脫氧核酶在病毒學(xué)中的研究和應(yīng)用

李 紅，易建中

(上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，上海 201106)

DNA在自然界中主要以雙螺旋形式存在，被認(rèn)為是一種被動分子，僅適合于編碼和攜帶遺傳信息，其結(jié)構(gòu)及化學(xué)特征限制了本身具備其它功能的可能性，然而，隨著體外分子進(jìn)化技術(shù)(systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)的發(fā)展，研究發(fā)現(xiàn)DNA也具有酶的活性，稱為脫氧核酶(DNAzyme)。此項(xiàng)研究成果成為人類核酸研究史上的又一重大飛躍。

1 DNAzyme的體外獲得

DNAzyme分子的體外選擇是根據(jù)SELEX技術(shù)原理建立了以PCR為基礎(chǔ)的體外“催化洗脫”篩選系統(tǒng)［1］。首先合成一個兩端為固定序列，中間由50～100個隨機(jī)核苷酸組成的多核苷酸單鏈DNA庫。以該隨機(jī)單鏈庫為模板，一個RNA－DNA雜合分子為引物，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶催化，將單鏈庫轉(zhuǎn)化成雙鏈庫。其由生物素基團(tuán)結(jié)合于鏈親和素柱上，經(jīng)堿變性，洗脫下不含生物素的一條單鏈DNA，從而得到一個固化相的單鏈隨機(jī)寡核苷酸庫，再用根據(jù)設(shè)計目的選定的pH條件和離子緩沖液洗脫，如有切割反應(yīng)發(fā)生，被切割的分子將被洗脫下來，再經(jīng)PCR放大和親和分離，又重新回到類似于原始庫的隨機(jī)庫，繼續(xù)進(jìn)行第二輪選擇。一般十輪以上就可獲得具有催化活性的分子，然后再對功能分子進(jìn)行克隆測序，并推理出其可能的二級結(jié)構(gòu)。目前，通過這一技術(shù)已獲得兩種具有RNA裂解活性的脫氧核酶被篩選出來，它們是“8～17”和“10～23”(如圖1)，分別是在第8循環(huán)的17克隆和第10循環(huán)的23克隆得到的，命名也由此而來。它們的結(jié)構(gòu)由結(jié)合部位和催化部位組成，結(jié)合部位通過Watson—Crick堿基配對與底物RNA分子結(jié)合，而催化部位在RNA分子的一個未配對的嘌呤和一個已配對的嘧啶堿基處切割RNA?！?0～23”脫氧核酶要求切割位點(diǎn)為嘌呤—嘧啶連接，“8～17”要求切割位點(diǎn)為AG連接。因此，在RNA滅活研究中“10～23”脫氧核酶更靈活，應(yīng)用較多。同時，改變結(jié)合部位的堿基序列可作用于不同底物RNA靶分子。

在實(shí)際應(yīng)用中，不必都經(jīng)過上述篩選過程，研究者往往利用以前篩選獲得的已知高催化活性的DNAzyme(如“10～23”型脫氧核酶)，保留其催化活性中心而對其側(cè)翼識別序列結(jié)合特異性進(jìn)行改造來滿足不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮桶形坏男枰?。設(shè)計好的脫氧核酶可直接在核酸合成儀上大量合成。

圖1 脫氧核酶“8～17”和脫氧核酶“10～23”

