉油精對(duì)小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性的影響由表3可見，桉油精和地塞米松可抑制依文思蘭染料滲出，與空白組比較，400 mg/kg桉油精組及地塞米松陽(yáng)性藥物組可顯著性抑制染料滲出。

表3 桉油精對(duì)小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性的影響

4 討論

桉油精屬單萜類化合物，主要存在于桉葉、迷迭香、番石榴等植物的揮發(fā)油中，尤以桉葉油含量最多，可達(dá)70%以上。Oyedeji等［7］研究發(fā)現(xiàn)，生長(zhǎng)在尼日利亞的赤桉油、柳桉油、白桉油、剝桉油對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌均有抑制效果，它們?cè)? mg/mL的濃度下都有一定的抑菌活性;Ponce等［6］采用瓊脂擴(kuò)散法研究了藍(lán)桉油的抗菌活性，表明其最小殺菌濃度為0．93～15μL/mL。本文選取臨床上分離的7種奶牛子宮內(nèi)膜炎主要致病菌研究桉油精的抗菌活性，結(jié)果顯示，桉油精對(duì)7種細(xì)菌均有抑制作用，抗菌活性由強(qiáng)到弱分別為:大腸桿菌、乳房鏈球菌、沙門氏桿菌、無乳鏈球菌、CNS、停乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌，平均 MIC為3．9～12．4 mg/mL，平均 MBC 為 6．0 ～18．2 mg/mL，與文獻(xiàn)報(bào)道［6］基本一致。

奶牛子宮內(nèi)膜炎是臨床上常見的奶牛疾病之一，是造成不孕癥的重要原因之一，發(fā)病原因主要是奶牛產(chǎn)后細(xì)菌感染引起。根據(jù)臨床表現(xiàn)不同，可分為急性子宮內(nèi)膜炎和慢性子宮內(nèi)膜炎［16］，但無論是急性還是慢性，其臨床表現(xiàn)主要是炎癥反應(yīng)，因此在研究中藥治療奶牛子宮內(nèi)膜炎藥理作用時(shí)，中藥抗炎作用是一項(xiàng)必不可少的指標(biāo)。白峰等［15］對(duì)大葉桉葉揮發(fā)油的抗炎活性進(jìn)行研究，表明大葉桉葉油對(duì)急慢性炎癥模型表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗炎活性;此外，文獻(xiàn)報(bào)道藍(lán)桉油中主要成分桉油精具有消炎鎮(zhèn)痛作用，可用于治療呼吸道炎癥，如氣管炎、哮喘等［10，17］。本研究設(shè)計(jì)小鼠耳腫脹和腹腔毛細(xì)血管通透性增加兩種炎癥模型以考察桉油精的抗炎活性。結(jié)果顯示，桉油精能夠明顯抑制二甲苯所致小鼠耳腫脹，高劑量(400 mg/kg)給藥時(shí)對(duì)腹腔毛細(xì)血管通透性增加亦有顯著的抑制作用，表明桉油精具有抗炎作用，給藥劑量為400 mg/kg時(shí)效果最佳，其抗炎實(shí)驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步研制治療奶牛子宮內(nèi)膜炎的有效中藥組方提供堅(jiān)實(shí)的理論依據(jù)。

隨著抗生素治療奶牛子宮內(nèi)膜炎方法的廣泛應(yīng)用，牛奶中抗生素殘留及細(xì)菌耐藥性增加等問題也隨之產(chǎn)生。近年來，中藥因其安全、低毒、低殘留而逐漸成為治療奶牛子宮內(nèi)膜炎的新趨勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明桉油精不僅對(duì)奶牛子宮內(nèi)膜炎主要致病菌有抑制作用，而且能夠促進(jìn)炎癥的消散，提示桉油精可用于治療奶牛子宮內(nèi)膜炎，并且有必要進(jìn)一步研究其對(duì)奶牛子宮內(nèi)膜炎的臨床治療效果。

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