2 DNAzyme的特性

隨著越來越多的脫氧核酶被篩選出，對其功能性質(zhì)的研究也隨之深入，發(fā)現(xiàn)脫氧核酶具有以下特性。

2．1 RNA切割作用 脫氧核酶最重要也是目前研究最活躍的一種性質(zhì)，是通過酯化作用而切割RNA分子的功能。DNA這種獨(dú)特的性質(zhì)，使其有可能用于破壞體內(nèi)細(xì)胞和病毒RNA，具有潛在的體內(nèi)治療作用。其發(fā)揮RNA切割作用有以下幾種形式:1．以金屬離子為輔因子，如二價金屬離子(Mg2+，Pb2+，Zn2+，Mn2+，Ca2+，Cd2+)以及三價的稀土元素鑭系金屬離子((鋱、銩、鑭)。特別是Santoro等［2］篩選出的兩個 Mg2+依賴的脫氧核酶“8～17”和“10～23”，能切割所有的 RNA 底物。2．以氨基酸為輔因子，Roch等［3］篩選出一個以L－組氨酸為輔因子的脫氧核酶，只有在L－組氨酸存在條件下才發(fā)揮RNA切割作用，而D－組氨酸不能有效促進(jìn)脫氧核酶的切割功能，說明DNA能夠形成精確的空間結(jié)構(gòu)以識別底物分子和輔因子。另外精氨酸也可作為輔助因子。3．自身具有RNA切割作用，單鏈DNA分子在不需要任何輔助因子的條件下，依靠自身結(jié)構(gòu)的變化而具有切割RNA的作用。Geyer等［4］用二價金屬離子螯合劑EDTA排除二價金屬離子的污染，并進(jìn)行準(zhǔn)確的微量金屬分析，在確認(rèn)沒有二價金屬離子或其它輔助因子存在的條件下，通過“催化洗脫”的方法篩選到一個具有RNA切割作用的脫氧核酶，命名為“G3”。與不加酶的反應(yīng)相比，它提高催化效率108倍。此研究表明DNA分子自身也能提供具有活性的化學(xué)基團(tuán)而發(fā)揮催化效應(yīng)。

2．2 DNA切割作用 脫氧核酶不僅具有RNA切割作用，而且也能切割DNA分子。Carmi等［5］篩選出兩類具有DNA自我切割作用的脫氧核酶，Ⅰ類自我切割脫氧核酶需要Cu2+和維生素C參與，而Ⅱ類脫氧核酶只需要Cu2+。多數(shù)脫氧核酶只能與底物形成二聯(lián)體形式，而Ⅱ類脫氧核酶能與底物形成二聯(lián)體或三聯(lián)體形式，結(jié)合并切割DNA底物，通過改變二聯(lián)體或三聯(lián)體的識別位點(diǎn)，就可以切割不同核苷酸序列的單鏈DNA分子。

2．3 金屬螯合作用和過氧化物酶活性 Li等［6］分離到一個DNA配基，能催化Cu2+和Zn2+螯合到卟啉環(huán)底物上，在隨后的實(shí)驗(yàn)中，他們通過優(yōu)化DNA配基序列和反應(yīng)參數(shù)，提高了DNA配基的催化能力，篩選出一個只有24nt富含鳥嘌呤(G)的脫氧核酶“PS5M”。PS5M形成一個G四聚體結(jié)構(gòu)的催化活性中心，結(jié)合一個扭曲的卟啉分子，使卟啉分子類似于金屬螯合反應(yīng)的中間過渡態(tài)，從而促進(jìn)了金屬的螯合作用。PS5M還能與血紅素結(jié)合，形成的復(fù)合物具有過氧化物酶的活性，能催化氯高鐵血紅素－氫氧化物的分解［7］。

2．4 DNA激酶活性 脫氧核酶還具有類似T4多核苷酸激酶的作用，能把NTP或dNTP上的γ－磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到DNA的5’－OH上。Li等［8］從一個隨機(jī)單鏈DNA庫中篩選出50個不同序列類型的具有自我磷酸化作用的脫氧核酶，都能把NTP或dNTP上的γ－磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到DNA的5’－OH上，實(shí)現(xiàn)DNA分子5’－OH端自我磷酸化。通過優(yōu)化反應(yīng)條件，脫氧核酶還能區(qū)分NTP和dNTP。其中一個優(yōu)化的ATP依賴的脫氧核酶能特異性地選擇ATP，高出CTP、GTP及UTP 4000倍。

2．5 DNA 連接酶活性 Li等［9］從一個隨機(jī)序列DNA庫中篩選出12個具有連接酶活性的脫氧核酶，都能促進(jìn)ATP依賴的自我“加帽”反應(yīng)，即把ATP上的AMP基團(tuán)轉(zhuǎn)移到脫氧核酶自身的5’端磷酸基團(tuán)上，形成5’，5’－磷酸連接，與T4 DNA連接酶活性相同。

2．6 高效性與高特異性 以Kcat/Km表示，脫氧核酶的催化效率在109mol－1·min－1左右，超過任何其它的核酶。不同設(shè)計目的篩選出的DNAzyme其催化效率一般均超過或不低于相同靶標(biāo)的核酶。這是因?yàn)镈NAzyme分子量較小，結(jié)構(gòu)相對簡單，受靶序列二級結(jié)構(gòu)的影響較少，因此對底物的趨進(jìn)性較好，在同等溫度、離子強(qiáng)度等條件下其穩(wěn)定性約為RNA的105倍，且DNA－RNA雜合分子較RNA－RNA雜合分子易于解離，故剪切速率受產(chǎn)物解離過程的影響少。一般而言，其催化效率取決于底物與酶結(jié)合的速率。酶—底物的結(jié)合親和力決定于識別部位的序列長短，最佳序列長度在14～20核苷酸范圍內(nèi)。由于其底物識別臂特異性識別序列的長度可達(dá)18個堿基以上，因此特異性極高。

酶的作用具有高度專一性。這種專一性是酶—底物以 Watson－Crick堿基配對形式，Santoro［11］在脫氧核酶的結(jié)合臂的不同部位引入點(diǎn)突變，研究單堿基錯配對切割活性的影響時發(fā)現(xiàn)，任何部位與形式的單堿基錯配都很大程度損壞了脫氧核酶的切割活性。這表明脫氧核酶在識別靶位點(diǎn)進(jìn)行切割時具有很強(qiáng)的特異性。另外，Wu［12］使用不對稱結(jié)合臂(6/12 bp)，進(jìn)一步提高了切割特異性。

3 DNAzyme在病毒感染性疾病方面應(yīng)用

3．1 HIV病毒的研究 1997年，Santoro等就設(shè)計出了可特異性切割HIV－1病毒mRNA起始密碼區(qū)(gag/pol，env，vpr，tat和 Nef)的 DNAzyme;Banerjea等［13］應(yīng)用“10 ～23”和“8～17”兩種催化模序，建立了鑒別靶標(biāo)RNA切割位點(diǎn)的方法。針對HIV－1病毒基因5’末端順式激活反應(yīng)元件(TAR)篩選出許多切割位點(diǎn)用于抑制病毒的復(fù)制，研究發(fā)現(xiàn)，無論是降解全長還是短片段的靶位點(diǎn)，“8～17”催化模序最為有效。作者認(rèn)為由于HIV－1病毒基因的TAR區(qū)在功能上是十分保守的，因此這種抑制效應(yīng)對一系列分離株都會有效。以“10～23”DNAzyme為模板，Unwalla等［14］設(shè)計了多種針對HIV病毒TAT和TAT－REVRNA的DNAzyme，通過篩選發(fā)現(xiàn)其中Dz－5970可在模擬生理狀態(tài)下高效切割靶RNA，抑制率高達(dá)90%，并且在導(dǎo)入細(xì)胞后仍然保持較高活性。Wengel等［15］發(fā)現(xiàn)了一個鎖核酸/DNA低聚體，可以劑量依賴方式抑制HIV－1病毒Tat蛋白介導(dǎo)的順式激活作用，利用鎖核酸單體修飾后的“10～23”DNAzyme顯著增強(qiáng)切割RNA的活性。鑒于以脂質(zhì)體載體導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞在活性應(yīng)用中的可操作性很差，研究者［16］利用鳥嘌呤殘基可直接與巨噬細(xì)胞表面清道夫受體相互作用的能力，合成了一種在3’末端包含10個G殘基的 DNAzyme 5970，經(jīng)過這種改造的DNAzyme可不需要載體而被巨噬細(xì)胞特異性攝入，并能夠特異性切割 HIV－1 TAT/Revd的編碼RNA，從而有效抑制細(xì)胞內(nèi)HIV－1病毒的基因表達(dá)。該實(shí)驗(yàn)為DNAzyme應(yīng)用于活體治療的實(shí)用性提供了方法學(xué)依據(jù)。

3．2 肝炎病毒的研究 針對乙肝病毒s基因開放讀碼框第157位的AUG和e基因開放讀碼框第1816位AUG設(shè)計的脫氧核酶DrzBS與DrzBC，可在0．1～2．5mmol/L范圍內(nèi)以劑量依賴方式特異性抑制相應(yīng)病毒基因的表達(dá)，最大抑制效率分別可達(dá)94．2%與91．8%［17］。研究發(fā)現(xiàn) DNAzyme 對 HBsAg和HBeAg的抑制效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于反義寡核苷酸，并且其有效濃度至少低于反義寡核苷酸10倍。在高效抑制靶標(biāo)基因的同時沒有發(fā)現(xiàn)明顯的細(xì)胞毒性，作者認(rèn)為是一種有效的抗乙肝病毒治療方法。此外于樂成以“10～23”DNAzyme催化基序設(shè)計的針對丙型肝炎病毒(HCV)5’非編碼區(qū)幾部分C區(qū)(RNA 5’－NCR－C)的 DNAzyme用于治療HCV感染，也觀察到了較好的抑制效果。

3．3 其他病毒的研究 應(yīng)用“10～23”DNAzyme設(shè)計的可特異性切割人呼吸道合胞病毒(respiratory syncytialvirus，RSV)基因組中NS2基因起始位點(diǎn)的脫氧核酶DZ604，可有效抑制RSV病毒基因組RNA的復(fù)制，研究者利用電子顯微鏡在形態(tài)學(xué)水平上(致細(xì)胞病變效應(yīng)和細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變)，觀察到DZ604對RSV的切割抑制效應(yīng)呈劑量依賴的方式，當(dāng)使用5 mmol/L 濃度時，可減少病毒產(chǎn)量的85．56%［18］。

Schubert等［19］以“10 ～23”DNAzyme為模板設(shè)計了特異性切割人鼻病毒14(humanrhinovirus14)5’端非編碼區(qū)的 DNAzyme，通過應(yīng)用3’－3’反相T連接、2’－O－甲基化RNA和鎖核酸、調(diào)整識別臂的臂長等措施對其進(jìn)行優(yōu)化，大大增強(qiáng)了其催化活性和抵抗核酸酶降解的穩(wěn)定性，當(dāng)切割RNA的不同靶點(diǎn)時，只需對其進(jìn)行輕微修飾即可，這為DNAzyme最終應(yīng)用于病毒感染的臨床治療奠定了基礎(chǔ);Takahashi等則以“10～23”DNAzyme為模板，設(shè)計了可特異性切割A(yù)型流感病毒PB2 mRNA翻譯起始區(qū)的PB2Dz，并在COS細(xì)胞中觀察其抑制效果好于反義核酸。此外還有人設(shè)計了切割人乳頭瘤病E6/E7轉(zhuǎn)錄物的DNAzyme等。

3．4 其他領(lǐng)域的應(yīng)用 除了用于病毒學(xué)研究外，脫氧核酶還被用于細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、腫瘤的治療、心血管疾病的基因治療。其研究領(lǐng)域也從最初的細(xì)胞外體系水平到細(xì)胞水平和動物水平，并取得了較為滿意的效果。

4 DNAzyme的優(yōu)缺點(diǎn)

DNAzyme種類很多，既可以針對RNA，也可以切割或修飾DNA。病毒的基因組較簡單，加之病毒生存周期活細(xì)胞依賴的特殊性，使病毒對于核酸損傷特別敏感，同時也使DNAzyme在病毒感染性疾病的治療和診斷中的應(yīng)用具有很好的可操作性和可行性。由于RNA核酶片段較大，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，對靶位點(diǎn)的接近性差，并且合成十分困難，極易降解，使其應(yīng)用受到限制。而DNAzyme的高效性、高特異性、高穩(wěn)定性、短小精悍、易修飾、廉價低毒等特性使其作為一種新型的基因抑制工具，在多種領(lǐng)域的基因治療中得到了廣泛應(yīng)用，許多針對病毒感染性疾病設(shè)計的DNAzyme已經(jīng)進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)評估階段。隨著各種研究數(shù)據(jù)的積累和新型高效傳送載體的開發(fā)，DNAzyme必將在病毒學(xué)研究及病毒性疾病的治療、酶學(xué)研究、生命進(jìn)化研究、分子生物學(xué)、分子遺傳學(xué)和醫(yī)藥生物技術(shù)等領(lǐng)域發(fā)揮更大的作用。

但是DNAzyme的應(yīng)用也存在許多不利因素，如RNA非正確折疊，表達(dá)核酶濃度偏低，亞細(xì)胞空間隔離以及RNA不穩(wěn)定性限制了DNAzyme的潛力發(fā)揮［20－21］。同時脫氧核酶還受很多因素的影響。如:pH值，二價金屬陽離子，緩沖液的種類，溫度，底物的結(jié)構(gòu)，底物結(jié)合區(qū)的長度和堿基結(jié)構(gòu)，化學(xué)修飾和調(diào)節(jié)物。

因此，目前實(shí)驗(yàn)室中用體外分子進(jìn)化技術(shù)設(shè)計合成的脫氧核酶，一般遵循以下基本原則:①剪切位點(diǎn)應(yīng)符合脫氧核酶對靶位的要求［2，11］;②設(shè)計的脫氧核酶不應(yīng)形成自身分子內(nèi)Walson－Crick堿基配對;③注意避開底物RNA中過長分子內(nèi)堿基配對區(qū)和特殊高級結(jié)構(gòu)區(qū)［2，11，22］;④應(yīng)使底物結(jié)合區(qū)的長度和堿基構(gòu)成之間達(dá)到最優(yōu)化［22－23］。對于細(xì)胞和動物水平試驗(yàn)，還必須注意如下問題:①能在生理?xiàng)l件(包括離子濃度和pH等)下發(fā)揮剪切活性;②靶位必須位于RNA的重要功能區(qū)。如果要使所設(shè)計的脫氧核酶對某種病原體的每一變異株均有良好的剪切作用，則有堿基變異的靶序列不應(yīng)入選;③應(yīng)能抵御核酸酶的降解，需要對核酸酶進(jìn)行必要的化學(xué)修飾［24－26］;④應(yīng)被細(xì)胞有效攝取，有良好的亞細(xì)胞定位性，具有良好的藥物代謝動力學(xué)［11］;⑤細(xì)胞毒性或其他毒副作用很少或無，不會誤切宿主正常的 mRNA［11，22－23］。

5 展望

目前對于DNAzyme的結(jié)構(gòu)和功能已有初步了解，但多數(shù)研究仍處于試驗(yàn)階段。科學(xué)家還必須繼續(xù)尋找新的催化效率更高的DNAzyme，進(jìn)一步了解其結(jié)構(gòu)和功能特點(diǎn)。試驗(yàn)證明一種新型的DNAzyme(ASON－Bulge－DNAzyme)在基因沉默表達(dá)中比“10～23”型 DNAzyme更有效更穩(wěn)定［27］。這種新型的DNAzyme具有更高的切割效率和穩(wěn)定性，課題組將進(jìn)一步開展其在PRRS病毒、新城疫病毒及圓環(huán)病毒中的作用。但要使脫氧核酶真正用于人類疾病的防治，仍有很長的路要走。諸如脫氧核酶如何導(dǎo)入細(xì)胞與表達(dá);脫氧核酶引入細(xì)胞后的穩(wěn)定性;脫氧核酶結(jié)構(gòu)的設(shè)計，特別是選擇合適長度的側(cè)翼;底物的選擇以及如何提高脫氧核酶的活性等方面均有待于進(jìn)一步探索和解決。

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